基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討健脾化濁調(diào)脂方治療動脈粥樣硬化合并腸道菌群失調(diào)的機(jī)制

黃浪浪， 徐 驲， 王建安， 劉言薇*， 萬 強(qiáng)， 劉中勇*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

動脈粥樣硬化是多種心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，其主要病理特點是脂質(zhì)池和纖維帽的粥樣硬化斑塊的形成。斑塊本身不僅可以堵塞血管腔引起大中動脈的缺血性改變，還能因突然破裂誘發(fā)血栓導(dǎo)致急性心腦血管事件，在全球引起較高的死亡率和社會壓力[1]。解釋動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制學(xué)說存在多種，包括脂質(zhì)浸潤學(xué)說、炎癥反應(yīng)學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說等[2]，但任何學(xué)說均無法單獨全面地解釋動脈粥樣硬化的形成機(jī)制。腸道菌群的組分和功能穩(wěn)定對于維持腸道正常生理功能及機(jī)體免疫防御有著重要作用[3]。越來越多證據(jù)表明，腸道菌群失調(diào)能通過參與調(diào)節(jié)人體膽固醇代謝、氧化應(yīng)激和炎癥等方面，影響著動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。因此，積極研究動脈粥樣硬化的形成機(jī)制，開發(fā)有效防治動脈粥樣硬化的藥物，仍是研究熱點。

健脾化濁調(diào)脂方是江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心血管病科?？平?jīng)驗方，由劉中勇教授基于“濁”的理論精心研制而成，運用于臨床二十余年，具有健脾理氣、運化痰濁、活血祛瘀之效，已獲得國家專利(專利號ZL201510430075.8)。課題組前期研究表明，健脾化濁調(diào)脂方能通過改善血脂、降低血清炎性因子、抑制血管平滑肌增殖、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、改變腸道菌群結(jié)構(gòu)等，達(dá)到抗動脈粥樣硬化的作用[4-7]。該方臨床療效確切，不良反應(yīng)低，具有較好的應(yīng)用前景，但其對于調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)所致動脈粥樣硬化的分子機(jī)制尚不十分清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能進(jìn)一步系統(tǒng)的理解中藥的潛在作用機(jī)制，從而了解藥物對疾病的影響情況，與中醫(yī)的整體觀念相吻合[8]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探討健脾化濁調(diào)脂方活性成分，構(gòu)建健脾化濁調(diào)脂方治療腸道菌群失調(diào)引起的動脈粥樣硬化的多層次生物信息網(wǎng)絡(luò)，篩選出關(guān)鍵靶點和通路，同時借助分子對接技術(shù)和高膽堿飲食誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化小鼠模型驗證，為進(jìn)一步開展健脾化濁調(diào)脂方治療腸道菌群失調(diào)引起的動脈粥樣硬化的藥理作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 活性成分篩選 采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，以“黨參”“白術(shù)”“茯苓”“陳皮”“荷葉”“薏苡仁”“絲瓜絡(luò)”“木香”“砂仁”“丹參”“麥芽”“山楂”“澤瀉”為關(guān)鍵詞，獲取活性成分信息。將TCMSP數(shù)據(jù)庫毒藥物動力學(xué)(ADME)參數(shù)設(shè)置為口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18，BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫參數(shù)設(shè)置為score cutoff≥20、adjustedP-value<0.05，獲取活性成分群。

1.2 作用靶點及動脈粥樣硬化、腸道菌群疾病靶點預(yù)測 采用TCMSP、BATMAN-TCM、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)和Uniport(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫，預(yù)測并篩選出符合“1.1”項下標(biāo)準(zhǔn)的作用靶點，并將其蛋白和基因信息標(biāo)準(zhǔn)化為相應(yīng)基因簡稱。采用GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫，以“atherosclerosis”“intestinal flora”為關(guān)鍵詞檢索動脈粥樣硬化和腸道菌群的靶點基因，再采用Venny平臺篩選出藥物活性成分與疾病的共同靶點，得到健脾化濁調(diào)脂方治療動脈粥樣硬化合并腸道菌群失調(diào)的靶點。

1.3 活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選 將活性成分與疾病靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1軟件(http://www.cytoscape.org/)，構(gòu)建靶點網(wǎng)絡(luò)，并將結(jié)果可視化。將“1.2”項下共同靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，物種設(shè)置為“Homosapiens”，構(gòu)建靶點蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。采用Cytoscape軟件中的CytoNCA插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析，根據(jù)介度中心性(betweeness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC)、度中心性(degree centrality,DC)、特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)、網(wǎng)絡(luò)中心性(network centrality,NC)、局部邊連通性(LAC)進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為6個參數(shù)數(shù)值均大于所有節(jié)點中位數(shù)，連續(xù)篩選2次后得到的靶點作為關(guān)鍵靶點。

1.4 關(guān)鍵靶點富集分析 采用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)上傳健脾化濁調(diào)脂方對動脈粥樣硬化合并腸道菌群失調(diào)作用的靶點基因名稱列表，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索和轉(zhuǎn)化操作進(jìn)行GO富集(包括分子功能、生物過程和細(xì)胞成分)和KEGG通路富集分析。

1.5 關(guān)鍵靶點分子對接驗證 分別從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)中獲取排名前3的活性成分3D結(jié)構(gòu)及所需靶標(biāo)蛋白的受體SDF格式文件，采用AutoDockTools 1.5.6軟件對受體進(jìn)行去水、加氫處理，并計算其電荷，最后轉(zhuǎn)換為pdbqt格式。利用Pymol軟件進(jìn)行蛋白小分子結(jié)構(gòu)處理，最后由AutoDock vina軟件完成分子對接。

1.6 動物實驗驗證

1.6.1 動物 8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠20只、ApoE-/-小鼠60只，體質(zhì)量(20±2)g，購于邳州市東方養(yǎng)殖有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2017-0003，飼養(yǎng)條件為溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，自由飲食飲水。本研究獲得江西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.6.2 試劑與儀器 健脾化濁調(diào)脂組方藥材飲片由江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院劉中勇主任中醫(yī)師鑒定為正品，符合2020年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，按常規(guī)方法制成混合濃縮藥液，生藥量2 g/mL，保存于4 ℃冰箱中。氯化膽堿(美國Sigma公司，批號C7017)；氨芐青霉素、硫酸新霉素、萬古霉素、甲硝唑(上海源葉生物科技有限公司，批號S17018、S17028、S17059、S17078)；IL-1β(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號bs-0812R)；PTGS2抗體、c-Jun 抗體(美國Affinity公司，批號AF7003、AF6090)；β-肌動蛋白(β-actin)抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號ATRDE0701、ZB-2301)；蘇木素(武漢博士德生物工程有限公司，批號AR1180-1)；DAB顯色試劑盒、中性樹脂、BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號CW0125、CW0136、CW0014S)。顯微鏡(日本Olympus公司)；蛋白垂直電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

史東門風(fēng)格圖案的特點是主要表現(xiàn)真實的美國西部風(fēng)情，人物的表情動態(tài)、動物的毛發(fā)和植物組合刻畫得都要求精細(xì)寫實。

1.6.3 造模、分組與給藥 ApoE-/-小鼠在基礎(chǔ)飲食的同時，給予1%膽堿以建立動脈粥樣硬化合并腸道菌群失調(diào)動物模型。將20只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為空白對照組、氯化膽堿對照組，每組10只，空白對照組給予基礎(chǔ)飼料，氯化膽堿對照組在基礎(chǔ)飼料基礎(chǔ)上灌胃給予1%氯化膽堿；將60只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為ApoE-/-對照組(基礎(chǔ)飼料)，模型組(基礎(chǔ)飼料+灌胃給予1%氯化膽堿)，抗生素組(基礎(chǔ)飼料+灌胃給予1%氯化膽堿和廣譜抗生素)，健脾化濁調(diào)脂方低、中、高劑量組(基礎(chǔ)飼料+灌胃給予1%氯化膽堿和健脾化濁調(diào)脂方藥液9.49、18.98、37.96 g/kg)，造模周期16周，其中廣譜抗生素配方為0.5 g/L萬古霉素、1.0 g/L氨芐青霉素、1.0 g/L甲硝唑、1.0 g/L 硫酸新霉素，健脾化濁調(diào)脂方中劑量根據(jù)人和動物體表面積換算臨床等效劑量。

1.6.4 免疫組織化學(xué)法檢測IL-1β表達(dá) ApoE-/-小鼠主動脈石蠟切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化后，加入檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，3%雙氧水去除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗IL-1β(1∶200)在4 ℃下孵育過夜，加二抗(1∶200)在室溫下孵育30 min，DAB顯色后蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片，在顯微鏡下觀察，并記錄實驗結(jié)果。

1.6.5 蛋白免疫印跡法檢測PTGS2、c-Jun蛋白表達(dá) 取ApoE-/-小鼠主動脈適量，加入蛋白裂解液，充分研磨，離心后采用BCA蛋白定量測定法對上清液蛋白濃度進(jìn)行檢測，樣品經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗在4 ℃下孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗(1∶2 000)在室溫下孵育2 h，膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。以β-actin蛋白為參照，采用Image J軟件分析各抗體條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選 從TCMSP、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫平臺中共獲得1 042種活性成分，經(jīng)篩選后得到212種，其中黨參21種，白術(shù)7種，茯苓15種，陳皮5種，荷葉15種，薏苡仁9種，絲瓜絡(luò)1種，木香6種，砂仁10種，丹參65種，麥芽18種，山楂30種，澤瀉10種，去除重復(fù)值后最終得到144種。

2.2 作用靶點篩選 在TCMSP、BATMAN-TCM、Uniport數(shù)據(jù)庫平臺上繼續(xù)查詢活性成分靶點信息，去除重復(fù)值后得到649個靶點。根據(jù)GeneCards人類基因組數(shù)據(jù)庫檢索與人類相關(guān)的動脈粥樣硬化、腸道菌群失調(diào)的治療靶點，分別得到4 481、354個，采用Venny平臺對相關(guān)靶點取交集，最終得到46個，見圖1。

2.3 活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò) 圖2顯示，144種活性成分通過調(diào)控46個靶點來治療動脈粥樣硬化合并腸道菌群失調(diào)，其中quercetin可作用于ESR1、ESR2等21個靶點，而ESR1又能與quercetin、beta-sitosterol等124個化合物相連接，表明健脾化濁調(diào)脂方治療本病時具有多重效應(yīng)。

2.5 GO功能及KEGG通路富集分析 以P<0.05為篩選條件，共得到2 095個GO條目、144條KEGG通路，其中GO條目包括生物過程(biological process,BP)1 971條、細(xì)胞成分(cell component,CC)18條、分子功能(molecular function,MF)106條，各取顯著性排名前10者制作柱狀圖，見圖5，可知靶點生物過程主要涉及活性氧代謝過程、類固醇代謝過程、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等；細(xì)胞成分主要與膜筏、膜微域等有關(guān)；分子功能主要涉及血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。KEGG通路富集主要涉及Th17細(xì)胞分化、IL-17信號通路、催乳素信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等，取顯著性排名前30者制作氣泡圖，見圖6。

2.6 核心活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接 將方中作用最強(qiáng)(即為核心)的6種活性成分quercetin(槲皮素)、methylheptenone(甲基庚烯酮)、luteolin(木犀草素)、kaempferol(山柰酚)、tanshinone iia(丹參酮ⅡA)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)和關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白(IL10、JUN、INS、TP53、PTGS2、TNF)進(jìn)行分子對接，結(jié)果見表1、圖7。圖7顯示，5種成分與PTGS2的結(jié)合活性最好，而β-谷甾醇與TNF的結(jié)合活性最好。再取與每個關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白結(jié)合最強(qiáng)的活性成分進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見圖8。

表1 核心活性成分與關(guān)鍵靶點的相關(guān)信息

2.7 健脾化濁調(diào)脂方對ApoE-/-小鼠主動脈IL-1β表達(dá)的影響 與空白對照組比較，模型組ApoE-/-小鼠主動脈IL-1β表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，抗生素組、健脾化濁調(diào)脂方各劑量組ApoE-/-小鼠主動脈IL-1β表達(dá)降低(P<0.01)；與健脾化濁調(diào)脂方低劑量組比較，健脾化濁調(diào)脂方高劑量組ApoE-/-小鼠主動脈IL-1β表達(dá)降低(P<0.01)，見圖9。

2.8 健脾化濁調(diào)脂方對ApoE-/-小鼠主動脈PTGS2、c-Jun表達(dá)的影響 與空白對照組比較，模型組ApoE-/-小鼠主動脈PTGS2、c-Jun表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，抗生素組、健脾化濁調(diào)脂方各劑量組ApoE-/-小鼠主動脈PTGS2、c-Jun表達(dá)降低(P<0.01)，見圖10。

3 討論

中醫(yī)無“動脈粥樣硬化”病名，根據(jù)其臨床癥狀、病理變化等，可歸屬于“脈痹”等范疇。本病病位在心，但與脾臟密切相關(guān)。脾主運化，為氣血生化之源，脾氣旺則外邪難侵，脾的正常生理功能和抗邪能力與腸道菌群調(diào)節(jié)機(jī)體代謝和免疫防御功能相似；此外，腸道中的微生物直接參與水谷精微的消化吸收，因而維持腸道微生物穩(wěn)態(tài)是“脾主運化”功能正常的重要體現(xiàn)。脾虛氣弱，氣血、水谷精微輸布障礙，致痰瘀互結(jié)，濁毒內(nèi)生，日久則引起動脈粥樣硬化的發(fā)生。健脾化濁調(diào)脂方由異功散加減而成，具有醒脾助運，化濁祛瘀，補(bǔ)而不滯的優(yōu)點。方中黨參、白術(shù)、茯苓、薏苡仁等健脾藥物中所含有的多糖，可促進(jìn)腸道內(nèi)益生菌生長，進(jìn)而維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)[9]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選得到，健脾化濁調(diào)脂方活性成分144個，對應(yīng)作用靶點46個。其中，槲皮素不僅能通過抑制脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化和酶促反應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生；還能通過增加腸道短鏈脂肪酸的濃度，調(diào)節(jié)Firmicutes和Actinobacteria的豐度來降低動脈粥樣硬化脂質(zhì)代謝產(chǎn)物的水平，從而抑制動脈粥樣硬化的進(jìn)展[10-11]。木犀草素是一種常見的類黃酮，具有擴(kuò)張血管和保護(hù)血管的雙重生物活性，能有效保護(hù)血管內(nèi)皮免受氧化應(yīng)激損傷，還能通過抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3減少oxLDL誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[12]。丹參酮ⅡA可以下調(diào)CD36和MKK4/JNK2信號通路，從而抑制血小板活化，防止血栓形成[13]。此外，還有一些尚未被報道的生物過程和活性成分，這些生物過程和活性成分的功效將成為未來研究健脾化濁調(diào)脂方對動脈粥樣硬化合并腸道菌群失調(diào)影響的潛在方向。

通過對46個靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，IL10、JUN、INS、TP53、PTGS2、TNF等靶點是健脾化濁調(diào)脂方治療動脈粥樣硬化合并腸道菌群失調(diào)的關(guān)鍵靶點。腸道菌群通過在體內(nèi)參與蛋白質(zhì)、膳食纖維、膽堿等營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，產(chǎn)生氧化三甲胺(TMAO)、短鏈脂肪酸(SCFAs)和膽汁酸(BAs)等代謝物影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。TMAO能上調(diào)巨噬細(xì)胞清道夫受體，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞膽固醇積累和泡沫細(xì)胞形成，促進(jìn)血管斑塊的形成，并通過釋放炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)血管炎性反應(yīng)；還能影響胰島素抵抗，增強(qiáng)血小板高反應(yīng)性，促進(jìn)血小板聚集，增加血栓形成[14-17]。SCFAs主要是乙酸、丙酸和丁酸，可以通過激活細(xì)胞上的G蛋白偶聯(lián)受體41和43，或通過抑制組蛋白去乙?；{(diào)節(jié)激素分泌，影響機(jī)體脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)[18-19]。研究表明，丁酸可以調(diào)節(jié)腸道緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達(dá)，減少血液循環(huán)中內(nèi)毒素和IL-1β等炎癥因子的水平，抑制動脈粥樣硬化斑塊形成[20]。膽汁酸是內(nèi)源性G蛋白偶聯(lián)受體5(TGR5)的配體，通過調(diào)控脂肪、糖、能量的代謝及炎癥反應(yīng)，在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。巨噬細(xì)胞上的TGR5受體被激活，通過TGR5-cAMP信號通路抑制IκB激酶的磷酸化，降低NF-κB的活性，增加IL-10的產(chǎn)生，抑制單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附[21]。以上研究結(jié)果表明，腸道菌群可以通過NF-κB信號通路、cAMP信號通路等影響動脈粥樣硬化的形成。通過KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，健脾化濁調(diào)脂方治療動脈粥樣硬化合并腸道菌群失調(diào)的相關(guān)靶點皆可富集到上述通路，說明健脾化濁調(diào)脂方可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)通路，從而發(fā)揮抑制腸道菌群失調(diào)所致動脈粥樣硬化的功效。

為了驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，采用動物實驗驗證IL-1β和分子對接結(jié)果較好的PTGS2以及JUN蛋白表達(dá)，旨在說明健脾化濁調(diào)脂方能通過調(diào)節(jié)腸道菌群、抑制炎癥反應(yīng)等信號通路干預(yù)動脈粥樣硬化形成。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法初步從健脾化濁調(diào)脂方中篩選出活性成分、作用靶點、以及治療疾病的關(guān)鍵通路，并對關(guān)鍵靶點進(jìn)行實驗驗證，可為研究探索健脾化濁調(diào)脂方調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)、抗動脈粥樣硬化的作用機(jī)制提供依據(jù)。