LncRNA GALNT5 uaRNA在TRAIL誘導(dǎo)的肺癌A549和HCC827細胞耐藥中的作用

栗 敏，白 樺，肖 鵬，馬淑香，王文慧，李晟磊，劉紅濤

1)鄭州人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 鄭州 450003 2)河南省腫瘤醫(yī)院呼吸腫瘤科 鄭州 450004 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 鄭州 450052 4)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 5)鄭州人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心 鄭州 450003

肺癌是全球癌癥死亡的主要病因之一；雖然采用了手術(shù)切除、放療和化療等綜合療法，肺癌患者的5 a生存率仍然很低[1-2]。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor associated apoptosis inducing ligand,TRAIL)是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族成員之一，通過與死亡受體結(jié)合，可以特異性激活癌細胞凋亡通路，但不影響正常細胞凋亡，因此TRAIL可作為抗癌藥物的候選靶點[3-4],但肺癌細胞易對TRAIL誘導(dǎo)的細胞凋亡產(chǎn)生耐藥性[5]。因此，探究肺癌細胞對TRAIL耐藥的機制具有十分重要的意義。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一種長度超過200個核苷酸的RNA分子，本身不編碼蛋白，但可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或翻譯等過程影響靶基因的表達。最新研究[6]表明，某些LncRNA可能參與了癌細胞的耐藥機制。本研究對已知與癌細胞耐藥相關(guān)的LncRNA進行了初步篩選，發(fā)現(xiàn)GALNT5的3’-非翻譯區(qū)域相關(guān)RNA(3’-untranslated region-associated RNA,uaRNA)在TRAIL耐藥的肺癌細胞中高表達，后續(xù)以人非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549和HCC827為研究對象，觀察GALNT5 uaRNA在TRAIL誘導(dǎo)的肺癌細胞耐藥中的作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料A549和HCC827均購自中科院上海細胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素溶液、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液和LipofectamineTM3000試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，TRAIL購自上海優(yōu)寧維公司，RNA提取試劑盒和RNase-free DNase Ⅰ購自日本TaKaRa公司，體外轉(zhuǎn)錄RNA生物素標(biāo)記試劑盒和生物素標(biāo)記RNA收集柱均購自美國Roche公司，鏈霉素抗生物素瓊脂糖珠購自英國GE Healthcare公司，cDNA合成試劑盒購自美國Fermentas公司，Caspase-3、Caspase-8、乙酰化組蛋白H3、組蛋白H3抗體均購自武漢Proteinch公司，組蛋白脫乙酰酶1(histone deacetylase 1，HDAC1)抗體購自美國CST公司，β-actin、HRP-IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SYBR-qPCR試劑盒、細胞RIPA裂解液、BCA試劑盒均購自北京索萊寶公司。過表達載體按照文獻[7]方法制備。siGALNT5 uaRNA、陰性對照siRNA(siNC)和siHDAC1購自上海和元生物技術(shù)有限公司。

1.2 TRAIL耐藥細胞的培養(yǎng)A549或HCC827細胞使用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。使用2.5 g/L胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化，2～3 d傳代1次。取第5代細胞在含有TRAIL的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，TRAIL濃度為半數(shù)抑制濃度的1/160，每2周傳代一次，每次TRAIL濃度增加25%，培養(yǎng)4周后收集細胞為耐藥細胞[8]。

1.3 TRAIL耐藥相關(guān)LncRNA的篩選采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測15種LncRNA(MALAT1、HOTAIR、TUC338、LASTR、PVT1、HOXA-AS2、LINC01123、MSTO2P、HSPC324、NEAT1、NNTAS1、GALNT5 uaRNA、SNHG16、SNHG17、SNHG18)在正常培養(yǎng)的A549細胞和TRAIL耐藥A549細胞中的表達。細胞以1×106個/mL的密度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，離心收集細胞，采用Trizol試劑提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，SYBR-qPCR試劑盒進行PCR擴增。采用2-ΔΔCt法計算目的RNA的相對表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.4 正常培養(yǎng)和TRAIL耐藥A549和HCC827細胞中GALNT5和GALNT5 uaRNA表達水平檢測A549或HCC827細胞(正常培養(yǎng)，不加TRAIL)、TRAIL耐藥A549或HCC827細胞分別以1×106個/mL的密度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后行qRT-PCR分別檢測GALNT5和GALNT5 uaRNA的表達。總體系20 μL，以GAPDH作為內(nèi)參。反應(yīng)體系：2×qPCR預(yù)混液10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 7 μL。擴增程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。GALNT5引物序列：上游5’-TGTGGCCCAT GAACTTTGGT-3’，下游5’-GCCATGACAGGGCAC CTTAT-3’；GALNT5 uaRNA引物序列：上游5’-TG GCATACCAGAAGACACCT-3’，下游5’-GCCAGT GACCTGAGGCATTA-3’。實驗重復(fù)3次。

1.5 A549細胞中GALNT5 uaRNA與HDAC1蛋白相互作用的驗證應(yīng)用RNA Pull down實驗。采用體外轉(zhuǎn)錄RNA生物素標(biāo)記試劑盒對GALNT5 uaRNA正義質(zhì)粒和反義質(zhì)粒分別進行生物素標(biāo)記，用RNase-free DNase Ⅰ處理后純化、收集。將正常培養(yǎng)A549細胞的總蛋白產(chǎn)物與生物素標(biāo)記的質(zhì)粒混合，再加入鏈霉素抗生物素瓊脂糖珠，室溫下旋轉(zhuǎn)孵育。洗脫液沖洗RNA-蛋白-瓊脂糖珠復(fù)合物3次后，用SDS上樣緩沖液煮沸洗脫，120 g/L SDS-PAGE電泳，銀染，切割特異性結(jié)合條帶進行LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定。采用Western blot檢測HDAC1蛋白的表達。

1.6 沉默或過表達GALNT5 uaRNA對TRAIL誘導(dǎo)的A549和HCC827細胞凋亡的影響A549或HCC827細胞分別接種于6孔板，密度為1×106個/mL。實驗設(shè)正常培養(yǎng)基和含TRAIL(終濃度為100 g/L)培養(yǎng)基兩種條件，每種條件各設(shè)4組：空載體組、GALNT5 uaRNA組、siNC組、siGALNT5 uaRNA組。培養(yǎng)24 h后，采用LipofectamineTM3000分別轉(zhuǎn)染空載體、過表達載體、siNC、siGALNT5 uaRNA，24 h后離心收集各組細胞。同1.4方法檢測TRAIL處理細胞中GALNT5、GALNT5 uaRNA相對表達量，驗證轉(zhuǎn)染效果。雙染法檢測凋亡：用含體積分?jǐn)?shù)0.5%牛血清白蛋白的冷PBS沖洗細胞2次，取100 μL(約1×105個)于5 mL培養(yǎng)管，加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI，輕輕渦旋混勻，25 ℃避光孵育15 min，加入400 μL結(jié)合緩沖液，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗重復(fù)3次。

1.7 沉默或過表達GALNT5 uaRNA對TRAIL誘導(dǎo)的A549和HCC827細胞凋亡通路蛋白和乙酰化組蛋白H3表達的影響A549或HCC827細胞分為4組，分別為空載體組、GALNT5 uaRNA組、siNC組和siGALNT5 uaRNA組，轉(zhuǎn)染方法同1.6。轉(zhuǎn)染24 h后加入終濃度為100 g/L的TRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡，24 h后離心收集細胞，冰上裂解1 h，12 000×g離心后收集上清，BCA法測量蛋白濃度。取20 g蛋白行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂奶粉溶液封閉2 h，加Caspase-3、Caspase-8、乙酰化組蛋白H3、組蛋白H3和β-actin一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，加羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)。滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑，曝光，以目的蛋白條帶與β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.8 調(diào)控GALNT5 uaRNA和HDAC1的表達對TRAIL誘導(dǎo)A549細胞凋亡的影響實驗設(shè)6組，分別為空載體組、GALNT5 uaRNA組、siGALNT5 uaRNA組、siHDAC1組、GALNT5 uaRNA+siHDAC1組、siGALNT5 uaRNA+siHDAC1組。正常培養(yǎng)的A549細胞接種于6孔板培養(yǎng)24 h，密度為1×106個/mL。采用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染細胞，24 h后加入終濃度為100 g/L的TRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡。24 h后離心收集細胞，按1.6方法檢測細胞凋亡。實驗重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 24.0處理數(shù)據(jù)。采用兩獨立樣本t檢驗比較正常培養(yǎng)細胞和TRAIL耐藥細胞LncRNA表達水平的差異，采用單因素方差分析和LSD-t檢驗分析沉默或過表達GALNT5 uaRNA對細胞凋亡率和凋亡通路蛋白、乙?；M蛋白H3、組蛋白H3表達的影響，以及調(diào)控GALNT5 uaRNA和HDAC1的表達對TRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡的影響。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 A549細胞TRAIL耐藥相關(guān)LncRNA的篩選15種LncRNA的表達如圖1所示。與正常培養(yǎng)細胞相比，TRAIL耐藥A549細胞中GALNT5 uaRNA表達升高，因此選擇GALNT5 uaRNA開展后續(xù)研究。

**:與正常培養(yǎng)細胞比較，P<0.05

2.2 正常培養(yǎng)和TRAIL耐藥A549和HCC827細胞中GALNT5 uaRNA表達的比較與正常培養(yǎng)細胞(對照組)相比，TRAIL耐藥A549和HCC827細胞(耐藥組)中GALNT5的表達無明顯改變，而GALNT5 uaRNA的表達則升高(表1)。

2.3 A549細胞中GALNT5 uaRNA和HDAC1相互作用的驗證在正常培養(yǎng)A549細胞中，通過RNA Pull down實驗和質(zhì)譜分析鑒定出HDAC1是GALNT5 uaRNA的結(jié)合蛋白，進一步利用Western blot證實了GALNT5 uaRNA與HDAC1的相互作用(圖2)。

表1 正常培養(yǎng)和TRAIL耐藥細胞中GALNT5、GALNT5 uaRNA的表達

1:A549細胞總蛋白(input)；2:GALNT5 uaRNA正義鏈質(zhì)粒；3:GALNT5 uaRNA反義鏈質(zhì)粒

2.4 沉默或過表達GALNT5 uaRNA對TRAIL誘導(dǎo)的A549和HCC827細胞凋亡的影響表2結(jié)果表明，在A549和HCC827細胞上成功過表達或敲低GALNT5 uaRNA。未以TRAIL處理的4組細胞凋亡率無明顯變化。以TRAIL處理的4組中，與空載體組相比，GALNT5 uaRNA組A549和HCC827細胞凋亡率均降低；與siNC組相比，siGALNT5 uaRNA組兩種細胞凋亡率均升高。見表3。

2.5 沉默或過表達GALNT5 uaRNA對TRAIL誘導(dǎo)的A549和HCC827細胞中凋亡通路蛋白、乙?；M蛋白H3表達的影響過表達GALNT5 uaRNA的A549和HCC827細胞中Cleaved Caspase-8和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平均降低，而沉默GALNT5 uaRNA的細胞中CleavedCaspase-8和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平則升高(圖3A、B，表4)。過表達GALNT5 uaRNA的A549和HCC827細胞中乙?；M蛋白H3的表達減低，而沉默GALNT5 uaRNA的細胞中乙?；M蛋白H3的表達則升高(圖3C、D，表5)。

2.6 調(diào)控GALNT5 uaRNA和HDAC1的表達對TRAIL誘導(dǎo)的A549細胞凋亡的影響敲低HDAC1可促進TRAIL誘導(dǎo)的A549細胞凋亡，而HDAC1和GALNT5 uaRNA雙敲低可加重細胞凋亡。另外，敲低HDAC1可恢復(fù)GALNT5 uaRNA過表達所引起的TRAIL耐藥(表6)。

表2 不同組別TRAIL處理A549和HCC827細胞中GALNT5和GALNT5 uaRNA的表達

表3 不同組別A549和HCC827細胞凋亡率比較 %

1～4：分別為空載體組、GALNT5 uaRNA組、siNC組和siGALNT5 uaRNA組；左:A549細胞；右:HCC827細胞

表4 不同組別A549、HCC827細胞中凋亡通路蛋白表達的比較

表5 不同組別A549、HCC827細胞中乙?；M蛋白H3表達的比較

表6 不同組別A549細胞凋亡率的比較 %

3 討論

TRAIL是TNF超家族的典型成員[9]，在腫瘤細胞增殖、分化和凋亡中發(fā)揮重要作用[10]。TRAIL可激活TRAIL受體，與Caspase-8的前體在癌細胞質(zhì)膜內(nèi)表面形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物，進而導(dǎo)致Caspase-8激活[11-13]，激活的Caspase-8可激活下游Caspases，如Caspase-3或通過裂解Bid(Bcl-2家族成員)誘導(dǎo)內(nèi)源性和外源性凋亡通路，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[14]。大多數(shù)癌細胞對TRAIL介導(dǎo)的殺傷具有較好的敏感性，但部分癌細胞如肺癌細胞易對TRAIL耐藥。癌細胞對TRAIL耐藥的機制多種多樣，可發(fā)生在細胞信號級聯(lián)的多個階段[5]。研究[15]表明，持續(xù)暴露于亞毒濃度的TRAIL可誘導(dǎo)NF-κB依賴的miR-21、miR-30c和miR-100上調(diào)，通過沉默Caspase-8、Caspase-3、TNF受體相關(guān)因子和叉頭框O3a進一步增強NF-κB信號通路，誘導(dǎo)獲得性TRAIL耐藥。

LncRNA在腫瘤細胞耐藥中發(fā)揮了重要作用，如LncRNA HOTAIR能夠增強胰腺癌對TRAIL的耐藥性[16]，LncRNA CASC2能夠逆轉(zhuǎn)肝癌細胞對TRAIL的耐藥性，最終提高肝癌的治療效果[17]。GALNT5 uaRNA 位于GALNT5 的3’-UTR，長度為1 905 bp[7]。本研究選用兩種肺癌細胞株A549和HCC827為研究對象，對比GALNT5 uaRNA在正常培養(yǎng)和TRAIL耐藥細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)GALNT5 uaRNA在TRAIL耐藥細胞中的表達顯著升高；沉默GALNT5 uaRNA后細胞凋亡率升高，凋亡通路蛋白Cleaved Caspase-8和Cleaved Caspase-3蛋白的表達水平升高，而過表達GALNT5 uaRNA后細胞凋亡率降低，凋亡通路蛋白的表達水平降低。有研究[18]表明，組蛋白低乙?；艽龠MTRAIL耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達GALNT5 uaRNA并經(jīng)TRAIL處理的A549和HCC827細胞乙?；M蛋白H3蛋白表達水平降低。另外，我們發(fā)現(xiàn)GALNT5 uaRNA能夠和HDAC1相互作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，敲低HDAC1可顯著提高A549細胞對TRAIL的敏感性，促進細胞凋亡；另外，同時敲低GALNT5 uaRNA則進一步提高了細胞凋亡率，而過表達GALNT5 uaRNA則抑制了細胞凋亡，表明GALNT5 uaRNA通過和HDAC1相互作用，共同參與了A549細胞對TRAIL的耐藥過程。已有研究[19-20]表明HDAC1能夠抑制組蛋白乙?；M蛋白乙?；軌虼龠MCaspase-8蛋白的表達[5]，因此，GALNT5 uaRNA可能通過與HDAC1相互作用，進而抑制了組蛋白的乙?；虲aspase-8蛋白的表達。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)GALNT5 uaRNA可能通過和HDAC1相互作用，抑制組蛋白乙?；瑥亩种艭aspase-8蛋白的表達，參與A549和HCC827細胞對TRAIL的耐藥。本研究結(jié)果提示靶向抑制GALNT5 uaRNA可能成為增強TRAIL誘導(dǎo)凋亡能力的新策略。