菊苣酸體外抗呼吸道合胞病毒的作用

王 紅， 馮 帥， 史 磊， 李 鵬， 李 峰*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，山東第一醫(yī)科大學(xué)，山東 濟(jì)南 250062)

呼吸道合胞病毒(RSV)是副黏病毒科肺炎病毒屬的一種在全球范圍內(nèi)引起嬰幼兒急性下呼吸道感染的人類呼吸道病毒[1-2]，其易感人群主要為6個月以下的嬰兒及高齡人群，RSV感染后可引起毛細(xì)支氣管炎、肺炎、上呼吸道感染等多種臨床疾病，嚴(yán)重者還可引起病毒性哮喘[3]。全球每年約有3 300萬名嬰幼兒死于呼吸道疾病，因RSV感染死亡的嬰幼兒和老人數(shù)量也呈現(xiàn)出上升的趨勢，嚴(yán)重危害人類健康，逐漸引發(fā)社會關(guān)注[4]。

菊苣酸是一種主要存在于紫錐菊、菊苣中的苯丙酸類化合物，具有抑菌、抗病毒、抗炎及調(diào)節(jié)免疫的作用[5-8]。菊苣酸對多種病毒具有抑制作用。Zhang等[9]通過D-半乳糖胺誘導(dǎo)的人正常肝細(xì)胞HL-7702損傷模型研究菊苣葉中菊苣酸抗乙型肝炎的特性，結(jié)果表明，10～100 μg/mL菊苣酸能夠減輕其損傷；1～100 μg/mL菊苣酸在受感染的鴨胎肝細(xì)胞中顯著抑制鴨乙型肝炎病毒(DHBV)的DNA復(fù)制。Langland等[10]發(fā)現(xiàn)，菊苣酸等具有咖啡?；糠钟袡C(jī)化合物與各種金屬和其他無機(jī)離子配對時，其咖啡酸抗單純皰疹病毒(HSV)的特性增強(qiáng)。Robinson等[11]通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，人類免疫缺陷病毒(HIV)整合酶抑制劑L-菊苣酸與蛋白酶抑制劑、齊多夫定組合具有抗HIV活性的作用。

目前，菊苣酸抗病毒作用已有不少報道，但其抗RSV的研究卻很少，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平研究菊苣酸抗RSV的作用，以期為進(jìn)一步開展菊苣酸抗病毒機(jī)制研究和新藥研制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 菊苣酸對照品(純度≥98%，批號P08M10F82474)，購自上海源葉生物科技有限公司；利巴韋林注射液(批號01905083)，購自石藥銀湖制藥有限公司；Quacell特級胎牛血清(南美血源，批號1234567890)，購自中山康天晟合生物技術(shù)有限公司；不完全RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液(不含雙抗)、青鏈霉素混合液(批號20190622、20190724)，購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；0.25% Trysin-EDTA(批號2048080)，購自美國Gibco公司；TRNzol Universal總RNA提取試劑(批號U8807)，購自天根生化科技(北京)有限公司；HiScript? Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(批號7E402G0)，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；TB Green? Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(批號AJF25979A)，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；50×TAE緩沖液(批號20191204)，購自北京索萊寶科技有限公司；Regular AGAROSE G-10(批號182215)，購自上海徠創(chuàng)生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。中性紅、氯仿(批號20120710、20130730)，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、異丙醇、無水乙醇(批號20180602、20150315、20160929、20180410、20190227、20190517)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DEPC水(批號011720200417)，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞與病毒 人喉癌上皮細(xì)胞(Hep-2)和RSV均由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。所有涉及RSV的實(shí)驗(yàn)均在山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所BSL-2實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

1.3 儀器 ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；Nanodrop One超微量紫外光度計、-80 ℃ 725型超低溫冰柜(美國Thermo公司)；超凈工作臺(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(山東萊索科技有限公司)；TD5M型高速臺式離心機(jī)(長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；微波爐(廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司)。

1.4 引物 根據(jù)Genebank已收錄的呼吸道合胞病毒融合蛋白(RSV-F)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)應(yīng)用引物設(shè)計與合成委托鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司，見表1。

表1 引物序列

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 菊苣酸 稱取菊苣酸對照品4 mg，加入2 mL PBS，用移液器吹打均勻使其完全溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾，配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，避光冷藏保存。

2.1.2 利巴韋林 將100 mg/mL利巴韋林注射液用PBS稀釋成4 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 PBS 稱取NaCl 80 g、KCl 2 g、KH2PO42.4 g、Na2HPO436.28 g，加蒸餾水至1 L，調(diào)整pH值為7.4，過濾除菌，分裝，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4 中性紅染液 稱取NaCl 50 g、中性紅2.5 g，在450 mL蒸餾水中加入50 g NaCl使其完全溶解，配制成0.9% NaCl溶液，與中性紅粉末混勻，即得。

2.1.5 脫色液 50%乙醇與0.1 moL/L Na2HPO4溶液混勻，即得。

2.2 細(xì)胞復(fù)蘇傳代 將凍存于液氮罐中的Hep-2細(xì)胞凍存管取出，迅速放入37 ℃水中攪動使其快速溶解，1 200 r/min離心5 min，棄去凍存管內(nèi)的凍存液，于離心管中加入1 mL含10%特級胎牛血清(FBS)的RPMI 1640，將細(xì)胞吹打均勻并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入9 mL含10% FBS的RPMI 1640，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，待其長成單層后，用0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行1∶2傳代，細(xì)胞長成單層時用于病毒擴(kuò)增或體外抗病毒實(shí)驗(yàn)。

2.3 病毒擴(kuò)增 將長有單層Hep-2細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液棄去，PBS沖洗3次，將RSV接種到已長成單層的細(xì)胞上，37 ℃吸附30 min，加入10 mL 1640維持液(含2% FBS的RPMI 1640)，置37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。同時設(shè)置細(xì)胞對照組，只添加等體積含2% FBS的RPMI 1640，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，待病變達(dá)到85%以上時終止實(shí)驗(yàn)，反復(fù)凍融3次，1 200 r/min離心5 min，上清液定量分裝，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 病毒毒力檢測 采用Reed-Muench法[12]檢測病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。將Hep-2細(xì)胞以每孔1×105個的密度接種到96孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜，用2% RPMI 1640將病毒液以10倍比依次稀釋(1×10-1～1×10-12)，橫向依次接種在96孔板內(nèi)單層細(xì)胞上，縱向重復(fù)3孔，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，96 h后每孔加入100 μL中性紅染液，置37 ℃染色1 h，棄去染液，用水將多余染料充分洗滌，每孔加入100 μL脫色液，室溫放置15 min，在540 nm處檢測吸光度(A)，計算TCID50。

2.5 藥物對Hep-2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 在96孔板中接種Hep-2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞形成單層，用2% RPMI 1640將菊苣酸、利巴韋林進(jìn)行2倍比系列稀釋，按稀釋度順序橫向接種于96孔板中的Hep-2細(xì)胞上，每孔100 μL，每個稀釋度設(shè)置3個復(fù)孔，并設(shè)置細(xì)胞對照組，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h，采用Reed-muench法計算藥物半數(shù)中毒濃度(TC50)，在540 nm處檢測吸光度(A)，計算細(xì)胞存活率。

2.7 菊苣酸不同給藥方式對RSV增殖的影響 將Hep-2細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后使細(xì)胞長成單層，按照以下3種方式進(jìn)行抗RSV活性檢測，分別為先加RSV，2 h后添加菊苣酸；先加菊苣酸，2 h后添加RSV；同時添加RSV和菊苣酸，按“2.5”項(xiàng)下方法檢測不同給藥方式對菊苣酸抗RSV活性的影響。

2.8 菊苣酸抑制RSV復(fù)制時段的影響

2.8.1 吸附實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[14]報道，將長成單層的Hep-2細(xì)胞在4 ℃下預(yù)冷1 h，棄去培養(yǎng)液，接種100 TCID50的RSV和62.5、31.25、15.63、7.813、3.91、1.953、0.98、0.49 μg/mL菊苣酸(50 μL/孔)，在4 ℃下孵育3 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗3次，添加細(xì)胞維持液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時設(shè)置正常細(xì)胞對照和病毒對照，按“2.5”項(xiàng)下方法檢測菊苣酸對RSV吸附細(xì)胞的影響。

2.8.2 穿入實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[14]報道，將長成單層的Hep-2細(xì)胞在4 ℃下預(yù)冷1 h，棄去培養(yǎng)液，接種RSV(50 μL/孔)，4 ℃ 孵育3 h，加入62.5、31.25、15.63、7.813、3.91、1.953、0.98、0.49 μg/mL菊苣酸藥液(50 μL/孔)，37 ℃、5% CO2孵育1 h，棄去培養(yǎng)液，用堿性PBS(pH 11)處理1 min，滅活未穿入病毒，立即用酸性PBS(pH 3)中和，棄去中性PBS，添加細(xì)胞維持液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，同時設(shè)正常細(xì)胞對照和病毒對照，按“2.5”項(xiàng)下方法檢測菊苣酸對RSV穿入細(xì)胞的影響。

2.9 RT-qPCR法檢測RSV基因組復(fù)制 將長成單層的Hep-2細(xì)胞在37 ℃、5%CO2條件下孵育12 h，棄上清，接種RSV，2 h后棄病毒液，PBS沖洗2次，加入125 μg/mL菊苣酸及250 μg/mL利巴韋林藥液，同時設(shè)置細(xì)胞對照組和病毒對照組，當(dāng)病毒對照組細(xì)胞病變達(dá)到85%以上時，采用TRIzol法提取總RNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA 28S、18S、5S條帶清晰度，檢測RNA降解和DNA污染。在260、280 nm波長處檢測吸光度(A)，計算RNA的純度和含量。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制相應(yīng)試劑，37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒說明書配置相應(yīng)試劑，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行RSV-F相對定量分析。

3 結(jié)果

3.1 病毒TCID50檢測 RSV的TCID50為1×10-6.667/0.1 mL。

3.2 菊苣酸對Hep-2細(xì)胞的毒性 隨著菊苣酸質(zhì)量濃度的減小，細(xì)胞折光性、皺縮、變圓、破碎甚至脫落等細(xì)胞病變效應(yīng)特征減弱。當(dāng)菊苣酸質(zhì)量濃度≥250 μg/mL時，細(xì)胞存活率低于50%；當(dāng)菊苣酸質(zhì)量濃度≤125 μg/mL時，細(xì)胞病變極少，存活率達(dá)90%以上，見圖1。菊苣酸TC50值為171.9 μg/mL，其陽性對照利巴韋林TC50值為578.7 μg/mL。

3.3 菊苣酸對RSV的抑制作用 由圖2可知，細(xì)胞對照組細(xì)胞呈現(xiàn)鱗形，數(shù)量多，排列緊密；病毒對照組細(xì)胞變圓，皺縮，間隙增大，脫落；菊苣酸組細(xì)胞排列緊密，未變圓；利巴韋林組中細(xì)胞出現(xiàn)大量病變，細(xì)胞變圓，發(fā)生皺縮，間隙增大，甚至脫落，提示藥物在無藥物毒性范圍內(nèi)能有效地抑制RSV引起的細(xì)胞病變。對菊苣酸和利巴韋林(兩者質(zhì)量濃度均為62.5～0.122 μg/mL)抗RSV效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)菊苣酸優(yōu)于利巴韋林(P<0.05)，見圖3。菊苣酸抑制RSV的EC50值為0.083 μg/mL，TI為2 071；利巴韋林EC50值為138.825 μg/mL，TI為4.2。

3.4 菊苣酸不同給藥方式對RSV增殖的影響 感染RSV 2 h后添加菊苣酸，添加菊苣酸2 h后再接種RSV以及同時添加菊苣酸和RSV的3組實(shí)驗(yàn)中，菊苣酸對RSV均具有抑制作用，并且各實(shí)驗(yàn)組之間無明顯差異(P>0.05)，見圖4。

3.5 菊苣酸抑制RSV復(fù)制時段的影響 分別在RSV吸附和穿入細(xì)胞時，添加不同濃度的菊苣酸進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明吸附和穿入組的細(xì)胞存活率皆與病毒組相當(dāng)，并未因菊苣酸的干預(yù)而延緩細(xì)胞病變。由此表明，菊苣酸對RSV吸附和穿入細(xì)胞的過程無抑制作用，菊苣酸的抗RSV作用應(yīng)發(fā)生在病毒穿入細(xì)胞以后的某個階段，見圖5～6。

3.6 菊苣酸對RSV基因組復(fù)制的影響 與病毒對照組比較，菊苣酸組和陽性對照利巴韋林組RSV-FmRNA表達(dá)低于病毒對照組(P<0.01)，說明在復(fù)制階段，菊苣酸能夠抑制RSV的復(fù)制表達(dá)(P<0.01)，見表2。

表2 菊苣酸對RSV基因組復(fù)制的影響

4 討論

本研究通過細(xì)胞病變效應(yīng)法在細(xì)胞水平研究菊苣酸抗RSV的作用，結(jié)果表明，菊苣酸對RSV在Hep-2細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程具有抑制作用，其EC50值為0.083 μg/mL，TI為2 071，根據(jù)新藥藥理毒理學(xué)研究指導(dǎo)原則，TI>2則視為高效低毒[15]。不同給藥方式的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無論是先感染RSV還是先加入菊苣酸，菊苣酸都具有抑制RSV的作用，表明菊苣酸在RSV侵入細(xì)胞的階段并未發(fā)揮其抗病毒作用。菊苣酸阻斷RSV穿入與吸附的實(shí)驗(yàn)研究表明，干預(yù)組細(xì)胞存活率與病毒對照組無顯著差異，并未因?yàn)榫哲乃岬母蓴_而延緩細(xì)胞病變，即菊苣酸對RSV吸附和穿入細(xì)胞的過程均無抑制作用。RT-qPCR結(jié)果表明，菊苣酸可以抑制RSV基因組的復(fù)制。因此，可以確定菊苣酸對RSV的抑制是發(fā)生在病毒穿入細(xì)胞后的階段。

菊苣酸是從天然植物中提取出來的活性成分，成分單一明確，安全性相對較高。目前，臨床上常用的抗RSV藥物為西藥利巴韋林，然而其只適合病重者及高危人群的治療[16]，并且在臨床上具有一定的不良反應(yīng)，如頭痛、惡心、出血、高劑量利巴韋林對心臟還有損傷[17-18]，因此其治療的有效性和安全性依然有待研究[19]。本研究還發(fā)現(xiàn)其陽性對照利巴韋林的TI為4.2，抑制RSV的效果弱于菊苣酸，提示菊苣酸有望成為抗RSV的候選藥物的主要有效成分。

另外，菊苣酸對RSV穿入細(xì)胞后的抗病毒機(jī)制可能為①阻止RSV的蛋白表達(dá)，或阻斷非結(jié)構(gòu)蛋白的功能；②誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IFN；③刺激免疫細(xì)胞或誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。菊苣酸確切的抗病毒機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，菊苣酸具有顯著的抗RSV作用，提示其具有用于治療RSV感染的良好前景，且為進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。