穩(wěn)定同位素標(biāo)記-流動(dòng)注射-串聯(lián)質(zhì)譜法定量檢測葡萄糖注射液中5-羥甲基糠醛含量

施 念，徐鑫麗，王 彬，劉玉微，黎文軒，徐 霞，陳 迪

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院物理診斷科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院藥物分析系 鄭州 450001

葡萄糖注射液在臨床中常作為溶劑用于其他藥物的靜脈滴注或靜脈注射。葡萄糖注射液在放置及加熱滅菌過程中往往會(huì)產(chǎn)生5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethyl furfural，HMF)。HMF是一種由己糖在高溫或弱酸性條件下分解產(chǎn)生的醛類化合物，具有遺傳毒性，不僅對人體橫紋肌及內(nèi)臟有損害，而且能與人體蛋白質(zhì)結(jié)合形成蓄積中毒[1]。HMF是含糖溶液質(zhì)量控制的重要物質(zhì)之一，各國藥典均規(guī)定了葡萄糖注射液中HMF的限量。因此，建立準(zhǔn)確可靠的葡萄糖注射液中HMF含量的檢測方法具有重要意義。

紫外-可見分光光度法和高效液相色譜-紫外法是目前最常用的兩種HMF檢測方法[1]，但是這兩種方法主要依靠吸光度和保留時(shí)間進(jìn)行定性定量分析，存在靈敏度低、選擇性差等問題。本研究基于課題組前期研究，采用12C6-3-硝基苯肼和13C6-3-硝基苯肼(12C6/13C6-3-NPH)標(biāo)記葡糖糖注射液中的HMF，建立一種穩(wěn)定同位素標(biāo)記(stable-isotope labelling，SIL)-流動(dòng)注射(flow injection，F(xiàn)I)-串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry，MS/MS)法[2-3]用于葡萄糖注射液中HMF的檢測，為葡萄糖注射液的質(zhì)量控制和安全性評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 SIL原理和檢測流程見圖1。采用3-NPH標(biāo)記HMF的反應(yīng)原理：該反應(yīng)為肼基與醛基的反應(yīng)，通常在弱酸性條件下進(jìn)行[4]。檢測流程：用12C6-3-NPH溶液標(biāo)記葡萄糖注射液中的HMF得到樣品溶液，用13C6-3-NPH溶液標(biāo)記HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液得到內(nèi)標(biāo)溶液，然后將上述樣品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液等比例混合后上樣進(jìn)行FI-MS/MS檢測。

圖1 12C6-3-NPH和13C6-3-NPH標(biāo)記HMF的反應(yīng)原理(上排)和葡萄糖注射液中HMF檢測的SIL-FI-MS/MS法流程(下排)

1.2 儀器和設(shè)備Waters Acquity UPLCTMXevo TQD超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國Waters公司)，配備有二元高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、電噴霧電離源；BSA124S型萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯有限公司)；MSC-100恒溫混勻儀(杭州奧盛儀器有限公司)；MX-S渦旋漩渦點(diǎn)動(dòng)混勻儀，單通道0.5～10.0、10.0～100.0、100.0～1 000.0 μL量程微量可調(diào)移液器(上海大龍實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3 試劑、藥品和溶液HMF對照品(美國Sigma-Aldrich公司，純度99%)；乙腈、甲醇均為色譜純(ThermoFisher 公司)；醋酸為分析純(美國Sigma公司，純度≥99.9%)；12C6-3-NPH·HCl和13C6-3-NPH·HCl(美國Cayman Chemical公司，純度99%)；實(shí)驗(yàn)用水用Milli-Q純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備；葡萄糖注射液為市售藥品。準(zhǔn)確稱量一定量的12C6-3-NPH·HCl或13C6-3-NPH·HCl，用乙腈配成0.5 mg/mL的12C6-3-NPH或13C6-3-NPH溶液。準(zhǔn)確稱量適量HMF標(biāo)準(zhǔn)品，用純水配成1.0 mg/mL的儲(chǔ)備液；將儲(chǔ)備液用純水稀釋得到系列濃度的HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 樣品標(biāo)記SIL的主要影響因素包括酸濃度、12C6-3-NPH濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等，標(biāo)記反應(yīng)條件參照課題組之前的報(bào)道[3]，具體反應(yīng)條件為：在1.5 mL離心管中依次加入50 μL12C6-3-NPH溶液(0.5 mg/mL)，50 μL均質(zhì)后的葡萄糖注射液，93 μL乙腈和7 μL醋酸，置于恒溫混勻儀中30 ℃反應(yīng)10.0 min，得到樣品溶液。同法用50 μL13C6-3-NPH溶液(0.5 mg/mL)、50 μL HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液、93 μL乙腈和7 μL醋酸制備內(nèi)標(biāo)溶液。

1.5 FI-MS/MS分析攜帶液：乙腈-水(體積比90∶10)，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣體積5 μL。采用負(fù)離子采集模式檢測標(biāo)記的HMF，定量和定性確認(rèn)在多反應(yīng)監(jiān)測模式下進(jìn)行。以20 μL/min的流速將待測物直接注入質(zhì)譜中，優(yōu)化包括錐體電壓和碰撞能量在內(nèi)的MRM參數(shù)(表1)。離子源的其他參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓為-3.0 kV(負(fù)離子模式)或3.5 kV(正離子模式)，停留時(shí)間為40 ms，離子源溫度為150 ℃，去溶劑化溫度為400 ℃。單次運(yùn)行時(shí)間為1.0 min。使用MassLynx 4.1軟件(Waters，Milford，MA，美國)控制系統(tǒng)并處理數(shù)據(jù)。

表1 質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)記產(chǎn)物的穩(wěn)定性每隔2 h檢測一次標(biāo)記產(chǎn)物，考察標(biāo)記產(chǎn)物的穩(wěn)定性。結(jié)果(圖2)表明，12C6-3-NPH-HMF和13C6-3-NPH-HMF在12 h之內(nèi)信號(hào)穩(wěn)定性良好。由于一般在12 h內(nèi)可完成3-NPH標(biāo)記產(chǎn)物的分析，因此該標(biāo)記反應(yīng)可以滿足質(zhì)譜檢測對標(biāo)記產(chǎn)物穩(wěn)定性的要求。

圖2 12C6-3-NPH-HMF和13C6-3-NPH-HMF在12 h內(nèi)的信號(hào)穩(wěn)定性

2.2 FI-MS/MS方法學(xué)考察

2.2.1線性方程、檢出限及定量限 配制系列濃度(5、10、20、50、100、200、500、100、2 000、5 000 ng/mL)的HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)12C6-3-NPH標(biāo)記后與內(nèi)標(biāo)溶液混合，進(jìn)行FI-MS/MS分析。以分析物和內(nèi)標(biāo)物的信號(hào)峰面積比值為Y、以濃度為X進(jìn)行線性回歸，結(jié)果：Y=0.016 5X-0.010 2，R2>0.99，線性關(guān)系良好；HMF的檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)分別為1.0 和3.3 ng/mL，可以滿足葡萄糖注射液中HMF定量檢測的需求。

2.2.2精密度和準(zhǔn)確度 分別配制HMF終濃度相當(dāng)于10、20、2 000 ng/mL的HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用SIL-FI-MS/MS方法檢測，每個(gè)濃度水平重復(fù)3次，以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)和加標(biāo)回收率分別考察方法的精密度和準(zhǔn)確度。日內(nèi)平行測定3次，計(jì)算日內(nèi)RSD和加標(biāo)回收率；每日測定1次，連續(xù)3 d，計(jì)算日間RSD和加標(biāo)回收率。結(jié)果見表2，在加標(biāo)濃度范圍內(nèi)，HMF的加標(biāo)回收率在91.6%～109.8%之間，日內(nèi)和日間RSD分別小于6.6%和8.6%。本方法的準(zhǔn)確度和精密度可滿足實(shí)際樣品分析需求。

2.3 實(shí)際樣品分析采用本方法對市售的50 g/L、100 g/L葡萄糖注射液共6個(gè)樣品進(jìn)行分析測定(若樣品中HMF濃度在線性范圍之外，可用純水稀釋后再進(jìn)行分析)。檢測結(jié)果如表3所示。參照2020年版《中國藥典》對葡萄糖注射液中HMF含量的規(guī)定，10 g/L新配制的葡萄糖溶液中HMF的質(zhì)量濃度應(yīng)低于2.36 μg/mL，據(jù)此計(jì)算，市售50或100 g/L葡萄糖注射液中HMF的質(zhì)量濃度應(yīng)≤11.8或23.6 μg/mL。本實(shí)驗(yàn)6個(gè)葡萄糖注射液樣品均符合藥典限量規(guī)定。

表2 精密度測定結(jié)果

表3 6個(gè)市售葡萄糖注射液中HME含量分析結(jié)果(n=3)

3 討論

2020年版《中國藥典(二部)》中關(guān)于以葡萄糖為載體的注射液中HMF含量測定方法為紫外-可見分光光度法，高效液相色譜-紫外法用于HMF含量的測定也有大量報(bào)道[5-7]。但是，上述兩種分析方法靈敏度低、選擇性差。FI-MS/MS是一種在自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)的輔助下，無需色譜分離直接進(jìn)行質(zhì)譜檢測而實(shí)現(xiàn)對樣品快速分析的技術(shù)[8]。其具有較快的分析速度和較高的檢測通量，已經(jīng)成為一種重要的研究工具，被廣泛應(yīng)用于藥物、食品、醫(yī)療診斷等領(lǐng)域。由于質(zhì)譜是一類不穩(wěn)定的檢測器，響應(yīng)信號(hào)易受基質(zhì)影響，因此，要實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量分析，質(zhì)譜分析中常采同位素標(biāo)記的分析物作為內(nèi)標(biāo)對信號(hào)進(jìn)行校正。SIL利用化學(xué)標(biāo)記的方法在含有特定官能團(tuán)的化合物結(jié)構(gòu)上引入同位素標(biāo)簽[9]，從而獲取一對一的同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物，可有效矯正質(zhì)譜信號(hào)波動(dòng)，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定性定量分析。

本研究基于SIL-FI-MS/MS技術(shù)建立了一種葡萄糖注射液中HMF的定量檢測方法：引入SIL技術(shù)，解決了本研究內(nèi)標(biāo)獲取困難的問題，提高了分析的準(zhǔn)確度和精密度；采用FI-MS/MS實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測。標(biāo)記過程可以借助恒溫混勻儀進(jìn)行多個(gè)樣品的批量標(biāo)記；FI-MS/MS檢測具有高通量和自動(dòng)化的優(yōu)勢。本研究結(jié)果顯示，SIL標(biāo)記物穩(wěn)定性能夠滿足后續(xù)檢測的需求；FI-MS/MS方法學(xué)指標(biāo)都較理想。相比文獻(xiàn)報(bào)道方法，本研究所建立的SIL-FI-MS/MS方法在檢測葡萄糖注射液中HMF含量時(shí)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好的優(yōu)勢，具有較強(qiáng)的實(shí)用性。