色度分析鑒別熊膽粉

雷苛露， 袁明昊， 周 濤， 李建鋼， 曾大富， 郭 力*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137；2.成都晶博生物科技有限責(zé)任公司，四川 成都 611731)

熊膽粉具有清熱解毒、平肝明目、抗炎鎮(zhèn)痛等功效[1]。由于熊膽粉市場價格昂貴，藥材市場上常以豬、牛、羊等膽粉摻假。目前，僅衛(wèi)生部藥品標準規(guī)定采用薄層色譜法對熊膽粉中熊去氧膽酸進行定性鑒別，但其靈敏度較低、局限性強[2]。因此，尋找一種簡便、準確、高效的熊膽鑒別方法具有十分重要的應(yīng)用價值。

顏色是中藥質(zhì)量評價的指標之一，中藥的顏色往往與內(nèi)在成分含量密切相關(guān)[3]。課題組前期已對青黛有效成分含量與其色度值進行相關(guān)性研究[4]，發(fā)現(xiàn)藥材的顏色是由內(nèi)在成分尤其是呈色成分的外在體現(xiàn)。熊膽粉含有膽汁酸類成分以及膽色素、膽固醇、蛋白質(zhì)等。熊膽粉中仍有一些作用機制尚不明確，與其中非膽汁酸類成分有關(guān)[5]。膽色素是動物膽汁呈色的關(guān)鍵物質(zhì)[6]，其中膽紅素能提高機體耐缺氧能力[7]，抗炎[8-9]、改善組織損傷[10]等，是膽色素中主要成分及活性物質(zhì)[11]。熊膽歷來以外觀顏色定品質(zhì)[12]，但尚無從顏色特征角度評價熊膽質(zhì)量及真?zhèn)蔚膱蟮?，傳統(tǒng)上對顏色的判斷主要依靠口傳相授及經(jīng)驗傳承，主觀性強。對性狀指標數(shù)據(jù)化，與指標成分建立相關(guān)性的“性狀量化-指標成分”[13]是新興的質(zhì)量評價體系，為傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別的傳承創(chuàng)新和質(zhì)量評價體系的建立提供了新的突破[14]。

因此，選擇膽紅素含量作為顏色相關(guān)性評價指標，將傳統(tǒng)感官鑒別與色度分析技術(shù)相結(jié)合，客觀量化熊膽及不同動物膽粉的色度值，探討顏色與熊膽粉中膽紅素成分的相關(guān)性；同時結(jié)合多元統(tǒng)計分析鑒別熊膽粉與其他動物膽粉，為熊膽粉的快速鑒別及質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

熊膽粉樣品由成都晶博生物科技有限責(zé)任公司提供，批號180905～200406，共計23批。其他動物膽粉共11批由實驗室自制，包括豬膽粉、牛膽粉、羊膽粉、雞膽粉、鵝膽粉、鴨膽粉。膽紅素對照品(成都普思生物科技有限公司，批號PS200729-02，純度大于98%)；三氯甲烷(成都科龍化工試劑廠)。

CM-5型分光測色儀(日本柯尼卡美能達公司)；紫外-可見分光光度計(日本島津UV2550)；UP-Ⅱ-10T型優(yōu)普系列超純水機(成都超純科技有限公司)；BP121S型電子分析天平(德國賽多利斯公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 膽紅素含量測定 采用紫外分光光度法，在453 nm波長處測定熊膽粉及其他膽粉中膽紅素的含量[15]。

2.2 對照品溶液的制備 取膽紅素對照品約2 mg，精密稱定，置100 mL棕色量瓶中，加三氯甲烷80 mL，超聲，加三氯甲烷至刻度，搖勻，制成每1 mL含20 μg的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 分別稱取23批熊膽粉與11批其他動物膽粉約30 mg，精密稱定，置于10 mL棕色量瓶，分別加入8 mL三氯甲烷，超聲20 min，加三氯甲烷至刻度，搖勻，4 000 r/min離心10 min，分取三氯甲烷層，即得。

2.4 方法學(xué)考察 精密量取膽紅素對照品1、2、3、4、5、6 mL分別置于10 mL量瓶中，回歸方程為Y=0.093 4X-0.013 9，R2=0.999 3，線性范圍20～120 μg，線性關(guān)系良好；精密量取膽紅素對照品溶液連續(xù)測定6次，RSD為0.07%，表明該儀器精密度良好；取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h測定，RSD為1.25%，表明膽紅素在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；取同一供試品溶液6份，RSD為1.74%，表明該方法重復(fù)性良好；膽紅素平均加樣回收率為103.59%，RSD為1.89%。

2.5 含量測定 取熊膽粉及其他膽粉樣品，在“2.3”項下制備供試品溶液，分別在453 nm處測定吸光度并計算含量，重復(fù)3次。

2.6 動物膽粉末的顏色測定 將儀器調(diào)試到反射測量，測定光源D65，照明系統(tǒng)排除鏡面反射，測定試場10°視角，測試區(qū)域30 mm，起止波長360～740 nm[4]。對儀器進行白板與黑板校正后，取熊膽粉及其他動物膽粉末約2 g于測色皿中，均勻平鋪于測色皿底部，測定粉末顏色，每組樣品重復(fù)測定3次，取平均值。結(jié)果見表1。

2.7 動物膽粉提取液顏色測定 將測量類型調(diào)試為液體測量，三氯甲烷作為空白溶劑，測定膽紅素后的樣品溶液于比色皿中，重復(fù)測定3次，取平均值。結(jié)果見表1。

表1 熊膽粉及其他動物膽粉色度值及含量(n=3)

2.8 方法學(xué)考察 取同一樣品適量制備粉末與提取液，分別測定色度值，測定6次，RSD均<2%，表明儀器精密度良好；取同一樣品6份，分別制備粉末與提取液，測定6次，RSD均<3%，該方法重復(fù)性較好；取同一樣品適量制備粉末與提取液，分別在0、1、2、3、4、5 h后測定，RSD均<3%，表明供試品在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 相關(guān)性分析 以L*、a*、b*值依次為自變量，膽紅素含量為因變量，用SPSS 22.0對熊膽及其他動物膽粉末、提取液的色度值與膽紅素含量進行Pearson 相關(guān)性分析。結(jié)果見表2。膽紅素含量與提取液的L*、a*、b*值的相關(guān)性分別為-0.947、-0.590、0.960，且P<0.01，表明膽紅素含量與L*、a*、b*值顯著性相關(guān)。L*代表明亮度，L*越大，明亮度越大，反之越小；a*代表紅綠色度，a*>0為紅色方向，反之為綠色方向；b*代表黃藍色度，b*>0為黃色方向，反之為藍色方向。膽紅素含量與L*、a*值呈負相關(guān)，與b*值呈正相關(guān)，表明膽類提取液明亮度越低、綠色程度和黃色程度越高，膽紅素含量越高。而膽紅素含量與粉末顏色值相關(guān)性較弱，且不完全具有顯著性。

表2 色度值與膽紅素含量相關(guān)性分析(n=34)

2.10 膽紅素含量與提取液色度值回歸分析 采用SPSS 22.0對其進行回歸分析，建立回歸方程，以此預(yù)測膽類提取液中膽紅素含量。結(jié)果顯示R=0.974，R2=0.950，表明膽紅素含量受色度值影響的程度為95.0%；方差分析結(jié)果顯示P<0.001，該回歸方程模型有統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3 回歸系數(shù)及方程

2.11 熊膽粉鑒別分析

2.11.1 熊膽粉及動物膽粉提取液色度值的三維空間分布 采用Origin 2021建立提取液色度值的三維空間分布圖，探討基于色度值鑒別熊膽真?zhèn)蔚目赡苄?。如圖2所示，熊膽粉有明顯的區(qū)域聚集性，主要分布于空間的左側(cè)，而其它動物膽粉主要分布于空間右側(cè)，空間分布表明基于色度值鑒別熊膽真?zhèn)尉哂锌尚行浴?/p>

2.11.2 真?zhèn)闻袆e模型的建立 采用SPSS 22.0對膽類提取液L*、a*、b*值共線性診斷，三者的VIF分別為6.897、1.822和8.147，VIF均<10，容差值介于0和1之間，說明三者不具有多重共線性，可進行判別分析。通過Fisher系數(shù)建立非標準化典型判別模型，得到兩個判別函數(shù)，Y1=0.224L*-3.882a*+0.101b*-21.398(特征值9.369，Wilks的Lambda =0.078，P<0.001)；Y2=-0.107L*-0.567a*-0.043b*-8.829(特征值0.206，Wilks的Lambda=0.809，P=0.042)，判別函數(shù)有統(tǒng)計學(xué)意義。如圖3所示，在此判別函數(shù)下，熊膽粉與其它動物膽粉可被區(qū)分開，且其他動物膽粉中家禽類及哺乳類膽粉能較好區(qū)分。采用此判別函數(shù)對提取液色度值進行檢驗，如表4所示，判別函數(shù)對熊膽、家禽類膽粉與其他哺乳類膽粉的正判率均為100%，交叉驗證的正判率為91.2%，僅為其他動物膽中類別的誤判，表明判別函數(shù)可正確鑒別熊膽真?zhèn)巍?/p>

表4 分類結(jié)果

2.11.3 主成分分析與聚類分析 采用SIMCA-P14.1對提取液色度值和膽紅素含量值進行PCA主成分分析與聚類分析。由圖4可知，PCA分析顯示兩個主成分總貢獻率為97.4%，該模型建立良好，表明用提取液色度值和膽紅素含量值能很好的鑒別熊膽粉及其它動物膽粉。如圖5所示，聚類分析可將所有批次的熊膽粉與其他膽粉聚類區(qū)分，表明色度分析法對熊膽粉具有較好的鑒別效果。

3 討論

傳統(tǒng)的感官評價是中藥傳承延續(xù)幾千年的質(zhì)量評價手段之一，而顏色是感官評價必不可少的觀察指標[16]。分光測色儀通過模擬人眼視覺系統(tǒng)和積分光學(xué)系統(tǒng)，把光譜數(shù)據(jù)的三刺激值進行積分[17]，利用國際照明委員會色度空間系統(tǒng)對顏色進行客觀表達[4]，以L*、a*、b*值作為中藥顏色的量度，更加快速、直觀、全面地為中藥的鑒定與質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。本研究利用該技術(shù)區(qū)分熊膽粉及其他常見的動物膽粉，為中藥的鑒別分析提供一種新思路。

膽色素是動物膽汁中色素的總稱，使各種膽類呈現(xiàn)不同的顏色，膽紅素是膽色素中的主要活性物質(zhì)，探討膽紅素含量與熊膽粉顏色的關(guān)系具有鑒別意義。研究表明，用分光光度法測定豬膽汁中膽紅素的含量方法可靠，在453 nm處其他雜質(zhì)幾乎無吸收，特異性強[18]。熊膽根據(jù)外觀顏色分為金膽、墨膽、菜花膽和油膽，傳統(tǒng)認為金膽品質(zhì)更好[11]，根據(jù)結(jié)果，黃色程度越高的熊膽粉膽紅素含量越高。

綜上所述，基于色度分析原理,熊膽粉的顏色值與膽紅素含量具有顯著相關(guān)性，可以用于熊膽粉及其他動物膽粉的鑒別，為熊膽粉的鑒別、質(zhì)量控制及市場監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)。