基于自噬及凋亡探討理中湯合四神丸對潰瘍性結腸炎大鼠的保護作用

吳玉泓， 郝民琦， 李海龍*， 殷銀霞， 梁永林， 張 磊， 李曉玲， 王瑞瓊，程小麗

[1.深圳大學附屬華南醫(yī)院，廣東 深圳 518111；2.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；3.北京中醫(yī)藥大學深圳醫(yī)院(龍崗)，廣東 深圳 518172]

潰瘍性結腸炎又稱非特異性潰瘍性結腸炎，發(fā)病率在全球范圍內呈上升趨勢，發(fā)病機制涉及多種影響因素如遺傳、免疫、環(huán)境等[1]，其病因仍不明確，臨床癥狀主要表現為腹瀉、腹痛以及黏液膿血便，病情輕重不等，多呈反復發(fā)作的慢性病程[2]。

自噬意為“自食”，是捕獲和降解溶酶體中受損蛋白和細胞器的分解代謝過程[3]，其可對腸道免疫調節(jié)起到重要作用[4]，而巨噬細胞調節(jié)紊亂可導致炎性腸病的發(fā)生[5]，近年來自噬在炎性腸病的發(fā)病及相關藥物治療機制中被證實，因而受到持續(xù)關注[6]。自噬體的形成依賴于一系列自噬相關蛋白(ATG)在蛋白泛素化過程中共價結合，其核心基因ATG5和ATG12亦參與了細胞凋亡的調控[7]。

本課題組在臨床實踐中發(fā)現，針對慢性復發(fā)性頑固潰瘍性結腸炎，理中湯和四神丸所體現的溫補脾腎療法往往能夠取得較好的療效，且前期研究發(fā)現，在構建的脾腎陽虛大鼠模型中，自噬相關信號通路JNK/Beclin1/Bcl-2被激活，而應用理中湯合四神丸干預后，可抑制通路關鍵因子及自噬相關蛋白LC3B表達[8-9]，故本研究繼續(xù)探討理中湯合四神丸對于潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜自噬相關基因表達的影響及結腸黏膜超微結構與凋亡形態(tài)學的改變，進一步發(fā)掘自噬在理中湯合四神丸治療潰瘍性結腸炎中發(fā)揮的作用。

1 材料

1.1 動物 60只SPF級Wistar雄性大鼠，體質量(180±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(甘)2015-0002，實驗動物使用許可證號SYXK(甘)2015-0005，飼養(yǎng)環(huán)境為12 h/12 h明暗交替光照，相對濕度50%～60%，溫度21～25 ℃，噪音<50 dB。

1.2 藥物 理中湯合四神丸原料藥材及大黃均購自甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，經同院藥劑科主任醫(yī)師楊錫倉鑒定合格，根據《中國藥典》依法炮制，人參、炒白術、干姜、炙甘草、吳茱萸、補骨脂、肉豆蔻、五味子比例為3∶3∶3∶3 :1∶4∶2∶2，按常法煎煮，冷卻后置4 ℃冰箱中備用，使用時稀釋至所需質量濃度。美沙拉嗪(批號20200406)，購自黑龍江天宏藥業(yè)股份有限公司。

1.3 試劑 2，4-二硝基苯磺酸(DNBS，批號STBH2928)，購自美國Sigma公司；氫化可的松注射液(批號1902210)，購自國藥集團容生制藥有限公司；ATG5、GAPDH抗體(貨號YM3752、YM3215)，購自美國 Immunoway公司；ATG12、DRAM1、P62抗體(貨號bs-4012R、bs-10285R、bs-2951R)，購自北京博奧森生物技術有限公司；熒光定量、反轉錄、顯影及凋亡檢測試劑盒(貨號H1001350、H3001010、S8021530、T0901011)，購自上海翌圣生物科技有限公司。

1.4 儀器 LightCycler@96型實時熒光定量聚合酶鏈式反應儀，購自德國羅氏生物系統公司；電泳儀、蛋白轉印模塊、曝光機，購自美國Bio-Rad公司；切片機，購自德國Leica公司；IX51型顯微鏡，購自日本Olympus公司；HT7700型透射電子顯微鏡，購自日本日立公司。

2 方法

2.1 分組及造模 大鼠隨機分為空白組、模型組、美沙拉嗪組(0.36 g/kg)及理中湯合四神丸低、中、高劑量組(3.5、7、14 g/kg)，除空白組外，其余各組參考文獻[10]報道及DNBS誘導結腸炎模型[11-12]制備脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠模型，并應用DNBS代替三硝基苯磺酸(TNBS)進行優(yōu)化，即灌胃大黃水煎液(13.5 g/kg)14 d+肌肉注射氫化可的松(25 mg/kg)7 d以復制脾腎陽虛大鼠模型，空白組灌胃等體積生理鹽水及注射等體積蒸餾水。脾腎陽虛證候模型復制成功后，禁食不禁水24 h，以DNBS/乙醇溶液(每只大鼠35 mg DNBS+0.25 mL 50%乙醇)緩慢注入大鼠結腸腸腔，空白組注入0.25 mL生理鹽水。

2.2 給藥及標本采集 大鼠造模成功后第21天，理中湯合四神丸低、中、高劑量組灌胃給予3.5、7、14 g/kg藥液，美沙拉嗪組灌胃給予0.36 g/kg美沙拉嗪，空白組及模型組灌胃給予等體積蒸餾水，連續(xù)14 d。末次給藥后，大鼠禁食不禁水24 h，麻醉采血后脫頸處死，低溫下迅速剖取肛門上約8 cm的結腸組織，生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分后縱向切開，一部分于4%多聚甲醛溶液中固定，另一部分于-80 ℃保存待測。

2.3 大鼠一般狀態(tài)觀察 每天觀察并記錄大鼠精神狀態(tài)、飲食量增減、活動度、糞便情況。取材后觀察固定于多聚甲醛中的大鼠結腸黏膜標本，將標本用大頭針固定于潔凈板上，0.9%氯化鈉浴液保濕，放大鏡觀察結腸黏膜受損程度，觀察腸黏膜組織糜爛、充血、水腫、潰瘍、出血等情況。

2.4 RT-qPCR法檢測大鼠結腸黏膜組織ATG5、ATG12、DRAM1、P62 mRNA表達 TRIzol法提取結腸組織總RNA，逆轉錄為cDNA擴增模板，按擴增試劑盒說明書推薦設置循環(huán)條件，2-ΔΔCT法定量分析基因表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 免疫組化法檢測結腸黏膜組織中ATG5、ATG12、DRAM1、P62表達情況 將多聚甲醛固定的結腸組織包埋于蠟塊中，切成4 μm薄片，65 ℃烘烤，脫蠟后使用檸檬酸鈉熱修復，過氧化氫封閉，血清封閉，一抗4 ℃過夜，次日二抗孵育，DAB顯色，中性樹膠封片，拍照后分析處理。

2.6 Western blot法檢測大鼠結腸黏膜組織中 ATG5、ATG12、DRAM1、P62蛋白表達 取100 mg結腸組織剪碎，使用RIPA 裂解液充分裂解并測定蛋白濃度后，將蛋白樣品加熱變性用于電泳上樣。電泳后將蛋白轉印到PVDF膜，條帶經胎牛血清封閉后孵育對應抗體(ATG5，1∶1 000；ATG12，1∶500；DRAM1，1∶1 000；P62，1∶1 000)4 ℃過夜，洗膜后孵育HRP二抗(1∶8 000)2 h，ECL顯色，并采用 Image J軟件分析結果。

2.7 電鏡觀察大鼠結腸細胞自噬情況 新鮮組織確定取材部位，迅速投入電鏡固定液4 ℃固定2～4 h。0.1 mol/L磷酸緩沖液PB(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min，1%鋨酸-0.1 mol/L PB室溫固定2 h，PB漂洗3次，每次15 min，脫水后進行滲透，即丙酮和812包埋劑(1∶1)滲透2～4 h，丙酮和812包埋劑(2∶1)滲透過夜，純812包埋劑滲透5～8 h，將純812包埋劑倒入包埋板，將樣品插入包埋板后37 ℃烤箱過夜。包埋后切片，染色后于透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

2.8 TUNEL法檢測大鼠結腸組織中凋亡細胞情況 二甲苯浸泡石蠟組織切片，脫蠟，梯度脫水后PBS洗片，PBS稀釋Proteinase K溶液，潤洗樣本，置于濕盒中避免干燥。固定好樣本后進行染色，將載玻片浸沒在裝有PI溶液的染缸內染色5 min，洗滌后于熒光顯微鏡下觀察分析樣本，(520±20)nm波長下觀察綠色熒光，460 nm波長下觀察藍色的DAPI染核。

3 結果

3.1 大鼠一般狀態(tài) 空白組大鼠飲食及大便性狀正常，精神、活動佳，毛發(fā)光亮整潔，體質量持續(xù)增長；模型組大鼠飲食飲水量減少，大便稀，甚至帶血，精神萎靡，活動量減少，弓背瞇眼，扎堆，形體消瘦，毛色枯槁；各給藥組大鼠一般情況均有明顯好轉，以美沙拉嗪組及理中湯合四神丸高劑量組最為明顯，且對于諸如精神萎靡、反應遲鈍、喜扎堆等脾腎陽虛癥狀，理中湯合四神丸組效果優(yōu)于美沙拉嗪組。

3.2 理中湯合四神丸對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織中ATG5、ATG12、DRAM1、P62 mRNA表達的影響 如表2所示，與空白組比較，模型組大鼠結腸組織中ATG5、ATG12、DRAM1 mRNA表達均升高(P<0.01)，P62 mRNA表達降低(P<0.01)；與模型組比較，除理中湯合四神丸低劑量組DRAM1 mRNA無明顯變化(P>0.05)，各給藥組大鼠結腸組織中ATG5、ATG12、DRAM1 mRNA表達均降低(P<0.01)，P62 mRNA表達升高(P<0.05，P<0.01)，其中以理中湯合四神丸中、高劑量組及美沙拉嗪組效果最為明顯。

表2 各組大鼠ATG5、ATG12、DRAM1、P62 mRNA表達比較

3.3 理中湯合四神丸對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織中ATG5、ATG12、DRAM1、P62蛋白免疫組化表達的影響 如圖1、表3所示，與空白組比較，模型組大鼠結腸組織中ATG5、ATG12、DRAM1蛋白表達升高(P<0.01)，P62蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組ATG5、ATG12、DRAM1蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)，除理中湯合四神丸中、低劑量組P62蛋白表達無明顯變化(P>0.05)外，其余給藥組P62蛋白表達均升高(P<0.01)。

表3 各組大鼠ATG5、ATG12、DRAM1、P62蛋白免疫組化表達比較

3.4 理中湯合四神丸對大鼠結腸組織中 ATG5、ATG12、DRAM1、P62蛋白表達的影響 如圖2、表4所示，與空白組比較，模型組大鼠結腸組織中ATG5、ATG12、DRAM1蛋白表達升高(P<0.01)，P62蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組ATG5、ATG12、DRAM1蛋白表達降低(P<0.01)，除理中湯合四神丸中、低劑量組P62蛋白表達無明顯變化(P>0.05)外，其余給藥組P62蛋白表達均升高(P<0.05)。

表4 各組大鼠結腸中ATG5、ATG12、DRAM1、P62 自噬相關因子蛋白含量比較

3.5 理中湯合四神丸對大鼠結腸組織電鏡下結構的影響 如圖3所示，空白組大鼠結腸(圖3A1～3A2)腸屏障相對較完整，微絨毛(Mv)排列較整齊，結構致密、粗細均一，粗面內質網(RER)結構正常，未見明顯擴張，該視野未見典型自噬小體及自噬溶酶體；模型組大鼠結腸(圖3B1～3B2)腸屏障損傷相對嚴重，部分上皮細胞崩解，細胞膜大面積破損，細胞基質游離，Mv大面積退化、脫落、消失，RER明顯擴張，脫顆粒、空泡變，自噬溶酶體(ASS)數量較多；理中湯合四神丸低劑量組大鼠結腸(圖3C1～3C2)腸屏障中度退變，Mv排列紊亂，稀疏，局部微絨毛脫落，RER輕度擴張，ASS個別存在；中劑量組大鼠結腸(圖3D1～3D2)腸屏障輕度水腫，Mv分布不均勻，RER輕度擴張，未見明顯自噬小體及自噬溶酶體典型結構；高劑量組大鼠結腸(圖3E1～3E2)腸屏障結構輕微損傷，細胞膜完整，Mv排列均勻、致密，粗細均一，個別囊膜擴張，ASS少量存在；美沙拉嗪組大鼠結腸(圖3F1～3F2)腸屏障結構輕度損傷，細胞膜完整，Mv排列稀疏，局部退化，RER未見明顯擴張，ASS個別存在。

3.6 理中湯合四神丸對大鼠結腸組織凋亡的影響 如圖4、表5所示，空白組中綠色熒光標記的凋亡細胞數量最少，凋亡細胞與總細胞重合最少，凋亡陽性細胞表達率最低；與空白組比較，模型組結腸組織細胞凋亡情況最為嚴重，凋亡細胞與總細胞重合最多，凋亡陽性細胞表達率升高(P<0.01)；與模型組比較，美沙拉嗪組與理中湯合四神丸各劑量組細胞凋亡率均有下降，凋亡細胞與總細胞重合均減少，以美沙拉嗪組和理中湯合四神丸中、高劑量組最為明顯(P<0.01)，其中理中湯合四神丸低劑量組細胞凋亡率與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表5 各組大鼠結腸組織中凋亡細胞相對面積比較

4 討論

中醫(yī)認為潰瘍性結腸炎的發(fā)病病機在于脾虛，脾虛則久瀉久利，亦因久瀉可傷腎，久病亦可及腎，故脾腎陽虛為復發(fā)性難治型潰瘍性結腸炎的最終轉歸。細胞自噬是除了細胞凋亡外的另一重要死亡調控機制，其在特定條件下，適度的激活對于細胞起到保護性的作用，而當自噬啟動不足或者過度的自噬激活則會引起細胞的損傷，甚至誘發(fā)細胞出現自噬性死亡，而自噬性細胞死亡又被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，因此自噬具有雙面性[13-14]。

自噬相關蛋白(ATG)在參與調節(jié)自噬的起始以及延伸階段，為一類自噬組成蛋白。研究發(fā)現，ATG5和ATG12等基因的編碼區(qū)核苷酸重復而導致的框移突變，可使其蛋白的表達不完整進而引起自噬的失活[15]，其耦聯與LC3轉化2個泛素化過程是自噬的關鍵[16]，可由ATG7(類泛素激活酶)和ATG10(類泛素結合酶)共同催化形成[17]，隨后與膜結合，促進自噬體形成[18]。此外,ATG12-ATG5復合物還可以充當ATG8-磷脂酰乙醇胺結合系統的E3樣連接酶，其缺失會導致自噬缺陷[19]。損傷調節(jié)自噬蛋白(DRAM1)為一種疏水蛋白[20]，在應激情況下，DRAM1可被激活，其沉默可阻斷自噬的發(fā)生，下調能夠減輕細胞自噬和死亡，對于DNA損傷情況下誘導的自噬和凋亡非常關鍵[21]。P62參與自噬溶酶體的降解過程，并且本身又可以受到自噬的調節(jié)[22-23]，其作為自噬的選擇性底物之一，表達的變化可以被看作自噬能力的指征[24]。

研究結果表明，在脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織中，自噬相關蛋白ATG5、ATG12、DRAM1表達均升高，P62表達降低，各給藥組結腸組織中ATG5、ATG12、DRAM1表達降低，P62表達升高，其中以理中湯合四神丸中、高劑量組和美沙拉嗪組最為明顯。電鏡結果顯示，模型組大鼠結腸黏膜細胞結構破壞嚴重，自噬溶酶體數量較多，而各給藥組大鼠結腸黏膜細胞組織結構均有所改善，自噬溶酶體數量亦有所減少，并且TUNEL結果顯示，理中湯合四神丸可以減輕潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜凋亡情況，提示理中湯合四神丸可能通過抑制脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織自噬相關蛋白ATG5、ATG12、DRAM1表達，同時上調P62表達，進而對結腸細胞自噬起到抑制作用，以避免其過度自噬，并緩解了結腸黏膜細胞的凋亡情況，進而對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎起到保護作用。