不同粒度熟大黃粉體學(xué)性質(zhì)及5種游離蒽醌溶出度研究

楊 菲， 常金花， 薛禾菲， 王雨欣， 劉翠哲

(承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北 承德 067000)

大黃性味苦寒，具有瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)等功效，其有效成分主要為蒽醌類，包括大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等[1-3]。大黃炮制后，活性成分會(huì)發(fā)生明顯的改變[4-5]，從而導(dǎo)致功效顯著不同，其中熟大黃經(jīng)炮制瀉下作用相對(duì)溫和，同時(shí)也具有活血化瘀、清熱解毒的功效，被衛(wèi)生部列為可用于保健食品物品名單。

超微粉碎技術(shù)是一種物料加工新技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于中藥粉碎[6-7]。研究表明，隨著粒徑減小，比表面積增大，粉體流動(dòng)性、收率降低，吸濕性及有效成分溶出速率、溶出量、相對(duì)累積溶出比率升高[8]，故以中藥材經(jīng)超微粉碎后可改善其加工性能，加快有效成分溶出，提高生物利用度和利用率[9-11]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)不同粒度大黃在單一溶出介質(zhì)中的溶出度有所研究，但尚未報(bào)道不同粒度炮制品在不同溶出介質(zhì)中的溶出情況。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同粒度熟大黃粉體學(xué)性質(zhì)及其有效成分在4種溶出介質(zhì)中的溶出情況進(jìn)行研究，可為其超微粉體的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 BFM-6A研磨混煉機(jī)(上海人民企業(yè)集團(tuán)有限公司)；XA-1固體樣本粉碎機(jī)(常州越新儀器制造有限公司)；Bettersize2600激光粒度分布儀(丹東百特儀器有限公司)；RC806溶出試驗(yàn)儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；JA2003上皿電子天平(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；Cubis MSE125P天平(江蘇科析儀器有限公司)；ZNHW智能恒溫電熱套(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；標(biāo)準(zhǔn)篩(上虞市五星沖壓篩具廠)。

1.2 試劑與藥物 熟大黃購自北京同仁堂大藥房，批號(hào)640200401，經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所蘇占輝老師鑒定為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根及根莖。蘆薈大黃素(批號(hào)110795-201710)、大黃酸(批號(hào)110757-201607)、大黃素(批號(hào)110756-201512)、大黃素甲醚(批號(hào)110758-201616)對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院；大黃酚對(duì)照品(批號(hào)20160316)購自壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。十二烷基硫酸鈉(天津百倫斯生物技術(shù)有限公司)；磷酸二氫鈉(天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)；磷酸、甲醇為色譜純(北京邁瑞達(dá)科技有限公司)；水為純凈水(天津娃哈哈食品有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 粉體制備 取適量飲片放入粉碎機(jī)中粉碎，過篩，得細(xì)粉；另取適量飲片放入研磨混煉機(jī)中分別粉碎1、4 min，得微粉Ⅰ、微粉Ⅱ。

2.2 粒徑、比表面積測(cè)定 設(shè)定參數(shù)為進(jìn)料速度7，料斗高度1.1 mm，氣壓強(qiáng)度0.2 MPa。取“2.1”項(xiàng)下細(xì)粉、微粉Ⅰ、微粉Ⅱ適量，采用激光粒度分布儀(干法)分別測(cè)定6次，取平均值，結(jié)果見表1，可知粒徑、比表面積RSD分別為1.09%、0.77%，符合相關(guān)要求。

表1 粉體粒徑、比表面積測(cè)定結(jié)果

2.3 堆密度、休止角測(cè)定

2.3.1 堆密度 取“2.1”項(xiàng)下細(xì)粉、微粉Ⅰ、微粉Ⅱ適量，質(zhì)量分別為m1、m2、m3，輕輕倒入100 mL量筒中，設(shè)置下落高度為2 cm，振動(dòng)100次，測(cè)定體積V，計(jì)算堆密度ρ0，公式為ρ0=m/V，平行6次，取平均值，結(jié)果見表2，可知堆密度RSD為1.51%，符合相關(guān)要求。

表2 粉體休止角、堆密度測(cè)定結(jié)果

2.3.2 休止角

將2個(gè)玻璃漏斗一上一下固定于鐵架臺(tái)上，從其最底端到繪圖紙的距離設(shè)為H，取“2.1”項(xiàng)下細(xì)粉、微粉Ⅰ、微粉Ⅱ適量，使其通過玻璃漏斗自由落在繪圖紙上，直到堆成最大直徑的圓錐體為止，測(cè)量直徑D，計(jì)算休止角，平行6次，取平均值，結(jié)果見表2，可知休止角RSD為3.36%，符合相關(guān)要求。

一般認(rèn)為，休止角≤30°表示流動(dòng)性好，>30°且≤40°可滿足生產(chǎn)過程中流動(dòng)性需求，>40°表示流動(dòng)性差[12]。表2顯示，隨著粒徑減小，堆密度、休止角升高，流動(dòng)性減小，其中微粉Ⅰ、Ⅱ休止角>40°，表示兩者流動(dòng)性較差。

2.4 游離蒽醌含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸(85∶15)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長254 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.4.2 溶液制備

2.4.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品蘆薈大黃素10.12 mg、大黃酸10.12 mg、大黃素10.18 mg、大黃酚10.17 mg、大黃素甲醚5.09 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇超聲溶解，放冷至室溫，甲醇定容至刻度，得貯備液，分別精密量取1.6 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇超聲混勻，定容至刻度，得到五者質(zhì)量濃度分別為16.19、16.19、16.29、16.27、8.14 mg/L的溶液，即得。

2.4.2.2 供試品溶液 取“2.1”項(xiàng)下細(xì)粉、微粉Ⅰ、微粉Ⅱ各約0.5 g，精密稱定，置于具塞平底燒瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 線性關(guān)系考察 精密稱取對(duì)照品蘆薈大黃素4.02 mg、大黃酸4.15 mg、大黃素4.02 mg、大黃酚10.11 mg、大黃素甲醚4.06 mg，混合，甲醇定容至50 mL量瓶內(nèi)，制成5個(gè)質(zhì)量濃度的溶液，分別精密吸取10 μL，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程為蘆薈大黃素Y=45.991X+130.41(r=0.999 0)，線性范圍2.51～80.4 μg/mL；大黃酸Y=37.168X-51.291(r=0.999 5)，線性范圍1.30～83 μg/mL；大黃素Y=35.401X+116.09(r=0.999 2)，線性范圍1.26～80.4 μg/mL；大黃酚Y=50.409X+411.11(r=0.999 1)，線性范圍3.16～202.2 μg/mL；大黃素甲醚Y=23.116X+58.607(r=0.999 4)，線性范圍1.27～81.2 μg/mL。

2.4.4 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰分離度理想，表明該方法專屬性良好。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取同一份對(duì)照品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積RSD分別為0.12%、0.12%、0.14%、0.69%、0.20%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取微粉Ⅱ適量，于0、4、8、12、16、20、24 h在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積RSD分別為1.9%、2.5%、0.6%、0.5%、2.1%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取微粉Ⅱ適量，按“2.4.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量RSD分別為0.33%、1.00%、0.25%、0.44%、0.75%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下細(xì)粉、微粉Ⅰ、微粉Ⅱ適量，加入對(duì)照品溶液，按“2.4.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚平均加樣回收率分別為99.41%、98.91%、98.45%、99.91%、98.70%，RSD分別為0.83%、1.40%、1.10%、0.59%、0.83%。

2.4.9 樣品含量測(cè)定 取“2.1”項(xiàng)下細(xì)粉、微粉Ⅰ、微粉Ⅱ適量，按“2.4.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 各游離蒽醌含量測(cè)定結(jié)果(%，n=6)

2.5 粉體溶出度研究

2.5.1 溶出介質(zhì)制備

2.5.1.1 水 取蒸餾水900 mL，加入3.6 g SDS，即得。

2.5.1.2 人工胃液 取8.1 mL鹽酸，加到900 mL蒸餾水中，37 ℃水浴保溫至完全溶解，加入3.6 g SDS，即得(pH=1.2)。

2.5.1.3 人工小腸液 稱取磷酸二氫鈉7.0 g、SDS 3.6 g，加到900 mL蒸餾水中，37 ℃水浴保溫至完全溶解，1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6.8，即得。

2.5.1.4 人工結(jié)腸液 稱取磷酸二氫鈉7.0 g、SDS 3.6 g，加到900 mL蒸餾水中，37 ℃水浴保溫至完全溶解，1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.4，即得。

2.5.2 測(cè)定方法 按照2020年版《中國藥典》四部通則(0931)第二法(槳法)。取溶出介質(zhì)900 mL，設(shè)定轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度為37 ℃，取粉體約400 mg，精密稱定，置于有4號(hào)膠囊殼的溶出杯中，溶出介質(zhì)水、人工胃液取樣時(shí)間為15、30、60、90、120 min，人工小腸、人工結(jié)腸液為15、30、60、90、120、180、240 min，分別取樣5 mL，等量介質(zhì)補(bǔ)足，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算溶出度，公式為溶出度=(某時(shí)間點(diǎn)成分溶出量/成分初始含量)×100%，繪制溶出曲線，見圖2～6。由此可知，微粉Ⅱ的溶出度最高，各游離蒽醌在不同溶出介質(zhì)中的溶出度分別為蘆薈大黃素，人工小腸液>水>人工結(jié)腸液>人工胃液；大黃酸，水>人工結(jié)腸液>人工小腸液>人工胃液；大黃素，人工結(jié)腸液>人工小腸液>水>人工胃液；大黃酚，人工結(jié)腸液≈人工小腸液>水>人工胃液；大黃素甲醚，人工結(jié)腸液>水>人工小腸液>人工胃液。

3 討論

研究表明，超微粉碎后會(huì)使粉體粒徑變小，粒子間相互作用力變大，粘附性增強(qiáng)，顯示出較差的流動(dòng)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著熟大黃粉體粒徑的減小，流動(dòng)性也會(huì)降低，其中細(xì)粉流動(dòng)性最好，而經(jīng)超微粉碎后微粉Ⅰ與微粉Ⅱ流動(dòng)性較差，與前期研究結(jié)果一致。

由于量子尺寸和表面效應(yīng)，粉體的細(xì)化會(huì)使中藥材粉體呈現(xiàn)新的粉體學(xué)特性，如良好的溶解性、分散性，從而增加生物利用度[13]。同時(shí)，根據(jù)Noyes-Whitney方程可知粉體的比表面積和溶解度，都與溶出速率成正比，即比表面積越大，溶解度越高，其溶出度就越好。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著熟大黃粉體粒度減小，5種游離蒽醌溶出度逐漸增高，表明超微粉碎技術(shù)可促進(jìn)上述有效成分的溶出。

本實(shí)驗(yàn)研究了熟大黃粉體在不同pH值溶出介質(zhì)中的溶出度，發(fā)現(xiàn)在人工胃液中最小。研究證實(shí)，弱堿對(duì)大黃中游離蒽醌的提取率優(yōu)于甲醇，大黃游離蒽醌較易溶于弱堿中[14]，而且該類成分在胃液中的穩(wěn)定性較差[15]。此外，微粉Ⅰ中5種游離蒽醌在人工胃液中的溶出曲線呈先增后減的趨勢(shì)，可能是溶出過程中蒽醌類成分達(dá)到超飽和狀態(tài)。

綜上所述，經(jīng)過超微粉碎后熟大黃有效成分溶出度增加，而且5種游離蒽醌均在下消化道的溶出效果最好，這為該藥材制成腸溶制劑后增加瀉下作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為相關(guān)保健品開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。