綠原酸對H2O2致小鼠RGC-5細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

姜 逸， 胡 娜， 袁 琳， 林 敏， 鐘霄毓， 陸 敏， 陸 雄

(上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心，上海 201204)

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病患者最常見的并發(fā)癥[1]，也是可預(yù)防性視力障礙和失明的主要原因之一[2]，其病變成因復(fù)雜，微血管病變長期被認(rèn)為是其核心病理機(jī)制[3]。研究證實(shí)，糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)變性是糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期事件，早在微血管病變之前神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層就已經(jīng)出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)性與功能性的改變，如視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)減少、神經(jīng)纖維層變薄和電生理異常等[4-5]。此外糖尿病患者機(jī)體持續(xù)的高血糖狀態(tài)會導(dǎo)致細(xì)胞代謝失衡，引發(fā)葡萄糖氧化過多、ROS產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡等。視網(wǎng)膜神經(jīng)組織需要較多能量以維持神經(jīng)細(xì)胞膜極化，而這種特性使得其極易受到氧化應(yīng)激的影響[6-7]。在生理或病理條件下自噬能促進(jìn)受損的細(xì)胞器更新，分解代謝產(chǎn)物重回物質(zhì)循環(huán)，引導(dǎo)細(xì)胞作出雙向適應(yīng)性應(yīng)答[8-9]。因此，越來越多有關(guān)糖尿病視網(wǎng)膜病變致病機(jī)理和藥物有效性的研究靶向自噬在氧化應(yīng)激條件下的作用。

綠原酸是金銀花、杜仲、野菊花等多種中藥的活性成分，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其通過降低ROS水平，上調(diào)抗氧化酶活性進(jìn)而降低或阻止氧化應(yīng)激的發(fā)生，具有較強(qiáng)的抗氧化作用[10-11]，但其是否具有保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)采用H2O2體外間接模擬高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激環(huán)境，探究綠原酸對小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系RGC-5的作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞 小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC-5，上海富衡生物科技有限公司，貨號FH0369)。

1.2 試劑與藥物 綠原酸(HPLC≥98%，大連美倫生物技術(shù)有限公司，貨號J0120AS)。3% H2O2、MTT(美國Sigma公司，貨號88597、MKCD4805)；DMEM高糖培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)級PBS(大連美侖生物技術(shù)有限公司，貨號MB4372、MA0016)；0.25%Trypsin-EDTA、胎牛血清(美國Gibco公司，貨號1869505、2045677RP)；DMSO[生工生物工程(上海)股份有限公司，貨號BB02BA001]；LC3抗體、p62抗體、β-actin抗體、辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的IgG抗體(美國CST公司，貨號12741、23214、5125、7074)；RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、ECL特超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號P0013C、P0012AC、P0015L、P0018AS)；BCA蛋白定量試劑盒(上海雅酶生物科技有限公司，貨號ZJ101)；0.45 μm PVDF膜(德國Merck公司，貨號R7SA6402D)；蛋白Marker(美國Thermo Fisher公司，批號00451236)。鋨酸(美國Alfa Aesar公司，批號10108150);十二烷基琥珀酸酐(DDSA，美國Polysciences公司，批號82714)；環(huán)氧樹脂E-51(618#)(昆山綠循電子材料有限公司)；DMP-30(美國SPI公司，批號1101122)；鄰苯二甲酸二丁酯、丙酮、乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20160526、20200811、20210728)；醋酸鈾(美國Electron Microscopy Sciences公司，批號180926-01)。

1.3 儀器 NU-5510E培養(yǎng)箱(美國Nuair公司)；Alpha Clean1300超凈臺[力康精密科技(上海)有限公司]；Spectra Max190酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；Tecnai G2 spirit透射電子顯微鏡(美國FEI 公司)；705902超薄切片機(jī)(德國Leica公司)；AI 600超靈敏多功能成像儀(美國GE公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、造模及給藥 RGC-5細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，日常培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2、相對濕度95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞分為正常組、模型組和綠原酸組，細(xì)胞接種后培養(yǎng)24 h；正常組更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，模型組和綠原酸組更換含H2O2(終濃度為30 μmol/L)培養(yǎng)基造模，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；吸棄原培養(yǎng)基，正常組和模型組更換正常培養(yǎng)基，綠原酸組加入相應(yīng)濃度含綠原酸(6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，結(jié)束后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測。

2.2 MTT法檢測RGC-5細(xì)胞存活率 將RGC-5細(xì)胞以5×104/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL，每組設(shè)6個復(fù)孔，按“2.1”項下方法造模、給藥，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min使甲瓚結(jié)晶物完全溶解，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處檢測各孔光密度(OD)值，并計算細(xì)胞存活率。

2.3 免疫熒光染色觀察RGC-5細(xì)胞數(shù) RGC-5細(xì)胞按“2.2”項下方法培養(yǎng)、造模、給藥后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，加入免疫染色強(qiáng)力通透液，室溫孵育5 min，PBS清洗后用Hochest(10 μg/mL)染核10 min，PBS清洗后于1 h內(nèi)進(jìn)行觀察，并記錄細(xì)胞數(shù)。

2.4 透射電子顯微鏡觀察RGC-5細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) RGC-5細(xì)胞按“2.1”項下方法造模、給藥后，收集細(xì)胞沉淀至綠豆大小，2.5%戊二醛4 ℃前固定2 h，2.5%鋨酸4 ℃后固定2 h，梯度乙醇、丙酮脫水后轉(zhuǎn)移樣本至環(huán)氧樹脂包埋劑中固化烘干，隨后超薄切片80 nm，檸檬酸鉛染色后使用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

2.5 Western blot檢測RGC-5細(xì)胞LC3、p62蛋白表達(dá) 將RGC-5細(xì)胞以8×104/mL的密度接種于6孔板，每孔2 mL，每組設(shè)3個復(fù)孔，按“2.1”項下方法造模、給藥后，收集細(xì)胞沉淀，加入RIPA裂解液，冰浴超聲裂解提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。采用SDS-PAGE凝膠電泳分離等量蛋白樣本，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含有5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，加入一抗在4 ℃條件下孵育過夜，TBST清洗后，加入二抗在室溫下孵育1 h，滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑，成像儀成像后用Image J軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參計算目的蛋白相對表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 綠原酸對H2O2損傷的RGC-5細(xì)胞活性的影響 如表1所示，綠原酸濃度大于25 μmol/L時，可劑量依賴性地增加RGC-5細(xì)胞存活率(P<0.05，P<0.01)，在100 μmol/L時達(dá)到峰值，隨后趨于平穩(wěn)。本實(shí)驗(yàn)采用30 μmol/L H2O2進(jìn)行造模，如表2所示，與正常組比較，模型組細(xì)胞存活率降低(P<0.01)；與模型組比較，綠原酸組細(xì)胞存活率增加，其趨勢與不造模時相同，且100 μmol/L時作用最為明顯(P<0.01)。

表1 綠原酸對RGC-5細(xì)胞存活率的影響

表2 綠原酸對H2O2損傷的RGC-5細(xì)胞存活率的影響

3.2 綠原酸對H2O2損傷的RGC-5細(xì)胞數(shù)的影響 如圖1、表3所示，與正常組比較，模型組細(xì)胞數(shù)減少(P<0.01)；與模型組比較，綠原酸100 μmol/L組細(xì)胞數(shù)增加(P<0.01)。

表3 綠原酸對H2O2損傷的RGC-5細(xì)胞數(shù)的影響

圖1 RGC-5細(xì)胞Hochest染色(明場與熒光合成偽彩圖，×200)

注：M為線粒體，ER為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。實(shí)心箭頭指示腫脹的線粒體，空心箭頭指示腫脹的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，方框內(nèi)為自噬泡。

3.3 綠原酸對RGC-5細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 如圖2所示，正常組RGC-5細(xì)胞器豐富，偶見自噬小泡，未見其他異常；模型組RGC-5細(xì)胞呈現(xiàn)大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體腫脹，未見自噬泡形成；綠原酸給藥組自噬泡形成，且數(shù)量增多。

3.4 綠原酸對RGC-5細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖3所示，與正常組比較，模型組細(xì)胞中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比值降低(P<0.01)，p62蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，綠原酸各濃度組LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比值呈劑量依賴性升高(P<0.01)，p62蛋白表達(dá)呈劑量依賴性降低(P<0.01)。

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

4 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生是一個復(fù)雜的病理過程，高血糖始終是糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病機(jī)制中最重要的起始因素。研究表明，細(xì)胞持續(xù)處于高血糖狀態(tài)容易導(dǎo)致氧化應(yīng)激，而視網(wǎng)膜需氧量大、葡萄糖氧化性強(qiáng)更易遭受氧化應(yīng)激的攻擊，最終誘發(fā)高代謝需求的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡[12]。既往臨床著重于糖尿病視網(wǎng)膜病變后期增生性階段的微血管病變，但其標(biāo)準(zhǔn)療法——激光光凝術(shù)臨床不良反應(yīng)較多，另一些治療方法如玻璃體內(nèi)注射VEGF抗體及一些類固醇藥物的效果也不盡人意[13-14]。而中醫(yī)藥療法歷史悠久、價格低廉、副作用小，在防治糖尿病視網(wǎng)膜病變方面具有突出優(yōu)勢[15-16]。因此，本研究對綠原酸的抗氧化能力是否發(fā)揮保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用進(jìn)行了探索。

自噬是真核細(xì)胞特有的利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的生命現(xiàn)象[17]。在正常生理條件下，自噬普遍低水平表達(dá)，在細(xì)胞生長、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，并有助于維持細(xì)胞產(chǎn)物的合成與分解代謝過程之間的平衡[18]。當(dāng)機(jī)體面臨營養(yǎng)匱乏、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞因子或病原微生物等廣泛的內(nèi)外壓力時，自噬可以引導(dǎo)細(xì)胞做出雙向適應(yīng)性應(yīng)答，決定細(xì)胞生存或死亡[8,19]。Gon?alves等[20]發(fā)現(xiàn)自噬缺陷與神經(jīng)退行性疾病中的神經(jīng)元丟失有關(guān)，自噬保護(hù)神經(jīng)元免受脫髓鞘和營養(yǎng)匱乏的影響。Li等[21]發(fā)現(xiàn)自噬在高葡萄糖引起的神經(jīng)毒性中起著保護(hù)作用。更有研究證實(shí)，自噬可以清除氧化應(yīng)激條件下受損的蛋白質(zhì)分子及細(xì)胞器，維持機(jī)體新陳代謝過程以保證衰老和受損細(xì)胞器的生理循環(huán)。當(dāng)自噬受阻時，異常的蛋白質(zhì)及細(xì)胞器聚集，進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞死亡[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2刺激后RGC-5細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞數(shù)減少，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹；綠原酸在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性地恢復(fù)細(xì)胞活性，100 μmol/L劑量最佳，且用藥后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多自噬泡。

自噬形成時，胞漿型LC3(即LC3Ⅰ)會酶解掉一段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3Ⅱ)，LC3Ⅱ是自噬泡膜形成的關(guān)鍵組分，因此LC3Ⅱ/Ⅰ比值的大小可評估自噬水平的高低[23]。而p62蛋白作為受體蛋白可以結(jié)合異常的蛋白成分與LC3相互作用最終被自噬體識別降解。自噬上游表達(dá)增強(qiáng)或者下游降解阻斷，都會導(dǎo)致p62的聚集[23]。本研究結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比值降低，綠原酸呈劑量依賴性地上調(diào)LC3Ⅱ蛋白表達(dá)。而與正常組比較，模型組p62蛋白表達(dá)增加；與模型組比較，綠原酸給藥組p62蛋白表達(dá)呈劑量依賴性地降低。結(jié)果提示，H2O2刺激模擬的氧化應(yīng)激使線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹破壞，異常的細(xì)胞器負(fù)載，可能阻斷下游自噬降解途徑，而綠原酸可能通過恢復(fù)自噬過程，促使自噬泡形成而發(fā)揮保護(hù)RGC-5細(xì)胞的作用。

綜上所述，綠原酸可以通過調(diào)控自噬相關(guān)蛋白保護(hù)H2O2損傷的小鼠RGC-5細(xì)胞，為揭示綠原酸治療糖尿病視網(wǎng)膜病變早期的神經(jīng)退行性病變的復(fù)雜機(jī)制提供參考。