UPLC-MS/MS法同時測定小活絡丸中3種功效成分和3種毒性成分

錢 巖， 顧臣賢， 吳 楊， 王天宇， 李華露， 閔春艷*

(1.蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215104；2.蘇州大學，江蘇 蘇州 215006；3.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210046)

小活絡丸是一種傳統(tǒng)中藥制劑，來源于《太平惠民和劑局方》中的活絡丹，由膽南星、制川烏、制草烏、地龍、乳香(制)、沒藥(制)6味中藥制成，具有祛風散寒、化痰除濕、活血止痛的功效，用于治療風寒濕邪閉阻、痰瘀阻絡所致肢體關節(jié)疼痛、關節(jié)屈伸不利、麻木拘攣等病癥[1-5]。課題組前期對不同廠家多批次小活絡丸開展質量評價，發(fā)現(xiàn)部分樣品中的君藥制川烏、制草烏存在摻偽投料問題，勢必導致該制劑主要功效成分含量降低，從而影響藥效。

目前，對小活絡丸中烏頭類生物堿成分含量測定僅有少量報道[6-11]。因此，本實驗首次采用超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜(UPLC-MS/MS)法同時測定該制劑中功效成分苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿，以及毒性成分烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的含量[12-15]，該方法具有更高的選擇性、專屬性、靈敏度，并且樣品處理簡便快捷，可從有效性、安全性2個角度對其進行質量控制。

1 材料

Waters Acquity UPLC(配置二元泵系統(tǒng)、自動進樣器)、Waters Xevo TQ-S 質譜儀(電噴霧離子源，正離子模式)、MassLynx 4.1工作站(美國Waters公司)；Acquity BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；XP56 電子天平(精度0.001 mg)、XSE205DU電子天平(精度0.01 mg)(瑞士Mettler-Toledo公司)；SK5200HP超聲波清洗機(上?？茖С晝x器有限公司)；Milli-Q純水儀(美國Millipore公司)。

苯甲酰烏頭原堿(批號111794-200901，純度98.6%)、苯甲酰次烏頭原堿(批號111796-200901，純度99.5%)、苯甲酰新烏頭原堿(批號111795-200901，純度99.6%)、烏頭堿(批號110720-200410)、次烏頭堿(批號110798-200805，純度99.5%)、新烏頭堿(批號110799-200505)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；16批小活絡丸購自各大藥房，來源于廠家A～N，批號分別為20180504、170110、180010、20181001、180101、180005、180006、181001、20180601、4940003、20170101、180402、20180118、007808、180903、1704132。乙腈為色譜純；甲酸為分析純(體積分數(shù)98%～100%)；水為超純水(由Milli-Q純水儀制備)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters Acquity BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～2 min，23%～25%A；2～7 min，25%A；7～8 min，25%～95%A；8～11 min，95%A；11～12 min，95%～23%A)；體積流量0.4 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量2 μL。

2.2 質譜條件 Xevo TQ-S MS/MS系統(tǒng)；電噴霧離子源，正離子檢測(ESI+)；離子源溫度150 ℃；毛細管電壓2.5 kV；去溶劑氣溫度650 ℃，體積流量650 L/h；錐孔氣體積流量160 L/h；噴霧器氣流5 bar(1 bar=100 kPa)；多反應監(jiān)測(MRM)模式，其他質譜參數(shù)[16]見表1。

表1 各烏頭生物堿質譜參數(shù)

2.3 對照品溶液制備 精密稱取對照品苯甲酰烏頭原堿2.323 mg、苯甲酰次烏頭原堿2.063 mg、苯甲酰新烏頭原堿2.320 mg、烏頭堿2.807 mg、次烏頭堿2.075 mg、新烏頭堿1.865 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 供試品溶液制備 精密稱取本品9 g，剪碎，精密加入4.5 g硅藻土，混合研細，取約3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，稱定質量，超聲處理30 min(溫度控制在25 ℃以下)，甲醇補足減失的質量，搖勻，離心，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液Ⅰ，用于測定烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿含量。精密量取1 mL，置于100 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液Ⅱ，用于測定苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿含量。

2.5 陰性樣品溶液制備 取膽南星18 g、地龍18 g、乳香6.6 g、沒藥6.6 g，粉碎成細粉，過篩，混勻，加入60 g煉蜜制成大蜜丸，每丸3 g，作為陰性樣品，按“2.4”項下方法制備，即得。

2.6 專屬性考察 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，結果見圖1～3。由此可知，陰性樣品溶液中未出現(xiàn)與供試品溶液中對應成分保留時間一致的色譜峰，表明它對檢測無干擾，該方法專屬性良好。

2.7 線性關系考察 精密量取對照品溶液適量，甲醇稀釋成系列質量濃度，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，再以信噪比(S/N)約為10時測定定量限，約為3時測定檢測限，結果見表2，可知各烏頭生物堿在各自范圍內(nèi)線性關系良好。

表2 各烏頭生物堿線性關系

2.8 精密度試驗 取對照品溶液(苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿質量濃度分別為0.035、0.031、0.035、0.042、0.031、0.028 ng/mL)適量，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定6次，測得苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿峰面積RSD分別為1.15%、1.86%、2.42%、0.89%、1.35%、1.45%，表明儀器精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗 取本品適量，按“2.4”項下方法制備供試品溶液Ⅰ、Ⅱ，取兩者與對照品溶液(烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿質量濃度分別為132.781、99.072、88.672、103.096、96.017、100.208 ng/mL)適量，于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，測得供試品溶液Ⅰ中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿峰面積RSD分別為1.71%、2.07%、3.29%，供試品溶液Ⅱ中苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿峰面積RSD分別為1.55%、1.34%、1.46%，對照品溶液中苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿峰面積RSD分別為0.51%、0.58%、0.68%、1.10%、0.86%、0.87%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 重復性試驗 精密稱取同一批本品6份，按“2.4”項下方法制備供試品溶液Ⅰ、Ⅱ，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，測得烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿含量RSD分別為1.10%、1.05%、5.25%、2.69%、2.46%、2.84%，表明該方法重復性良好。

2.11 加樣回收率試驗 精密稱取“2.4”項下細粉1.5 g，共9份，分別按50%、100%、150%水平精密加入50 mL對照品溶液，按“2.4”項下方法制備供試品溶液Ⅰ、Ⅱ，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，計算回收率。結果，烏頭堿平均加樣回收率為102.14%，RSD為5.75%；次烏頭堿平均加樣回收率為100.65%，RSD為2.98%；新烏頭堿平均加樣回收率為98.33%，RSD為7.88%；苯甲酰烏頭原堿平均加樣回收率為101.30%，RSD為5.00%；苯甲酰次烏頭原堿平均加樣回收率為101.90，RSD為4.07%；苯甲酰新烏頭原堿平均加樣回收率為100.80%，RSD為4.47%。

2.12 樣品含量測定

取16批樣品，按“2.4”項下方法制備供試品溶液Ⅰ，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，結果見表3、圖4A，可知烏頭堿含量分布范圍為(0.574±0.490)μg/g，即0.084～1.064 μg/g，有3批(T8、T9、T10)在此范圍外。根據(jù)2020年版《中國藥典》一部小活絡丸烏頭堿限量，折算出烏頭堿限度為不得超過30 μg/g，表明上述樣品均未超標。

2020年版《中國藥典》一部制川烏和制草烏項下規(guī)定，烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿總含量不得超過0.040%，結合小活絡丸處方，折算出該制劑中三者總含量應不得超過75 μg/g，16批樣品均未超標。圖4B顯示，上述3種成分總含量分布范圍為(7.216±7.441)μg/g，即0～14.657 μg/g，有2批(T10、T11)在此范圍外，總體上較安全。

取16批樣品，按“2.4”項下方法制備供試品溶液Ⅱ，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，結果見表3。2020年版《中國藥典》一部制川烏項下規(guī)定，苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿總含量應在0.070%～0.15%范圍內(nèi)；制草烏項下規(guī)定，上述3種成分總含量應在0.020%～0.070%范圍內(nèi)，參照兩者限度值(取0.020%～0.15%)，結合小活絡丸中制川烏、制草烏處方量，推算該制劑中三者總含量應在37～280 μg/g范圍內(nèi)。圖4C顯示，苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿總含量分布范圍為(175.75±93.579)μg/g，即82.171～269.329 μg/g，有2批(T4、T14)在此范圍外且超出擬定限度，即有14批分布較集中。

表3 各烏頭生物堿含量測定結果(μg/g)

3 討論

結果顯示，16批小活絡丸中烏頭堿含量及烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿總含量均符合擬定標準限度，但有2批樣品中苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿總含量超過上限值；14批樣品中功效成分、毒性成分含量均相對集中，表現(xiàn)出較好的質量均一性。但本實驗設定的小活絡丸功效成分含量限度范圍較大，是否合理尚不明確，需要臨床實踐和藥理學、毒理學研究的進一步支持。

另外，除T14外，有藥材摻偽的樣品(T11～T13、T15～T16)中功效成分含量均在擬定限度范圍內(nèi)，推斷上述現(xiàn)象無嚴重影響，但若其含量超過上限值，則廠家應注意制川烏、制草烏質量及生產(chǎn)工藝的控制。對于小活絡丸這種所含毒性成分也是有效成分的中藥制劑而言，應結合服用量、處方配伍、治療療程、傳統(tǒng)經(jīng)驗，利用現(xiàn)代分析技術建立更科學合理的質量控制標準，規(guī)范該制劑質量，從而保證其臨床用藥的安全有效。