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    新疆紫草、黃花軟紫草HPLC指紋圖譜建立及化學模式識別分析

    2022-12-04 09:52:14丁文歡張雪佳樊思恩徐海燕
    中成藥 2022年10期
    關鍵詞:紫草?;?/a>阿卡

    丁文歡, 李 潔, 張雪佳, 樊思恩, 徐海燕*

    (1.新疆醫(yī)科大學中心實驗室,新疆 烏魯木齊 830054;2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部,新疆 烏魯木齊 830054;3.中國藥科大學中藥學院,江蘇 南京 211198;4.新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院,新疆 烏魯木齊 830054)

    紫草被譽為“涼血之圣藥”,活性成分為紫草素及其衍生物,有抗炎、抗菌、抗病毒等作用[1-7],為紫草科植物新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.、內(nèi)蒙紫草ArnebiaguttataBunge的干燥根[8],其中后者即《中國植物志》記載的黃花軟紫草[9]。紫草中萘醌類成分含量差異較大,導致藥材品質(zhì)參差不齊[10-12],有學者建立了新疆紫草指紋圖譜[13-16],但其所用藥材大多源于市售,會存在基源不清的可能,而且未與黃花軟紫草進行比較。

    課題組前期對野外采集的新疆紫草、黃花軟紫草中萘醌類成分進行含量測定[17-19],發(fā)現(xiàn)存在較大差異,并且不同產(chǎn)地同一藥材亦然。本實驗建立新疆紫草、黃花軟紫草HPLC指紋圖譜,并進行化學模式識別分析,以期為兩者質(zhì)量綜合評價標準提供科學依據(jù)。

    1 材料

    MS105DU型電子天平(十萬分之一,瑞士梅特勒-托利多公司);KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。β,β′-二甲基丙烯酰紫草素(批號15102821)、左旋紫草素(批號15102721)、去氧紫草素(批號15062422)、乙酰紫草素對照品(批號15120431)均由上海同田生物技術(shù)有限公司提供;β-乙酰氧基異戊酰紫草素對照品(批號P05M7F14235)由上海源葉生物技術(shù)有限公司提供;異丁酰紫草素對照品(批號wkq16101302)由四川省維克奇生物科技有限公司提供;(2-甲基正丁?;?紫草素對照品(批號AV51-LDQR)由日本化成工業(yè)株式會社提供。新疆紫草、黃花軟紫草采自新疆,經(jīng)新疆醫(yī)科大學中藥資源教研室徐海燕教授鑒定為正品,具體信息見表1。乙腈、甲酸為色譜純;石油醚(60~90 ℃)為分析純;水為超純水(由艾科超純水機制備)。

    表1 樣品信息

    2 方法

    2.1 對照品溶液制備 分別精密稱取左旋紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧、(2-甲基正丁酰基)紫草素對照品2、10、10、1、10、5、25 mg,置于25 mL量瓶中,乙腈定容至刻度,即得。取除(2-甲基正丁?;?紫草素以外的6種對照品溶液適量,置于同一10 mL量瓶中混合;另取(2-甲基正丁?;?紫草素對照品溶液3.5 mL,置于10 mL量瓶中。

    2.2 供試品溶液制備 藥材粉碎后過4號篩,取粉末約1.0 g,精密稱定,置于錐形瓶中,加入石油醚(60~90 ℃)50 mL,超聲處理30 min,冷卻,石油醚(60~90 ℃)補足減失的質(zhì)量,濾過,量取續(xù)濾液(新疆紫草10 mL、黃花軟紫草30 mL),蒸干,殘渣加乙腈溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中,乙腈定容至刻度,搖勻,即得。

    2.3 色譜條件 參考文獻[17]報道,Agilent-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相乙腈-0.05%甲酸(70∶30);體積流量1 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長275 nm;進樣量10 μL。

    2.4 方法學考察

    2.4.1 精密度試驗 取新疆紫草供試品溶液適量,在“2.3”項色譜條件下進樣測定6次,測得左旋紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧、(2-甲基正丁?;?紫草素峰面積RSD分別為0.35%、0.22%、0.53%、1.70%、0.28%、0.45%、0.24%,表明儀器精密度良好。

    2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取新疆紫草供試品溶液適量,于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.3”項色譜條件下進樣測定,測得左旋紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧、(2-甲基正丁?;?紫草素峰面積RSD分別為1.52%、0.45%、1.27%、1.84%、0.70%、1.12%、0.48%,表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.4.3 重復性試驗 精密稱取新疆紫草粉末6份,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.3”項色譜條件下進樣測定,測得左旋紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧、(2-甲基正丁?;?紫草素含量RSD分別為1.67%、1.99%、1.84%、1.02%、2.05%、1.92%、2.07%,表明該方法重復性良好。

    2.5 HPLC指紋圖譜建立

    2.5.1 共有峰確認 36批樣品按“2.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.3”項色譜條件下進樣測定,將所得色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012A版)進行峰匹配,見圖1~2,共發(fā)現(xiàn)19個色譜峰,其中共有峰5個,即F-10、F-11、F-14、F-18、F-19;18批新疆紫草共有7個共有峰,即F-6、F-10、F-11、F-14、F-16、F-18、F-19;18批黃花軟紫草有6個共有峰,即F-10、F-11、F-12、F-14、F-18、F-19,由于各批樣品均含有2-甲基正丁?;液扛?,分離效果好,故選擇其作為參照,測得相對保留時間RSD為0~0.79%,相對峰面積RSD為0~96.41%。

    2.5.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012A版)》進行相似度評價,結(jié)果見表2。由此可知,新疆紫草除Ae-5、Ae-6相似度低于0.7外,其余16批均高于0.9;黃花軟紫草除Ag-9、Ag-13相似度低于0.8外,其余16批均高于0.8;黃花軟紫草、新疆紫草之間的相似度降低。

    表2 36批樣品相似度

    2.6 聚類分析 將19個色譜峰峰面積導入Mataboanalyst進行聚類分析,結(jié)果見圖3。由此可知,距離設定為15時,36批樣品可聚為2類,2個品種之間有交叉現(xiàn)象,F(xiàn)-6、F-11、F-13、F-16、F-18、F-19在第1類樣品中較低,而在第2類樣品中較高;距離設定為10時,36批樣品可分為4類,2個品種之間無交叉現(xiàn)象,其中第1類又可分為Ⅰ類(Ae-2、Ae-3、Ae-5、Ae-6、Ae-14、Ae-16、Ae-18)和Ⅱ類(Ag-2、Ag-3、Ag-4、Ag-6、Ag-7、Ag-8、Ag-10、Ag-11、Ag-12、Ag-13、Ag-14、Ag-15、Ag-16、Ag-17),F(xiàn)-6、F-11、F-13、F-16、F-18、F-19在Ⅰ類樣品中峰面積較低,而在Ⅱ類樣品中幾乎未出現(xiàn),并且Ⅱ類樣品中F-12峰面積較大,但Ⅰ類樣品中不含該色譜峰,而第2類又可分為Ⅲ類(剩余11批新疆紫草)、Ⅳ類(剩余4批黃花軟紫草),其區(qū)別主要是所有色譜峰峰面積在Ⅳ類樣品中均較高,而Ⅲ類樣品中僅F-6、F-11、F-13、F-16、F-18、F-19峰面積較高,與相似度分析結(jié)果基本一致。

    2.7 主成分分析(PCA) 圖4顯示,前2個主成分累積貢獻率超過60%,故選擇兩者進行區(qū)分;36批樣品分布比較集中,2個品種之間有重疊部分,表明其HPLC指紋圖譜相似性較高,但大部分樣品分布與種屬一致,并且同一品種分布更集中。

    2.8 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA) 圖5顯示,解釋能力參數(shù)R2X為0.945,R2Y為0.791,預測能力參數(shù)Q2為0.662,表明數(shù)據(jù)擬合效果較好,可用于區(qū)分2個品種。再提取OPLS-DA模型中19個色譜峰峰面積的變量投影重要性(VIP)值,見圖6,可知大于1者有7個,分別為F-16(異丁酰紫草素)、F-18(β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧)、F-6(左旋紫草素)、F-19(2-甲基正丁酰基紫草素)、F-12、F-11(乙酰紫草素)、F-1,可作為差異標志物。

    3 討論

    結(jié)果顯示,新疆紫草、黃花軟紫草并非完全按照種屬歸類,而是均有重合部分,其原因為兩者均為軟紫草屬植物,親緣關系較近,并且均被2020年版《中國藥典》收錄,但新疆地域廣闊,前者在大多生長于海拔2 000~4 200 m的山地向陽坡、礫石山坡、洪積扇、草地等處,而后者大多分布在前山荒漠、礫石質(zhì)山坡、戈壁等處,生境差異較大,同一品種不同產(chǎn)地亦然。另外,藥材中化學成分的積累除了受生境、種類的影響外,也與生長年限相關,但本實驗中的新疆紫草、黃花軟紫草均為野外采集,不能確定其生長年限。

    野外調(diào)查發(fā)現(xiàn),新疆紫草根發(fā)達,栓化較明顯,色深,特異性氣味明顯;黃花軟紫草主根明顯,但不夠發(fā)達,木栓層較薄,黃白色木部所占比例較大,特異性氣味弱,兩者性狀存在明顯差異,導致新疆藥農(nóng)并未采集收購黃花軟紫草。因此,要想解決紫草野生資源短缺的問題,就應加大對其人工種植的研究,并制定政策,鼓勵新疆紫草人工栽培。

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