鴨茅單拷貝核基因RPB1引物設計及篩選

安明珠 朱文露 彭亞萍 韓 博 周 凱

云南農業(yè)大學動物科學技術學院，昆明 650201

鴨茅（Dactylis glomerataL.），又名果園草（Orchardgrass）或雞腳草（Cocksfoot），是禾本科（Poaccae）鴨茅屬（Dactylis）的唯一物種[1]。鴨茅的耐陰性較強、葉產(chǎn)量高[2]，是畜牧業(yè)發(fā)展和改良環(huán)境的重要牧草草種之一，在青貯飼料的制備[3]、草地恢復[4]等方面廣泛應用。

野生鴨茅的種質資源豐富，遺傳多樣性較高，是進行育種及物種保護的重要基因材料來源[2]。目前，國內外對于鴨茅的起源及進化的研究集中于地理學數(shù)據(jù)和形態(tài)學標記[5]、分子標記[6]以及葉綠體和ITS 序列[7]數(shù)據(jù)之上。隨著鴨茅生存環(huán)境的變化，形態(tài)學分類和分子標記技術受外界影響較大，對物種分類會造成一定的誤差[8]。單拷貝核基因屬于直系同源基因，繼承雙親的遺傳信息，沒有核苷酸偏向性和內部重復，攜帶大量的信息位點，進化速率中等，更適合用于對物種進行系統(tǒng)發(fā)育分析[9]。武潑潑等[10]基于單拷貝核基因DMC1 基因序列對中國短柄草種族進行分類研究，為其系統(tǒng)進化提供可靠證據(jù)。胡曉艷等[11]利用單拷貝核基因對酸棗的遺傳多樣性進行研究，證明單拷貝適用于物種遺傳多樣性應用，這為后續(xù)的酸棗種質資源保護及利用奠定了基礎。劉舒宇等[12]通過設計并篩選出楊柳科單拷貝核基因DSH引物，并對4 個屬的代表物種進行系統(tǒng)發(fā)育分析，為進一步深入了解楊柳科植物的遺傳多樣性提供數(shù)據(jù)支撐。Joly 等[13]開發(fā)了單拷貝核基因GAPDH作為核基因標記，重構了北美薔薇屬植物的多倍體起源。李爽等[14]基于單拷貝核基因PAL檢測到貴州金花茶具有低水平的遺傳多樣性和中等水平的遺傳分化，從而為最大程度保護貴州金花茶的遺傳多樣性奠定數(shù)據(jù)基礎。RPB1基因屬于單拷貝核基因，是RNA 聚合酶Ⅱ上最重要的大亞基，其拷貝數(shù)較低，廣泛應用于群體遺傳進化研究中，以揭示居群遺傳多樣性和遺傳分化[14-16]。

目前，在鴨茅的系統(tǒng)發(fā)育分析上，單拷貝核基因RPB1還未曾應用，因此本研究通過設計鴨茅單拷貝核基因RPB1的引物，并對篩選后的引物退火溫度進行優(yōu)化，從而用于后續(xù)進一步探索鴨茅不同亞種間的親緣關系，此結果對鴨茅的起源進化和資源保護具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗材料為種植于云南省曲靖市馬龍區(qū)馬鳴市鴨茅圃的鴨茅亞種D.glomeratasubsp.woronowii和D.glomerata subsp.hispanica。在2020 年7 月收集鴨茅新鮮葉片，使用變色硅膠進行干燥保存，用于植物DNA 提取。

1.2 試驗方法

1）植物DNA 的提取。使用北京天根生物科技有限公司提供的Ezup 柱式植物基因DNA 提取試劑盒提取鴨茅葉片DNA，具體方法參考其說明書。稱取30～50 mg 鴨茅葉片，加入液氮快速研磨至粉末，然后通過試劑盒中的藥品進行溶解并提取，最終得到鴨茅DNA。提取后的DNA 樣用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，檢測合格的樣品放置-20 ℃冰箱中進行保存。

2）引物設計。鴨茅RPB1 基因序列由四川農業(yè)大學張新全教授提供，利用Beacon Designer v.8 和Primer Blast 軟件設計鴨茅單拷貝核基因RPB1 引物序列，記錄其引物名稱、堿基序列、引物長度、退火溫度（表1）。將引物送到公司進行合成干粉，并按照要求將濃度稀釋為100 μmol/L。

表1 引物序列

3）PCR 擴增及瓊脂糖凝膠檢測。通過PCR 擴增技術，將退火溫度設置為12 個梯度，具體溫度以記錄的溫度為標線，上下調整10 ℃作為引物退火溫度區(qū)間。PCR 反應體系（50 μL）：2.5μL DNA 樣（10 ng/μL），2.5 μL 上游引物（10 μmol/L），2.5 μL下游引物（10 μmol/L），25 μL Mix Taq PCR Master（1x），用去離子水補足至50 μL。擴增程序為：94 ℃3 min，94 ℃30 s，Tm 30 s，72 ℃1 min，35 X，72 ℃8 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下進行觀察，根據(jù)條帶的清晰程度以及特異性與否，篩選出最適的引物對及退火溫度，用于后續(xù)試驗。

4）測序。將符合要求的PCR 產(chǎn)物送到上海生工生物有限公司進行測序，然后通過chromas 查看峰圖，并在NCBI 數(shù)據(jù)庫中Blast 進行序列比對。

2 結果與分析

2.1 引物及退火溫度的篩選

通過對10 對引物進行PCR 擴增，并設置12 個退火溫度梯度，發(fā)現(xiàn)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后發(fā)現(xiàn)RPB1（3F，3R）、RPB1（4F，4R）2 對引物能夠擴增出明亮的1 條帶且在58 ℃時最為明顯，說明這2 對引物設計合理，特異性較強。

2.2 引物序列峰圖分析

將得到的引物序列通過chromas 軟件后，每個序列得到1 個峰圖。通過峰重疊情況來判斷此引物序列是否能用于鴨茅系統(tǒng)發(fā)育分析。正常峰的峰圖序列連續(xù)，且無重疊峰和無poly 結構，峰圖結構明顯清晰，為合適的引物序列；重疊峰的峰圖中有大量的重疊，說明在測序反應之后產(chǎn)生了不止1 條序列，則說明該引物設計不合格；poly 結構峰圖為出現(xiàn)連續(xù)單個堿基重復，會造成重疊峰，甚至造成反應中斷，測序失敗，不是合適的引物序列。如圖2 所示，所選引物的峰圖均為正常峰，無重疊峰。

2.3 測序及驗證

在NCBI 庫中輸入獲得的序列信息進行Blast 比對（圖3），2 對引物擴增的產(chǎn)物均為目的基因片段。

3 討 論

鴨茅物種及亞種間明確的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關系，是鴨茅種質資源更好地保存和利用的依據(jù)，是現(xiàn)代牧草品種選育和改良的必要理論基礎之一。不同倍性的鴨茅亞種同域共生，形態(tài)上較為相似，隨著環(huán)境的變化，鴨茅的形態(tài)也隨之發(fā)生改變，這導致對鴨茅進行傳統(tǒng)形態(tài)學分類存在一定的誤差[17-19]。分子標記技術從一定程度上避免了這種誤差，但由于分子標記技術的費用較貴且耗時長，所以在物種的遺傳多樣性研究中未普遍應用[20-21]，基于葉綠體基因建立系統(tǒng)發(fā)育樹的分析報道較少[22]，而對于從核基因方面進行鴨茅系統(tǒng)發(fā)育分析未見相關報道。

鴨茅的分類階元較低，需要一些進化速率較快且變異位點較多的基因來研究鴨茅的系統(tǒng)發(fā)育問題。核基因的進化速率快于葉綠體基因和線粒體基因，基因序列在進化過程存在豐富的變異位點，為研究種間或屬間系統(tǒng)發(fā)育分析提供可用的變異信息[23]。RPB1 屬于單拷貝核基因，廣泛應用于群體遺傳進化研究中[14-16]。燕薇等[24]利用RPB1 基因對藍葉蟲微孢子蟲進行系統(tǒng)發(fā)育分析研究，進一步證實了親緣關系分類。李銀雙等[25]利用RPB1 對羊肚菌進行系統(tǒng)發(fā)育分析，為其準確分類提供了科學分類。

本試驗通過設計單拷貝核基因RPB1 引物，優(yōu)化其退火溫度，這為后續(xù)研究鴨茅不同亞種之間的起源和親緣關系奠定基礎。設計的10 對鴨茅單拷貝核基因RPB1 引物，篩選出2 對擴增產(chǎn)物條帶單一且擴增效果較好的引物，通過溫度梯度PCR 篩選了退火溫度為58 ℃，通過測序和Blast 比對驗證了其對應的目的基因。