擴(kuò)展性無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)在胎兒染色體異常篩查中的應(yīng)用

呂 虹，吳玥麗，劉 靈，崔世紅，李 瑩，田偉芳，殷貴霞，麻雪利

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心 鄭州 450002

2012年統(tǒng)計(jì)我國(guó)出生缺陷發(fā)生率約為5.6%[1]。遺傳因素是導(dǎo)致出生缺陷的重要因素之一。在遺傳因素中，染色體異常占80%以上[2]，包括染色體非整倍體和拷貝數(shù)變異(copy number variant，CNV)；CNV一般指長(zhǎng)度為1 000 bp以上的基因組大片段缺失和重復(fù)[3]。隨著孕婦外周血中胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn)，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(non-invasive prenatal testing，NIPT)因操作簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)、準(zhǔn)確性高及孕周范圍廣等優(yōu)勢(shì)逐漸成為產(chǎn)前篩查的主流技術(shù)[4]，已廣泛用于胎兒21-三體、18-三體和13-三體的產(chǎn)前檢測(cè)，并可輔助報(bào)告其他染色體異常，如性染色體非整倍體(sex chromosomal aneuploidy，SCA) 和部分CNV[5]。近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，擴(kuò)展性無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(non-invasive prenatal testing plus，NIPT-plus)逐步應(yīng)用于臨床，NIPT-plus增加了測(cè)序深度、擴(kuò)大了檢測(cè)范圍，可報(bào)告部分染色體CNV。本研究對(duì)比了NIPT-plus與NIPT對(duì)胎兒染色體異常的篩查結(jié)果，著重分析NIPT-plus的檢測(cè)效能。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2019年5月至12月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診且進(jìn)行NIPT或NIPT-plus檢測(cè)的9 136例孕婦為研究對(duì)象，根據(jù)選擇項(xiàng)目分為NIPT組6 110例及NIPT-plus組3 026例。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲；單胎妊娠；簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕婦染色體異常；合并惡性腫瘤；4周內(nèi)接受過(guò)免疫治療；1 a內(nèi)接受過(guò)異體輸血、移植手術(shù)或異體細(xì)胞治療。

1.2 NIPT及NIPT-plusNIPT具體步驟如下。①樣本采集和游離DNA提?。菏褂肧treck Cell-Free DNA BCT采血管收集7～10 mL孕婦外周血，18～25 ℃保存，72 h內(nèi)分離血漿。取200～600 μL血漿，使用游離DNA提取試劑盒(磁珠法)提取、純化胎兒游離DNA，并建立標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制系統(tǒng)。②DNA文庫(kù)構(gòu)建及定量：采用無(wú)創(chuàng)胎兒染色體非整倍體(T13/T18/T21)檢測(cè)試劑盒(測(cè)序法)及高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建DNA純化試劑盒(磁珠法)處理上述步驟中提取的DNA，對(duì)其進(jìn)行末端修復(fù)、補(bǔ)平、接頭連接、缺口修復(fù)、純化，構(gòu)建樣本DNA文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建成功后，進(jìn)行熒光定量PCR(qPCR)，分析qPCR數(shù)據(jù)，判斷可信度，如數(shù)據(jù)偏差太大，需重新定量，如數(shù)據(jù)可信，記錄文庫(kù)濃度，文庫(kù)濃度≥10 pmol/L為合格文庫(kù)，否則需重新建庫(kù)。③測(cè)序模板制備：將DNA文庫(kù)稀釋、混合，即為混合文庫(kù)。使用 Ion One Touch 2儀擴(kuò)增混合文庫(kù)，制備測(cè)序模板，使用Ion One Touch ES系統(tǒng)富集模板序列。④測(cè)序及數(shù)據(jù)分析：采用NextSeq CN500高通量測(cè)序儀對(duì)所有樣本進(jìn)行低深度(0.035×)測(cè)序，要求每例樣本的有效數(shù)據(jù)量大于3 000 000，胎兒游離DNA濃度最低標(biāo)準(zhǔn)為4%，所有入組樣本質(zhì)控均合格。將測(cè)序儀檢測(cè)生成的樣本序列與模板序列進(jìn)行比對(duì)，將比對(duì)結(jié)果可視化，分析測(cè)序結(jié)果。在本研究中，Z值介于-3～+3判斷為低風(fēng)險(xiǎn)，<-3或>+3判斷為高風(fēng)險(xiǎn)。⑤質(zhì)控：每次檢測(cè)中應(yīng)至少加入一對(duì)陰陽(yáng)性質(zhì)控品，用于監(jiān)控測(cè)序結(jié)果是否真實(shí)有效。

NIPT-plus采用NextSeq CN500高通量測(cè)序儀對(duì)所有樣本進(jìn)行低深度(0.175×)測(cè)序，要求每例樣本的有效數(shù)據(jù)量大于15 000 000，胎兒游離DNA濃度最低標(biāo)準(zhǔn)為8%，所有入組樣本質(zhì)控均合格。余步驟同上。

檢出率為高風(fēng)險(xiǎn)孕婦人數(shù)/檢測(cè)人數(shù)×100%。

1.3 胎兒細(xì)胞低深度全基因組測(cè)序(copy number variation sequencing，CNV-seq)及染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)NIPT-plus或NIPT檢測(cè)提示高風(fēng)險(xiǎn)孕婦265例，其中248例接受羊膜腔穿刺術(shù)取羊水細(xì)胞行CNV-seq或CMA。CNV-seq參照NEXT seq CN500平臺(tái)測(cè)序試劑盒說(shuō)明操作，采用Burrows-Wheeler算法將測(cè)序序列與hg19基因組進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)生物信息學(xué)分析，判斷樣本是否存在SCA及CNV。CMA應(yīng)用美國(guó)Affymetrix公司單核苷酸多態(tài)性微陣列檢測(cè)平臺(tái)，運(yùn)用3.3版ChAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

數(shù)據(jù)分析：通過(guò)OMIM、UCSC、International Standard Cytogenomic Array(ISCA)、Database of Genome Variants(DGV)、Decipher 等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CNV-seq或CMA檢出的CNV進(jìn)行分類(lèi)和驗(yàn)證，將CNV分為5類(lèi)(致病性、可能致病性、不確定意義性、可能良性和良性[6])。對(duì)于不確定意義性CNV，進(jìn)一步對(duì)親本進(jìn)行CNV-seq或CMA驗(yàn)證[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 26.0處理數(shù)據(jù)。采用χ2檢驗(yàn)比較NIPT組與NIPT-plus組胎兒21-三體、18-三體、13-三體及其他染色體異常檢出率及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 研究人群的基線特征見(jiàn)表1。NIPT組中82.6%的孕婦由于存在高危因素選擇NIPT，NIPT-plus組74.2%的孕婦存在高危因素選擇NIPT-plus(部分具備產(chǎn)前診斷指征的孕婦在已充分告知相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)后，因個(gè)人原因拒絕產(chǎn)前診斷，要求進(jìn)行NIPT或NIPT-plus)；其他入組孕婦因未進(jìn)行唐氏篩查或因自愿等情況要求進(jìn)行NIPT或NIPT-plus。

2.2 兩組染色體異常檢出率的比較兩組21-三體、18-三體、13-三體檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但NIPT-plus組CNV檢出率更高(表2)。

2.3 兩種方法檢測(cè)染色體異常的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值比較兩種方法檢測(cè)21-三體、18-三體、13-三體、SCA及CNV的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。兩種方法檢測(cè)SCA中XO、XXX、XXY、XYY類(lèi)型的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。

表1 兩組孕婦的基本情況 例(%)

續(xù)表1 例(%)

表2 兩組染色體異常檢出率比較 例(%)

表3 兩組驗(yàn)證結(jié)果的比較

表4 兩組不同類(lèi)型SCA驗(yàn)證結(jié)果的比較

3 討論

染色體異常包括染色體非整倍體和CNV。常見(jiàn)的染色體非整倍體有21-三體、18-三體、13-三體和SCA。本研究旨在分析與NIPT相比，NIPT-plus篩查胎兒染色體異常的效能。

本研究中，經(jīng)羊水穿刺產(chǎn)前診斷(CNV-seq或CMA)結(jié)果驗(yàn)證，NIPT與NIPT-plus檢測(cè)所有染色體異常的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NIPT檢測(cè)21-三體、18-三體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為90.24%、82.14%，NIPT-plus為93.33%、83.33%，兩種方法均有較高的診斷效能，且兩種方法的檢測(cè)效能差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NIPT檢測(cè)13-三體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為14.29%，NIPT-plus為0.00%，兩者陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均較低，可能由于該疾病發(fā)病率較低，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較少。

有文獻(xiàn)[8]報(bào)道NIPT檢測(cè)SCA的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為62.9%，本研究結(jié)果為26.23%，與該文獻(xiàn)報(bào)道相差較大，可能是由于45，XO、ChrX+、ChrY+類(lèi)型的SCA占比大，降低了SCA整體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值[9]。此外，45，XO類(lèi)型胎兒可有特異性超聲表現(xiàn)，NIPT及NIPT-plus結(jié)合超聲結(jié)果可提高SCA的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。值得注意的是，NIPT-plus與NIPT比較，45，XO、47，XXX、47，XXY、47，XYY類(lèi)型SCA的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NIPT-plus報(bào)告當(dāng)中未見(jiàn)ChrX+、ChrY+這2種類(lèi)型，NIPT-plus是否能夠排除此類(lèi)異常的假陽(yáng)性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

根據(jù)既往研究結(jié)果，NIPT與NIPT-plus對(duì)CNV的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均較低。Liang等[10]的研究中NIPT-plus對(duì)CNV的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為40.8%，代鵬等[11]的研究中為26.9%，Zhu等[12]的研究中為33.3%；在Gou等[13]的研究中，NIPT對(duì)CNV的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為23.1%，在Schwartz等[14]的研究中為8.9%。本研究結(jié)果顯示NIPT與NIPT-plus對(duì)CNV的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為33.33%和32.26%。胎兒游離DNA片段濃度、CNV大小及測(cè)序覆蓋范圍和深度均會(huì)影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性[15]。胎兒游離 DNA片段濃度越高，越容易檢測(cè)到CNV； 較大片段的CNV更容易被檢測(cè)到，目前已經(jīng)使用了多種算法和目標(biāo)捕獲富集方法來(lái)改進(jìn)對(duì)較小片段CNV的檢測(cè)準(zhǔn)確性[16]；覆蓋率越高，可檢測(cè)到的CNV越小[17]，更深的測(cè)序可以提高準(zhǔn)確性，但會(huì)顯著增加成本[18]。另外母體CNV也會(huì)影響胎兒游離DNA的檢測(cè)結(jié)果，因此測(cè)序深度和生物信息學(xué)分析方法有待進(jìn)一步優(yōu)化。本研究中NIPT-plus和NIPT對(duì)CNV的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但NIPT-plus較NIPT具有更高的檢出率(1.12%vs0.61%)，推測(cè)由于NIPT-plus增加了上機(jī)測(cè)序樣本量，提高了測(cè)序數(shù)據(jù)量和優(yōu)化算法，因此能夠篩查出更多的CNV。

本研究有一定的局限性。NIPT及NIPT-plus檢測(cè)的并非同一群體，這限制了進(jìn)一步的分析。 此外，我們的結(jié)果需要在更大的樣本量中進(jìn)行驗(yàn)證。另外，有研究[19]發(fā)現(xiàn)BGIS00平臺(tái)的有效數(shù)據(jù)量高于DA8600平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)平臺(tái)為NEXT seq CN500平臺(tái)。不同測(cè)序平臺(tái)間質(zhì)控參數(shù)不同，測(cè)序平臺(tái)的差異也可能是研究結(jié)果不完全一致的原因之一。

綜上所述，NIPT-plus與NIPT檢測(cè)胎兒染色體異常的效能相近，其中對(duì)21-三體、18-三體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較高，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。在臨床上需要結(jié)合患者指征、其他檢查結(jié)果、經(jīng)濟(jì)、需求等綜合考慮，選擇合適的檢測(cè)方法。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和成本的降低，未來(lái)NIPT-plus可能為產(chǎn)前篩查提供更高效能的檢測(cè)。