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    基于PI3K/Akt/FoxO1信號(hào)通路探索白虎加人參湯對(duì)2型糖尿病大鼠胰腺組織的保護(hù)作用

    2022-12-04 09:52:30姚敏娜王四旺
    中成藥 2022年10期
    關(guān)鍵詞:白虎胰島人參

    王 芳, 姚敏娜, 張 雅, 王四旺*

    (1.陜西能源職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院,陜西 咸陽(yáng) 712000;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院,陜西 西安 710032)

    據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟2017年報(bào)道,全球2型糖尿病患者約有4.51億,在2045年預(yù)計(jì)達(dá)到6.93億,預(yù)測(cè)到2035年我國(guó)2型糖尿病人數(shù)將達(dá)到1.43億[1-2]。2型糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前認(rèn)為胰島素抵抗及胰島β細(xì)胞功能缺陷是其發(fā)病的主要機(jī)制[3],胰島素抵抗伴隨其發(fā)生、發(fā)展;胰島β細(xì)胞功能缺陷是2型糖尿病發(fā)生的必要條件[4],而氧化應(yīng)激可以直接或間接加重胰島素抵抗以及胰島β細(xì)胞的損傷[5-7]。因此,保護(hù)胰島β細(xì)胞功能,抑制胰島β細(xì)胞凋亡對(duì)治療2型糖尿病有著重大意義。通過研究表明,磷脂酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B/磷酸化插頭轉(zhuǎn)錄因子1(PI3K/Akt/FoxO1)信號(hào)通路對(duì)于胰島β細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖、凋亡、分化和胰島素分泌等方面具有重要作用[8]。

    白虎加人參湯始見于《傷寒雜病論》,由知母、石膏、甘草、粳米、人參組成,具有養(yǎng)陰清熱,益氣生津的功效,大量研究表明,白虎加人參湯可以有效改善糖尿病患者臨床癥狀,降低血糖,改善胰島素抵抗、保護(hù)胰島β細(xì)胞、抗氧化應(yīng)激作用[9-13],在臨床上已被應(yīng)用于2型糖尿病治療,并且取得了很好的療效[14-19],但是其作用機(jī)制尚不明確。因此,本研究通過探索白虎加人參湯對(duì)2型糖尿病大鼠胰腺組織的保護(hù)作用及其作用機(jī)制,以期為白虎加人參湯臨床合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    1 材料

    1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(軍)2021-001。飼養(yǎng)條件為溫度(23±2)℃,相對(duì)濕度(50±5)%,12 h/12 h自控照明,大鼠均有專業(yè)人員負(fù)責(zé)飼養(yǎng),日常自由進(jìn)食和飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

    1.2 藥物 白虎加人參湯按組方比例取知母18 g、石膏50 g、炙甘草6 g、粳米9 g、人參10 g,以8倍量蒸餾水浸泡30 min,煎煮2次,合并煎液,濾過后濃縮至生藥量2 g/mL,置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。二甲雙胍(批號(hào)20190304)為陽(yáng)性藥,購(gòu)自中美上海施貴寶制藥有限公司。

    1.3 試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ)(美國(guó)Sigma公司,批號(hào)S0130);高脂高糖飼料(上海普路騰生物科技有限公司,批號(hào)20210621-074);大鼠胰島素ELISA試劑盒(瑞典Mercodia公司,批號(hào)10-1250-10);糖化血紅蛋白(HbAlc)試劑盒(瑞士ALEXIS公司,批號(hào)YB-R0298c);甘油三酯(TG)試劑盒、總膽固醇(TCH)試劑盒、高密度脂蛋白(HDL)試劑盒、低密度脂蛋白(LDL)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司,批號(hào)分別為A110-1-1、A111-1-1、A112-1-1、A113-1-1);細(xì)胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、抗Akt抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號(hào)分別為G2026、G2002、GB111114、GB23303);抗p-Akt抗體、抗FoxO1抗體、抗葡萄糖激酶(GCK)抗體、抗胰十二指腸同源盒因子-1(Pdx1)抗體、GAPDH抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司,批號(hào)分別為4060、2880、3782、5679、5174);FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)[寶生物工程(大連)有限公司,批號(hào)AIG2018A]。血糖儀及血糖試紙(美國(guó)Abbott公司);Nanodrop 2000超微量核酸蛋白檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司);熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司);電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

    2 方法

    2.1 2型糖尿病大鼠模型的建立 大鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組(8只)和造模組(50只),正常組繼續(xù)給予正常飼料喂養(yǎng),造模組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng),4周后禁食不禁水12 h,造模組腹腔注射STZ(40 mg/kg),正常組注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 4.2),72 h后禁食不禁水12 h,檢測(cè)血糖。1周后再次復(fù)查,2次空腹血糖(FBG)均大于16.7 mmol/L者為造模成功。

    2.2 分組及給藥 挑選造模成功的大鼠,按照體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組,二甲雙胍組(200 mg/kg),白虎加人參湯高、低劑量組(37.8、9.45 g/kg),每組8只,給藥8周,模型組和給藥組每天均給予高脂高糖飼料,正常組每天繼續(xù)給予正常飼料。觀察記錄給藥期間大鼠體質(zhì)量、FBG及行為狀態(tài)。

    2.3 標(biāo)本處理與采集 分別在給藥第0、2、4、6、8周時(shí),禁食不禁水12 h后,尾靜脈取血,檢測(cè)FBG。腹腔給予10%水合氯醛麻醉,待大鼠完全麻醉,經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,一部分裝于抗凝離心管中,用于檢測(cè)HbAlc;剩余血裝于普通離心管中,3 500 r/min離心15 min,分離上層血清,用于檢測(cè)其他生化指標(biāo)。取血后,迅速分離出胰腺組織,稱定質(zhì)量,分離出一部分放入4%多聚甲醛溶液中,用于石蠟切片制備及后續(xù)形態(tài)學(xué)觀察;剩余胰腺組織于-80 ℃凍存,用于PI3K/Akt/FoxO1信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè)。

    2.4 生化指標(biāo)檢測(cè) 按照相關(guān)試劑盒說明書檢測(cè)HbAlc、胰島素(insulin,INS)、TG、TCH、HDL、LDL水平,并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)。

    2.5 石蠟切片制備及病理學(xué)觀察 取固定于4%多聚甲醛溶液中的各組大鼠胰腺組織,用各體積分?jǐn)?shù)乙醇梯度脫水,每級(jí)1.5 h,使用二甲苯透明標(biāo)本,將透明化組織塊完全浸沒于60~65 ℃石蠟液體中恒溫過夜,用熔化的蠟液包埋組織,待冷卻成型后,在石蠟切片機(jī)上以5 μm厚度連續(xù)切片,脫蠟,蘇木精-伊紅染色,封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺組織病理變化。

    2.6 RT-qPCR法檢測(cè)胰腺組織中caspase3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá) 取大鼠胰腺組織100 mg,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)caspase3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá),引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成,以GAPDH為內(nèi)參,引物序列見表1。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 10 min;擴(kuò)增 95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,共40個(gè)循環(huán);熔解曲線反應(yīng)條件為60 ℃升至95 ℃,0.3 ℃/15 s。使用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)。

    表1 引物序列

    2.7 Western Blot法檢測(cè)胰腺組織Akt、p-Akt、FoxO1、Pdx1、GCK蛋白表達(dá) 取大鼠胰腺組織100 mg提取總蛋白和核蛋白,經(jīng)BCA法定量和蛋白變性后,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行封閉,用一抗稀釋液分別稀釋一抗p-Akt(1∶5 000)、Akt(1∶5 000)、FoxO1(1∶5 000)、Pdx1(1∶5 000)、GCK(1∶5 000)、GAPDH(1∶5 000),充分覆蓋PVDF膜,4 ℃孵育過夜,次日使用TBST洗5次,每次5 min,放入二抗(1∶2 000)溶液中,室溫孵育1 h,TBST洗5次,每次5 min,避光現(xiàn)配ECL化學(xué)發(fā)光液,于暗室中加至PVDF 膜的蛋白面,充分接觸,1~2 min后去盡殘液,放入暗匣中曝光,曝光后的膠片用顯影、定影試劑進(jìn)行顯影和定影。將膠片進(jìn)行掃描,以Photoshop軟件整理去色,Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

    2.8 免疫組織化學(xué)染色觀察FoxO1蛋白表達(dá) 胰腺組織切片脫蠟至水,置EDTA緩沖液中微波修復(fù),滴加5% BSA室溫封閉30 min,加入一抗FoxO1(1∶400)充分覆蓋切片,4 ℃孵育過夜,PBS洗4次,每次5 min,甩干,滴加二抗(1∶400),甩干,滴加試劑SABC,室溫1.5 h,滴加3,3-二氨基聯(lián)苯胺顯色,蘇木素復(fù)染,水洗3次,每次5 min,乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片??梢婞S色或棕色沉積即為FoxO1蛋白陽(yáng)性表達(dá)。

    3 結(jié)果

    3.1 白虎加人參湯對(duì)2型糖尿病大鼠FBG、INS、HAblc水平的影響 正常組大鼠精神狀態(tài)良好,皮毛有光澤,空腹血糖正常。如圖1A所示,與正常組比較,模型組大鼠FBG升高(P<0.05);與模型組比較,2周后,陽(yáng)性藥組和白虎加人參湯高劑量組FBG水平降低(P<0.05),而白虎加人參湯低劑量組在給藥4周后,F(xiàn)BG水平降低(P<0.05),提示白虎加人參湯能夠降低2型糖尿病大鼠的FBG。如圖1B~1C所示,與正常組比較,模型組大鼠INS水平降低(P<0.05),HAblc水平升高(P<0.05);與模型組比較,8周后,各給藥組大鼠INS水平升高(P<0.05),HAblc水平降低(P<0.05)。

    3.2 白虎加人參湯對(duì)2型糖尿病大鼠ISI的影響 如表2所示,與正常組比較,模型組ISI降低(P<0.05);8周后,與模型組比較,各給藥組ISI均升高(P<0.05)。

    表2 白虎加人參湯對(duì)2型糖尿病大鼠ISI的影響

    3.3 白虎加人參湯對(duì)2型糖尿病大鼠胰腺指數(shù)的影響 采用STZ造模時(shí),會(huì)損傷大鼠的胰腺組織,如圖2所示,模型組大鼠胰腺指數(shù)低于正常組(P<0.05);白虎加人參湯干預(yù)8周后,大鼠胰腺指數(shù)與模型組比較均升高(P<0.05),提示白虎加人參湯可改善2型糖尿病大鼠的胰腺萎縮。

    3.4 白虎加人參湯對(duì)2型糖尿病大鼠血脂代謝的影響 如圖3所示,與正常組比較,模型組大鼠血清TG、TCH、LDL水平均升高(P<0.05),HDL水平降低(P<0.05);與模型組比較,各給藥組大鼠血清TG、TCH、LDL水平均降低(P<0.05),白虎加人參湯高劑量組大鼠血清HDL水平升高(P<0.05),提示白虎加人參湯對(duì)2型糖尿病大鼠的血脂具有改善作用。

    3.5 白虎加人參湯對(duì)2型糖尿病大鼠胰島病理組織形態(tài)學(xué)的影響 正常組大鼠胰島呈橢圓形,結(jié)構(gòu)規(guī)整,胞團(tuán)大小不一,結(jié)構(gòu)完整、規(guī)則、邊緣清晰,散布于胰腺腺泡之間,胰島內(nèi)β細(xì)胞豐富、大小均勻、形態(tài)飽滿,排列緊密,未發(fā)現(xiàn)病理變化;模型組大鼠胰島形態(tài)不規(guī)則,邊界模糊,結(jié)構(gòu)紊亂,胰島內(nèi)β細(xì)胞腫脹、變形,細(xì)胞質(zhì)染色變淺;與模型組比較,各給藥組大鼠胰島內(nèi)β細(xì)胞數(shù)目明顯增加,結(jié)構(gòu)較規(guī)整,無明顯壞死,胰島邊界清晰,形態(tài)結(jié)構(gòu)有所改善,見圖4。

    3.6 白虎加人參湯對(duì)2型糖尿病大鼠胰腺組織凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 如圖5所示,與正常組比較,模型組大鼠胰腺組織caspase3、Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá)升高(P<0.05);與模型組比較,各給藥組大鼠胰腺組織caspase3、Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá)均降低(P<0.05),提示白虎加人參湯具有抗2型糖尿病大鼠胰腺組織凋亡的作用。

    3.7 白虎加人參湯對(duì)2型糖尿病大鼠胰腺組織p-Akt、Akt、Pdx1、FoxO1、GCK蛋白表達(dá)的影響 如圖6A~6E所示,與正常組比較,模型組大鼠胰腺組織PI3K/Akt/FoxO1信號(hào)通路受到抑制,p-Akt/Akt、Pdx1、GCK蛋白表達(dá)降低(P<0.05),而FoxO1的核輸出減少,細(xì)胞核中FoxO1增多(P<0.05),活性下降;與模型組比較,8周后,各給藥組大鼠胰腺組織p-Akt/Akt、Pdx1、GCK蛋白表達(dá)均升高(P<0.05),F(xiàn)oxO1蛋白表達(dá)減少(P<0.05),促進(jìn)了FoxO1的核輸出。如圖6F所示,免疫組化實(shí)驗(yàn)同Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,提示白虎加人參湯可能是通過影響PI3K/Akt/FoxO1信號(hào)通路中的相關(guān)蛋白表達(dá)來發(fā)揮保護(hù)胰腺組織的作用。

    4 討論

    白虎加人參湯始見于《傷寒雜病論》,由知母、石膏、甘草、粳米、人參組成。生石膏辛甘大寒為君藥,專清肺胃之熱邪,既可清陽(yáng)明之內(nèi)熱, 又能滋養(yǎng)肺陰, 與少陰腎經(jīng)之知母相配, 既可瀉無根之腎火, 宣氣分之郁熱, 又可養(yǎng)陰生津; 知母之辛苦寒涼, 下則潤(rùn)腎燥以滋陰, 上則清肺金而瀉火,石膏知母相須為用,加強(qiáng)清熱生津的作用;人參為佐,一可升脾氣,助運(yùn)化,資生化之源,二可補(bǔ)元?dú)?,人參與石膏相配,石膏得人參能清熱補(bǔ)虛,且不傷氣陰,人參得石膏可補(bǔ)而不燥,二者相得益彰;粳米生胃津益胃氣; 甘草和胃養(yǎng)陰,共奏清熱止渴、益氣生津之效,為治療消渴病的有效方藥。

    目前,胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能缺陷被認(rèn)為是2型糖尿病發(fā)病的重要病理生理機(jī)制[20]。因此,預(yù)防與治療2型糖尿病的關(guān)鍵是保護(hù)胰島β細(xì)胞、減少胰島β細(xì)胞凋亡及增加INS分泌。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),給予白虎加人參湯8周后,2型糖尿病大鼠血清INS分泌增多,F(xiàn)BG和HAblc水平均下降,ISI升高,并且可改善2型糖尿病大鼠的血脂代謝。為了探究其INS分泌增多的原因,本研究發(fā)現(xiàn),白虎加人參湯可以改善2型糖尿病大鼠的胰島組織病理變化,其還可以降低凋亡相關(guān)因子caspase3和Bax/Bcl-2的mRNA表達(dá),增加胰腺指數(shù),從而保護(hù)胰島β細(xì)胞,延緩胰島β細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。

    PI3K/Akt信號(hào)通路作為一條經(jīng)典信號(hào)通路, 對(duì)調(diào)控胰島β細(xì)胞的凋亡、增殖,調(diào)節(jié)INS敏感性,緩解胰島素抵抗[21]及促進(jìn)INS分泌[22]等方面具有重要作用。PI3K通過影響Akt磷酸化,來介導(dǎo)胰島素和多種生長(zhǎng)因子對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)及細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等。FoxO1使Akt失去轉(zhuǎn)錄活性,抑制胰島β細(xì)胞凋亡[8],增加胰島β細(xì)胞數(shù)目,保護(hù)胰島β細(xì)胞。FoxO1調(diào)控胰島β細(xì)胞增殖的過程,是Pdx1的負(fù)性調(diào)節(jié)劑,在胰島β細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)揮功能中起到關(guān)鍵作用。而Pdx1也是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子2(GLUT-2)和GCK等與胰島素釋放有關(guān)的一組基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。由此可見,PI3K/Akt/FoxOl信號(hào)通路對(duì)于胰島β細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖、凋亡和胰島素分泌等方面具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),白虎加人參湯可以提高胰腺組織中的p-Akt/Akt、Pdx1、GCK蛋白表達(dá)升高,減少FoxO1蛋白表達(dá),促進(jìn)了FoxO1的核輸出。

    綜上所述,白虎加人參湯可以降低2型糖尿病大鼠FBG、HAblc水平,促進(jìn)血清INS分泌及ISI升高,并且可改善2型糖尿病大鼠的血脂代謝,還可降低凋亡相關(guān)因子caspase3和Bax/Bcl-2的mRNA表達(dá),增加胰腺指數(shù),改善2型糖尿病大鼠的胰島組織病理變化,其機(jī)制可能是通過調(diào)控PI3K/Akt/FoxO1信號(hào)通路發(fā)揮作用。

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