黃精多糖對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活性及炎癥因子TNF-α、IL-6、iNOS表達(dá)的影響

杜 青， 陳 林*， 賀 煒， 勞 嘉， 蔡 媛， 黃建華

(1.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南 長沙 410013；2.綠之韻生物工程集團(tuán)有限公司，湖南 長沙 410329)

黃精Polygonatumsibiricum是多年生黃精屬百合科的一種藥食同源草本植物，主要以根莖入藥，具有補(bǔ)中益氣、滋潤心肺、強(qiáng)壯筋骨等功效[1]。黃精中含有多種化學(xué)成分，包括多糖、黃酮、皂苷、生物堿、氨基酸、木質(zhì)素、揮發(fā)油等，其中，黃精多糖是其主要活性成分之一，含量約占14%[2]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃精多糖具有降血糖、抗氧化、肝保護(hù)、抗腫瘤、提升免疫等多種作用[3]。無論是藥物還是保健食品研究領(lǐng)域，多糖的免疫調(diào)節(jié)作用一直是研究的熱點(diǎn)之一，常被用作免疫調(diào)節(jié)劑。目前，關(guān)于黃精多糖對(duì)機(jī)體的免疫提升作用及機(jī)制至今尚未明確。巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞，具有抗原呈遞性，無論是在先天免疫應(yīng)答還是在適用性免疫中都起著非常重要的作用，是機(jī)體抵御外界抗原入侵的第一道防線[4]。巨噬細(xì)胞表面存在多種受體，可與植物多糖結(jié)合后活化，并分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和一氧化氮(NO)等細(xì)胞因子，以抵御外來刺激，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[5]。本研究主要針對(duì)黃精多糖對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7的免疫活性調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，為黃精資源的高效利用及黃精多糖的產(chǎn)品開發(fā)和利用提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 RAW264.7細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥物 黃精購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，準(zhǔn)確稱取黃精樣品粉末(過3號(hào)篩)，先用石油醚除去色素等雜質(zhì)后烘干，按料液比1∶15加入純水，于90 ℃水浴鍋中加熱回流1 h，提取2次，離心得到提取液，合并2次提取液，加入無水乙醇至終體積分?jǐn)?shù)80%，搖勻后靜置12 h，離心收集沉淀，經(jīng)冷凍干燥得到黃精粗多糖，進(jìn)一步采用sevage法去除蛋白，得到純化的多糖。經(jīng)過分析測(cè)定，總糖含量為82.3%。

1.3 試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、FBS(美國Gibco公司，批號(hào)8119002、42F0266K)；LPS(美國Sigma公司，批號(hào)C59M4173V)，CCK8、TNF-α一抗、IL-6一抗、iNOS一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)A10801411T、A101286265、A107319225、A101177400)；NO、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20190816)；FITC標(biāo)記二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)SA00003-2)。

1.4 儀器 XDS-3型倒置顯微鏡(廣州粵顯光學(xué)儀器有限責(zé)任公司)；HERACe型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Enspire型多功能酶標(biāo)儀、OPERETTA型高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)(美國Perkinelmer公司)；LSM800型激光共聚焦顯微鏡(德國蔡司公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW 264.7細(xì)胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基(其中含10%FBS和1%雙抗)于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d換液1次，并以1∶3比例傳代培養(yǎng)。

2.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力 待RAW 264.7細(xì)胞生長至70%～80%融合程度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度至5×103/mL，接種于96孔板中，培養(yǎng)18 h，設(shè)置31.25、62.5、125、250、500 μg/mL 5個(gè)質(zhì)量濃度黃精多糖組，另設(shè)正常組，每組4個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞充分貼壁后，棄掉孔內(nèi)液體，正常組加入200 μL培養(yǎng)液，給藥組加入200 μL含相應(yīng)質(zhì)量濃度藥物的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄掉孔內(nèi)液體，每孔加入完全培養(yǎng)基180 μL和CCK8溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測(cè)各孔光密度(OD)值，以正常組為對(duì)照，計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)存活率。

2.3 細(xì)胞分組、給藥及形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)期生長的RAW 264.7細(xì)胞，以5×103/mL密度接種于96孔板中，培養(yǎng)18 h，隨機(jī)分成正常組，LPS(1.0 μg/mL)組，黃精多糖250、62.5 μg/mL組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，正常組加入200 μL培養(yǎng)液，其余各組加入200 μL含相應(yīng)質(zhì)量濃度藥物的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察各組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

2.4 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、NO水平 收集各組細(xì)胞上清液，3 000 r/min離心15 min，取上清液，參照TNF-α、IL-6、NO ELISA試劑盒說明書，檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、NO水平。

2.5 HAC法檢測(cè)TNF-α、IL-6、iNOS蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定45 min，0.25% Triton-100處理15 min，5% BSA封閉15 min，分別加入兔抗小鼠iNOS、TNF-α、IL-6一抗稀釋液(1∶100～1∶200)，4 ℃避光孵育過夜，加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔稀釋液(1∶400)，37 ℃避光孵育30 min，加入DAPI稀釋液，室溫避光孵育15 min，最后使用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)進(jìn)行熒光檢測(cè)并拍照，并以細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度值反映各蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.6 RT-qPCR法檢測(cè)TNF-α、IL-6、iNOSmRNA表達(dá) 將RAW 264.7細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，靜置培養(yǎng)18～24 h，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組、給藥，培養(yǎng)24 h，棄掉孔內(nèi)液體，PBS洗2次，加入TRIzol試劑4 ℃處理60 min，然后轉(zhuǎn)移至EP管中進(jìn)行總RNA的抽提，并以總mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCT法，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的基因(iNOS、TNF-α、IL-6)相對(duì)表達(dá)。引物序列見表1[6]。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 黃精多糖對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響 與正常組比較，隨著黃精多糖質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞活性先升高后降低，在62.5 μg/mL時(shí)最高(P<0.01)，而500 μg/mL黃精多糖則抑制細(xì)胞生長(P<0.01)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇質(zhì)量濃度31.25～200 μg/mL范圍內(nèi)的劑量進(jìn)行后續(xù)研究，見圖1。

注：與正常組比較，**P<0.01。

3.2 黃精多糖對(duì)RAW 264.7細(xì)胞形態(tài)的影響 與正常組比較，黃精多糖62.5、250 μg/mL組和LPS組巨噬細(xì)胞由類圓形變成激活態(tài)的不規(guī)則梭形或多角形，見圖2。

圖2 RAW 264.7細(xì)胞形態(tài)的變化(×100)

3.3 黃精多糖對(duì)RAW 264.7細(xì)胞TNF-α、IL-6、NO分泌的影響 與正常組比較，黃精多糖62.5、250 μg/mL組和LPS組細(xì)胞上清液中NO、TNF-α、IL-6水平均升高(P<0.05，P<0.01)，其中尤以250 μg/mL黃精多糖及LPS組作用最為顯著，提示黃精多糖能不同程度刺激免疫炎癥因子釋放，見圖3。

3.4 黃精多糖對(duì)RAW 264.7細(xì)胞TNF-α、IL-6、iNOS蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，黃精多糖62.5、250 μg/mL組和LPS組細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-6、iNOS蛋白熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01)，其中尤以黃精多糖250 μg/mL組增加最為明顯，提示黃精多糖能刺激炎癥因子相關(guān)蛋白TNF-α、IL-6、iNOS表達(dá)增加，見圖4。

3.5 黃精多糖對(duì)RAW 264.7細(xì)胞TNF-α、IL-6、iNOSmRNA表達(dá)的影響 與正常組比較，黃精多糖上調(diào)了細(xì)胞中TNF-α、IL-6、iNOSmRNA表達(dá)(P<0.05)，與LPS作用相當(dāng)，且呈劑量依賴性，在黃精多糖質(zhì)量濃度為250 μg/mL時(shí)表達(dá)較高，提示黃精多糖刺激在轉(zhuǎn)錄水平上增強(qiáng)了促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、iNOS的表達(dá)，見圖5。

注：TNF-α和IL-6水平單位為ng/L，NO水平單位為μmol/L。與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

免疫調(diào)節(jié)對(duì)于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著關(guān)鍵作用，RAW264.7細(xì)胞是小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系，是常用的研究免疫功能的細(xì)胞模型之一?；罨木奘杉?xì)胞不僅能夠吞噬病原體，還能分泌調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的細(xì)胞信使。多糖因其分子量、單糖組成和糖苷鍵等結(jié)構(gòu)可與巨噬細(xì)胞上的甘露醇受體結(jié)合并導(dǎo)致免疫活化，釋放細(xì)胞因子等免疫活性物質(zhì)，從而提高機(jī)體的免疫功能[7]。具有免疫調(diào)節(jié)活性的多糖可促使RAW264.7細(xì)胞形態(tài)改變，主要表現(xiàn)為體積增大、偽足生長等[8]。細(xì)胞的形態(tài)可以直接反應(yīng)出細(xì)胞的活力，本研究通過CCK8法篩選得黃精多糖促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞活力增強(qiáng)的最佳劑量，并采用顯微鏡觀察細(xì)胞表現(xiàn)為活化狀態(tài)，表明黃精多糖具有潛在的免疫調(diào)節(jié)活性。

細(xì)胞因子主要由免疫細(xì)胞等分泌的一類小分子可溶性多肽蛋白，并通過與相應(yīng)受體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化，調(diào)控免疫應(yīng)答。有研究發(fā)現(xiàn)，黃精多糖處理可以增強(qiáng)小鼠的免疫功能，提高RAW264.7巨噬細(xì)胞的吞噬作用，并增加IL-2、TNF-α、IL-8和IL-10等細(xì)胞因子水平[9]。TNF-α是巨噬細(xì)胞活化時(shí)釋放的重要細(xì)胞因子，能發(fā)揮促進(jìn)T細(xì)胞增殖和激活樹突狀細(xì)胞成熟的作用，在宿主防御系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，并可以誘導(dǎo)許多其他免疫調(diào)節(jié)[10]，還可以促進(jìn)感染部位的趨化因子及白細(xì)胞介素的分泌[11]，誘導(dǎo)白細(xì)胞在感染部位的聚集并起到對(duì)被感染部位病原微生物進(jìn)行清除的作用。IL-6是白細(xì)胞介素家族中的一員，可促進(jìn)細(xì)胞的吞噬和粘附作用，是巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫功能的重要生物活性細(xì)胞因子，TNF-α的大量分泌可刺激IL-6的產(chǎn)生，調(diào)控T細(xì)胞的活化、B細(xì)胞的分化及淋巴細(xì)胞的分型，發(fā)揮非特異性免疫調(diào)節(jié)作用[12-13]。TNF-α還可與iNOS基因上游啟動(dòng)子反應(yīng)元件結(jié)合，引發(fā)iNOS基因的轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量NO[14]。NO是一種簡單但卻不穩(wěn)定的自由基，由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸產(chǎn)生，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的效應(yīng)器，可參與殺死病原微生物[15]。NO分泌量的增加，可促使巨噬細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)，機(jī)體抗病能力隨之增強(qiáng)[16]。這些生物活性因子進(jìn)一步作用于淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，在天然免疫防御和獲得性免疫應(yīng)答中起著不可忽視的作用。

黃精作為補(bǔ)益類中藥在提高機(jī)體免疫功能方面發(fā)揮著獨(dú)特的療效，本研究發(fā)現(xiàn)，黃精多糖可以增加RAW264.7巨噬細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6和NO分泌與表達(dá)，并且與LPS陽性對(duì)照相近，且黃精多糖在質(zhì)量濃度為250 μg/mL時(shí)不會(huì)影響正常巨噬細(xì)胞的活力，并表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性，能夠激活RAW264.7巨噬細(xì)胞，并誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而增加機(jī)體非特異性免疫。黃精多糖有望成為免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)劑，其開發(fā)和應(yīng)用對(duì)于預(yù)防及提高機(jī)體免疫力低下具有重要意義。