恩格列凈對(duì)大鼠造影劑相關(guān)急性腎損傷的作用及其機(jī)制*

胡陶，王明亮，王武帥，何瀅蓉，楊曦，孫雄山，王強(qiáng)△

（1西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川 成都 610083；3西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610031）

根據(jù)《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2021》，冠心病的發(fā)病率和死亡率逐年增高，隨著經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）的廣泛開展，冠心病的治療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，然而PCI術(shù)后較為常見的并發(fā)癥造影劑相關(guān)急性腎損傷（contrast-associated acute kidney injury，CA-AKI）的發(fā)病率一直居高不下，尤其在糖尿病合并冠心病的患者中高發(fā)，嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后［1］。恩格列凈（empagliflozin，EMPA）屬于鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2抑 制 劑（sodium-glucose cotransporter-2 inhibitor，SGLT-2i），通過(guò)抑制腎臟對(duì)葡萄糖的重吸收，使過(guò)量的葡萄糖從尿液中排出，從而發(fā)揮降糖作用。最新一系列研究證實(shí)，恩格列凈除降低血糖外，還具有心血管保護(hù)效應(yīng)，可顯著降低心力衰竭患者住院率和心血管患者死亡率等，改善了患者的預(yù)后和生存質(zhì)量［2-4］。目前恩格列凈被廣泛應(yīng)用于糖尿病和心血管疾病的治療，然而恩格列凈對(duì)造影劑相關(guān)急性腎損傷的作用尚不清楚。

本研究擬通過(guò)構(gòu)建大鼠CA-AKI模型，觀察恩格列凈對(duì)大鼠造影劑相關(guān)急性腎損傷的防治作用，并初步探討其可能的機(jī)制，旨在為糖尿病合并冠心病患者的CA-AKI防治提供實(shí)驗(yàn)參考。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，6～8周齡，230～250 g，共40只，購(gòu)自于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（湘）2019-0004，所有程序均符合機(jī)構(gòu)規(guī)定，并經(jīng)中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 主要材料

碘海醇、N-ω硝基-L-精氨酸甲酯購(gòu)于MedChem-Express；吲哚美辛購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；EMPA購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；TUNEL試劑盒購(gòu)于廣州銳博生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)試盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒購(gòu)自于南京建成生物工程研究所。

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理將40只SPF級(jí)6～8周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分配為對(duì)照（control）組、EMPA組、CA-AKI組和CA-AKI+EMPA組。所有大鼠均在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，條件為12/12 h明暗循環(huán)，濕度為50%～60%，溫度為22～24℃，并提供食物和水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。Control組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后連續(xù)7 d予以生理鹽水（1.5 mg·kg-1·d-1）灌胃；EMPA組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后連續(xù)7 d予以恩格列凈（1.5 mg·kg-1·d-1）灌胃；CA-AKI組大鼠禁水16 h，參照前期方法［5-6］建立CA-AKI模型：首先于尾靜脈注射吲哚美辛（10 mg/kg），其次分別于吲哚美辛注射后15 min和30 min經(jīng)尾靜脈注射N-ω硝基-L-精氨酸甲酯（10 mg/kg）和碘海醇（3g I/kg）；EMPA+CA-AKI組適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后連續(xù)7 d予以恩格列凈（1.5 mg·kg-1·d-1）灌胃，禁水16 h后，余處理同CA-AKI組造模方式。同時(shí)予以足夠的食物及飲水喂養(yǎng)，注射碘海醇后12 h進(jìn)行安樂(lè)死，經(jīng)內(nèi)眥靜脈叢采取血液及摘取雙腎臟。

3.2 腎功能檢測(cè)驗(yàn)證CA-AKI模型穩(wěn)定性經(jīng)內(nèi)眥靜脈叢收集各組血液，靜置20 min，2 464×g離心20 min，收集上層血清。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行血清肌酐（serum creatinine，SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、胱抑素C（cystatin C，Cys-C）及肌酐清除率（creatinine clearance rate，CLCR）水平檢測(cè)，CAAKI定義為SCr高于基線值25%［7］。

3.3 腎臟組織HE染色4%多聚甲醛固定腎臟組織，脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟，蘇木精、伊紅染色，脫水封片，于顯微鏡下觀察各組腎臟組織病理改變情況，并進(jìn)行圖像采集。病理學(xué)變化主要包括：腎小管上皮細(xì)胞腫脹、管間出血、刷狀緣丟失、細(xì)胞質(zhì)空泡變性等。隨機(jī)選取10個(gè)髓質(zhì)部視野，根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分（0～4分）［8］：0分：無(wú)腎小管損傷；1分：受損腎小管小于20%；2分：受損腎小管為21%～50%；3分：受損腎小管＞50%；4分：所有上皮細(xì)胞完全破壞。

3.4 腎臟組織TUNEL染色固定各組腎臟組織經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，切片、脫蠟，于超純水中浸泡5 min；檸檬酸微波修復(fù)8 min，PBS洗3次，每次5 min；暗處配制TUNEL熒光孵育液于37℃孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；加DAPI染核15 min，PBS沖洗；甘油明膠封片，掃描并采集圖像，每張切片先于100倍下觀察全部組織，再于400倍視野下采集圖像，并進(jìn)行凋亡細(xì)胞分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

3.5 Western blot分析取各組腎臟組織50 mg，加入1 mL裂解緩沖液，充分碾磨，并于冰上裂解30 min，將其吸入至EP管中，于4℃、12 000×g條件下離心30 min，使用蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量。將各組蛋白分別加入電泳道中，通過(guò)10%SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5% BSA溶液封閉1 h，按照β-actin（1∶5 000）、Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶1 000）、caspase-3（1∶1 000）、細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt-C；1∶1 000）分別稀釋Ⅰ抗孵育，4℃過(guò)夜。次日復(fù)溫30 min，TBST洗膜30 min，Ⅱ抗孵育1 h，再行TBST洗膜30 min，于發(fā)光液下顯影，Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3.6 免疫組織化學(xué)染色石蠟包埋后切片、脫蠟至水，將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液（PH 6.0），微波爐高火加熱10 min進(jìn)行抗原修復(fù)，放入3%雙氧水，室溫10 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加山羊血清封閉液封閉20 min，滴加Ⅰ抗，4℃過(guò)夜后PBS洗滌，滴加Ⅱ抗，37℃孵育30 min后再次PBS洗滌，滴加DAB顯色液，室溫顯色，然后蒸餾水洗滌切片，終止顯色。經(jīng)蘇木素復(fù)染3 min，中性樹膠封片，采集圖像，分析數(shù)據(jù)。

3.7 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)取適量血清標(biāo)本，按照試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)MDA含量及SOD和GSH-Px活性。使用分光光度儀分別檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm、532 nm、600 nm、560 nm、412 nm處的吸光度（A）值，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組之間的差異通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，多組之間通過(guò)單因素方差分析進(jìn)行比較。以P＜0.05為有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠CA-AKI模型的建立

分別于不同時(shí)點(diǎn)（造影劑注射前及造影劑注射后6 h、12 h和24 h）檢測(cè)大鼠SCr、BUN、Cys-C和CLCR的水平。大鼠SCr、Cys-C和BUN水平在造影劑注射后逐漸升高，于造影劑注射12 h后達(dá)到高峰，后逐漸下降，CLCR在造影劑注射后逐漸下降，于造影劑注射后12 h后達(dá)到最低，后逐漸升高，見圖1。HE染色結(jié)果顯示，腎小管病理?yè)p傷程度于造影劑注射后逐漸加重，于造影劑注射12 h后病理?yè)p傷明顯，出現(xiàn)腎小囊腔擴(kuò)張，腎小球萎縮壞死，腎小管彌漫性脂肪變性、擴(kuò)張，局部間質(zhì)血管、腎小球毛細(xì)血管充血、淤血等現(xiàn)象，見圖2。

Figure 1.Effect of contrast medium on renal function in rats.The levels of SCr（A），BUN（B），Cys-C（C）and CLCR（D）before and after injected with contrast medium at different time points（0，6，12 and 24 h）in the rats.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs 0 h group.圖1 造影劑對(duì)大鼠腎臟功能的影響

2 恩格列凈對(duì)大鼠CA-AKI的影響

與CA-AKI組比較，恩格列凈干預(yù)后，大鼠血清SCr，BUN和Cys-C水平下降（P＜0.05），CLCR水平上升（P＜0.01），見圖3。HE染色顯示：與CA-AKI組比較，恩格列凈干預(yù)后，腎小管病理?yè)p傷評(píng)分顯著降低（P＜0.01），見圖4。

3 恩格列凈對(duì)大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)TUNEL染色觀察腎臟細(xì)胞凋亡情況顯示，造影劑注射引起大鼠腎臟細(xì)胞凋亡顯著增加（P＜0.01）；與CA-AKI組比較，恩格列凈干預(yù)后，大鼠腎臟細(xì)胞凋亡率顯著下降（P＜0.01），見圖5。進(jìn)一步通過(guò)Western blot和免疫組化染色檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，造影劑注射后導(dǎo)致大鼠腎臟促凋亡相關(guān)蛋白（caspase-3、Bax和Cyt-C）表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；而恩格列凈可顯著降低大鼠腎臟促凋亡相關(guān)蛋白（caspase-3、Bax和Cyt-C）的表達(dá)，并上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)（P＜0.01），見圖6、7。

Figure 2.Effect of contrast medium on renal pathological damage in rats（HE staining，scale bar=20μm）.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs 0 h group.圖2 造影劑對(duì)大鼠腎臟的病理?yè)p傷

Figure 3.Effect of empagliflozin（EMPA）on renal function in rats.The levels of SCr（A），BUN（B），Cys-C（C）and CLCR（D）with different treatments in the rats.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs CA-AKI group.圖3 恩格列凈對(duì)大鼠CA-AKI腎功能的影響

Figure 4.Effect of empagliflozin（EMPA）on contrast-induced renal pathological damage in rats（HE staining，scale bar=20μm）.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CA-AKI group.圖4 恩格列凈對(duì)大鼠腎小管病理?yè)p傷的影響

Figure 5.Effect of empagliflozin（EMPA）on contrast-induced renal cell apoptosis in rats（TUNEL staining，scale bar=20μm）.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CA-AKI group.圖5 TUNEL染色分析恩格列凈對(duì)大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響

Figure 6.Effects of empagliflozin（EMPA）on apoptosis-related proteins（Bax，Cyt-C，caspase-3 and Bcl-2）in kidneys detected by Western blot.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CA-AKI group.圖6 恩格列凈對(duì)腎臟組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

4 恩格列凈對(duì)大鼠腎臟氧化應(yīng)激的影響

通過(guò)相應(yīng)試劑盒檢測(cè)SOD、GSH-Px活性和MDA含量評(píng)估大鼠腎臟的氧化應(yīng)激情況，造影劑注射引起大鼠腎臟組織MDA水平顯著增加、SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.01）；與CA-AKI組比較，恩格列凈顯著增加大鼠腎臟SOD和GSH-Px活性，并降低MDA水平（P＜0.01），見圖8。

Figure 7.Immunohistochemical staining detection of renal apoptosis-related proteins（scale bar=40μm）.Mean±SD.n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CA-AKI group.圖7 腎臟組織凋亡相關(guān)蛋白的免疫組織化學(xué)染色情況

Figure 8.Effect of empagliflozin（EMPA）on renal oxidative stress in rats.The SOD activity（A），GSH-Px activity（B）and MDA content（C）with different treatments in the rats.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CA-AKI group.圖8 恩格列凈對(duì)大鼠腎臟氧化應(yīng)激的影響

討 論

隨著心血管介入技術(shù)的普及和介入手術(shù)量的日益增多，CA-AKI成為臨床常見問(wèn)題，發(fā)生于診斷和介入程序中血管內(nèi)注射造影劑后，研究顯示，在PCI治療患者中CA-AKI發(fā)生率可達(dá)10%～25%，尤其以糖尿病合并冠心病患者為主［9］。既往研究提示CAAKI的發(fā)生可能與氧化應(yīng)激、腎小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)，但CA-AKI發(fā)生的具體機(jī)制尚未完全闡明。目前臨床實(shí)踐指南推薦水化作為預(yù)防CA-AKI的基礎(chǔ)，然而，預(yù)防性水化治療在保護(hù)腎功能方面的有效性還沒(méi)有得到充分研究證據(jù)，同時(shí)N-乙酰半胱氨酸、他汀類藥物等干預(yù)措施的有效性同樣存在一定爭(zhēng)議。因此，需尋找有效的預(yù)防和治療CA-AKI的藥物。

SGLT-2i可降低心衰患者住院率和心血管患者死亡率，目前廣泛應(yīng)用于糖尿病和心血管疾病的治療［10-11］。課題組前期實(shí)驗(yàn)提示，SGLT-2i可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和心肌炎癥反應(yīng)，改善心肌重構(gòu)，從而發(fā)揮心血管保護(hù)作用［12］。恩格列凈作為SGLT-2i類藥物，作用于SGLT-2受體的MAP17亞基，形成SGLT2-MAP17復(fù)合物，改變細(xì)胞膜電位差，保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞，降低糖尿病患者的腎臟損傷［13］。然而，恩格列凈能否減輕造影劑對(duì)腎臟的損傷，目前尚無(wú)相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠CA-AKI模型證實(shí)，恩格列凈可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，降低CA-AKI的發(fā)生。氧化應(yīng)激導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞氧自由基生成增加和清除能力下降，使氧自由基蓄積于細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞氧化障礙，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損害或凋亡，進(jìn)而發(fā)生CA-AKI。研究證實(shí)，Nrf2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可加重造影劑對(duì)小鼠腎臟的損害[14]。本研究中，恩格列凈可使大鼠血清MDA含量下降，SOD和GSH-Px活性增加，提示恩格列凈可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激進(jìn)而減輕腎臟損傷。既往相關(guān)研究證實(shí)，CaMKⅡ/NFAT通路激活可促進(jìn)腎小管上皮上皮細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)還觀察到，恩格列凈干預(yù)后，TUNEL染色提示腎臟細(xì)胞凋亡率較造影劑組顯著下降，同時(shí)腎臟促凋亡蛋白caspase-3、Bax和Cyt-C表達(dá)減少、抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著增加，提示恩格列凈可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)防治CA-AKI的發(fā)生發(fā)展。

綜上，恩格列凈可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，減輕造影劑對(duì)大鼠腎臟的損傷，從而預(yù)防CAAKI的發(fā)生發(fā)展。然而，由于本研究對(duì)象為SD大鼠，與臨床患者有一定差異，需要臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證恩格列凈對(duì)造影劑相關(guān)急性腎損傷的防治作用。此外，恩格列凈是如何調(diào)節(jié)腎臟細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激途徑的，我們將在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中探討。