骨肉瘤組織CD74的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系

張雅文， 梁金容， 胡海燕，周 琰，孫元玨，王 瓊

1)安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院 安徽淮南 232001 2)上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 上海 200233

骨肉瘤是最常見的骨原發(fā)惡性腫瘤,起源于間葉組織，發(fā)病率為3/100萬[1-2]，因其起病隱匿且局部侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)，絕大多數(shù)患者確診時(shí)就已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移[3-4]。近年來，腫瘤免疫治療已被列為繼手術(shù)、化療、放療后的第四大治療模式。隨著免疫檢查點(diǎn)抑制劑的發(fā)現(xiàn)，腫瘤的免疫治療取得了重大突破[5]。CD74是一種Ⅱ型跨膜蛋白，在免疫應(yīng)答中以分子伴侶的形式與主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ型蛋白結(jié)合，參與免疫系統(tǒng)的抗原呈遞、B細(xì)胞分化和炎癥信號(hào)傳導(dǎo)等關(guān)鍵過程[6]。CD74在一些惡性腫瘤組織表達(dá)增高，并與預(yù)后相關(guān)。胃癌組織CD74的表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度和臨床分期呈負(fù)相關(guān)[7]。腫瘤分化越差、臨床分期越高的結(jié)腸腺癌組織CD74的陽性表達(dá)率越高，CD74陽性的結(jié)腸腺癌預(yù)后差[8]。關(guān)于膀胱尿路上皮癌組織CD74表達(dá)的研究[9]也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。本研究運(yùn)用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)CD74在不同骨肉瘤病灶組織中的表達(dá)，并且通過對(duì)不同臨床病理特征和預(yù)后的骨肉瘤患者原發(fā)病灶組織中CD74表達(dá)情況進(jìn)行分析，進(jìn)一步為骨肉瘤的診斷和治療提供更多的生物學(xué)參考指標(biāo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣本：收集2017年10月至2019年4月于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科住院的11例骨肉瘤患者(男5例和女6例，年齡11～38歲)手術(shù)切除的骨肉瘤新鮮組織，其中原發(fā)病灶7例、復(fù)發(fā)病灶2例、肺轉(zhuǎn)移病灶2例。組織芯片樣本：收集2018年12月至2020年4月上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科收治的骨肉瘤患者手術(shù)切除的骨肉瘤原發(fā)病灶組織標(biāo)本90例，制備成組織芯片，其中7例組織脫落，共納入83例。83例骨肉瘤患者中男49例，女34例，年齡5～56歲;腫瘤直徑≤5 cm 39例，>5 cm 44例;Enneking分期Ⅰ、Ⅱ期28例，Ⅲ期55例；病理類型普通型為69例，非普通型為14例；腫瘤壞死率≤90% 40例，>90% 43例。所有患者均獲隨訪，患者的生存時(shí)間定義為初次診斷至2020年4月最后1次隨訪或死亡。

1.2 主要試劑與儀器Gexscopetm組織保存液、解離液、紅細(xì)胞裂解液和單細(xì)胞文庫制備系統(tǒng)(南京新格元生物科技有限公司)。Chromium單細(xì)胞基因表達(dá)檢測(cè)試劑盒、Gel Bead及Multiplex試劑盒和ChromiumTM單細(xì)胞分析測(cè)試平臺(tái)(美國10X Genomics公司)，NextEra XT DNA試劑盒(美國Illumina公司)，高靈敏度DNA試劑盒(美國Agilent Technologies公司)。CD74兔單克隆抗體(美國Abcam公司)，山羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)，DAB顯色試劑盒(福州邁新生物科技有限公司)。組織芯片制作機(jī)(武漢塞維爾生物科技公司)。

1.3 骨肉瘤組織單細(xì)胞CD74 mRNA的檢測(cè)

1.3.1單細(xì)胞樣本制備和轉(zhuǎn)錄組文庫建立 取新鮮腫瘤組織保存于Gexscopetm組織保存液中，術(shù)后30 min內(nèi)冰凍處理，用Hank′s平衡鹽溶液清洗3次，切成厚1～2 mm的碎片，加入2 mL Gexscopetm組織解離液，持續(xù)攪拌15 min。40 μm無菌濾網(wǎng)過濾后800×g離心5 min，棄上清，將細(xì)胞顆粒懸浮在1 mL PBS中。加入2 mL Gexscopetm紅細(xì)胞裂解液，25 ℃孵育10 min，500×g離心5 min，棄上清，將細(xì)胞懸浮于PBS中。臺(tái)盼藍(lán)染色，相差顯微鏡下評(píng)價(jià)細(xì)胞活性，細(xì)胞活性大于95%方可繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用單細(xì)胞文庫制備系統(tǒng)將單個(gè)細(xì)胞包裹成乳液滴。使用Gel Bead及Multipex試劑盒構(gòu)建單細(xì)胞RNA測(cè)序文庫。光學(xué)顯微鏡檢查細(xì)胞，并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。在每個(gè)通道中加載細(xì)胞，目標(biāo)輸出為5 000個(gè)細(xì)胞。在ChromiumTM控制器中，細(xì)胞被分割成凝膠珠后進(jìn)行細(xì)胞裂解和RNA反轉(zhuǎn)錄。用NextEra XT DNA試劑盒擴(kuò)增出的cDNA構(gòu)建測(cè)序文庫，并在Agilent生物分析儀上使用高靈敏度DNA試劑盒對(duì)最終文庫進(jìn)行評(píng)估。

1.3.2單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 在Illumina HiSeq X平臺(tái)上，用75個(gè)循環(huán)運(yùn)行試劑盒匯集單個(gè)文庫進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行150 bp的成對(duì)末端閱讀,具體分析方法參照文獻(xiàn)[10]?；贖armony與Louvain算法，將測(cè)序數(shù)據(jù)植入Seurat包的“FindClusters”函數(shù)后，采用t分布隨機(jī)鄰居嵌入(tdistribution-stochastic neighbor embedding,t-SNE)方法在二維圖上顯示識(shí)別出的聚類，閾值設(shè)定為5，顏色越深，表達(dá)程度越高。

1.4 骨肉瘤組織CD74蛋白表達(dá)的檢測(cè)

1.4.1組織芯片制備 根據(jù)HE染色觀察結(jié)果對(duì)待測(cè)石蠟組織標(biāo)本中有代表性的點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記。取97.5 g萊卡石蠟和2.5 g蜂蠟混合，制成長(zhǎng)36 mm、寬26 mm、高17 mm的空白蠟塊；在該蠟塊20 mm×16 mm范圍內(nèi)設(shè)計(jì)8×12點(diǎn)組織陳列，用組織儀打孔制成組織芯片蠟塊，在組織芯片制作機(jī)上用細(xì)針對(duì)受體蠟塊打孔(直徑1 mm)，同樣在供體蠟塊上標(biāo)記的相應(yīng)部位打孔(直徑1 mm)采集組織芯；將組織芯轉(zhuǎn)移到受體模塊的孔中，每個(gè)組織芯之間的間距為0.2 mm。將構(gòu)建好的組織芯片蠟塊放在相宜的塑料盒子內(nèi)，置55 ℃溫箱中約10 min，在蠟塊將要完全熔解前取出，室溫下冷卻，使受體模塊蠟與新插入的小圓柱狀組織融為一體，冰凍切片機(jī)切片。

1.4.2免疫組化檢測(cè)與結(jié)果評(píng)定 將組織芯片脫蠟至水，體積分?jǐn)?shù)3%的H2O2室溫孵育10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，山羊血清封閉，室溫孵育10 min；傾去血清，滴加CD74特異性一抗(1∶100)4 ℃過夜孵育，PBS沖洗3次；滴加山羊抗兔二抗(1∶500)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗；滴加第2代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30 min。PBS沖洗；DAB顯色，自來水充分沖洗；蘇木精復(fù)染；純乙醇脫水1 min，晾干，二甲苯透明10 min，晾干，中性樹膠封片。使用組織切片數(shù)字掃描儀采集圖像，利用賽維爾圖像分析系統(tǒng)自動(dòng)讀取。染色強(qiáng)度：無著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。細(xì)胞陽性表達(dá)率評(píng)分：0～為0分，6%～為1分，26%～為2分，51%～為3分，>75%為4分。綜合評(píng)分為染色強(qiáng)度×細(xì)胞陽性表達(dá)率，0分為陰性，1～分為弱陽性，5～分為陽性，9～12分為強(qiáng)陽性；>6分為CD47蛋白高表達(dá)，≤6分為低表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 24.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析不同性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Enneking分期以及復(fù)發(fā)等臨床病理特征患者骨肉瘤組織CD74蛋白表達(dá)強(qiáng)度的差異；應(yīng)用COX回歸分析骨肉瘤患者預(yù)后的影響因素；生存曲線繪制采用Kaplan-Meier法，生存分析采用Log-rank檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同骨肉瘤組織單細(xì)胞CD74 mRNA的表達(dá)骨肉瘤原發(fā)病灶組織CD74 mRNA的表達(dá)高于肺轉(zhuǎn)移病灶和復(fù)發(fā)病灶，見圖1。

A:原發(fā)病灶;B:肺轉(zhuǎn)移病灶;C:復(fù)發(fā)病灶

2.2 骨肉瘤組織CD74蛋白的表達(dá)83例骨肉瘤組織分為CD74蛋白低表達(dá)37例和高表達(dá)46例(圖2)。兩組骨肉瘤患者臨床病理特征分析見表1，年齡、Enneking分期和有無肺轉(zhuǎn)移與CD74蛋白的表達(dá)有關(guān)。

2.3 生存分析83例患者中23例因死亡而終止隨訪。CD74蛋白高表達(dá)組患者平均生存期為(26.15±1.80)個(gè)月，3 a生存率為50.00%；CD74蛋白低表達(dá)組平均生存期為(33.30±1.23)個(gè)月，3 a生存率為81.08%，CD74蛋白高表達(dá)組患者的生存情況差于低表達(dá)組(χ2=12.480，P<0.001),見圖3。

A：CD74蛋白低表達(dá)組；B：CD74蛋白高表達(dá)組

表1 不同臨床病理特征患者骨肉瘤組織中CD74蛋白表達(dá)的比較 例(%)

圖3 CD74蛋白高表達(dá)組與低表達(dá)組骨肉瘤患者生存曲線

2.4 骨肉瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析COX回歸分析結(jié)果(表2)顯示有肺轉(zhuǎn)移和CD74高表達(dá)是骨肉瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

表2 骨肉瘤患者預(yù)后影響因素的COX回歸分析結(jié)果

3 討論

骨肉瘤是最常見的骨腫瘤，也是人類異質(zhì)性最高的實(shí)體腫瘤之一，這種異質(zhì)性不僅發(fā)生在宏觀層面，還發(fā)生在基因組、轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳水平上。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在探索腫瘤內(nèi)異質(zhì)性以及細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境的相互作用方面顯示出很好的應(yīng)用價(jià)值[11]。作者前期應(yīng)用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)獲得了11例骨肉瘤病灶組織單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[10]，通過t-SNE分析和細(xì)胞的無偏聚類平行識(shí)別出骨肉瘤的11個(gè)主要細(xì)胞簇，CD74在4個(gè)主要細(xì)胞簇中呈高表達(dá)。本研究結(jié)果顯示原發(fā)病灶中的CD74 mRNA表達(dá)程度最高，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用骨肉瘤原發(fā)病灶組織標(biāo)本。

既往研究[8]發(fā)現(xiàn)CD74在結(jié)腸癌中表達(dá)增高，且CD74表達(dá)陽性的患者預(yù)后較差。此外，CD74在其他惡性腫瘤如胃癌[7]、非小細(xì)胞肺癌[12]和膠質(zhì)瘤[13]中都高表達(dá)，且都與不良的預(yù)后相關(guān)。本研究結(jié)果顯示CD74蛋白高表達(dá)組預(yù)后差于低表達(dá)組，提示CD74蛋白的表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)，與以上研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示CD74蛋白高表達(dá)組患者Enneking分期Ⅲ期和有肺轉(zhuǎn)移多見，提示CD74可能促進(jìn)骨肉瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；COX回歸分析結(jié)果顯示有肺轉(zhuǎn)移和CD74蛋白高表達(dá)是骨肉瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，提示CD74可作為預(yù)測(cè)骨肉瘤患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。

綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)CD74可能與骨肉瘤患者不良預(yù)后有關(guān)，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步分子水平上的研究。