金復(fù)康調(diào)控免疫衰老抑制肺癌轉(zhuǎn)移

姚望，闕祖俊，姚嘉良，于盼，羅斌，田建輝,

0 引言

根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）發(fā)布的報(bào)告顯示，癌癥是全世界的一個(gè)主要死因，2020年近1 000萬例（近六分之一）死亡由癌癥導(dǎo)致，其中肺癌患者所占比例最高。雖然近年來惡性腫瘤總體死亡率較前下降，但肺癌造成的死亡人數(shù)仍高居所有惡性腫瘤之首[1]。

流行病學(xué)研究顯示，肺癌的發(fā)生與人口老齡化水平關(guān)系密切[2-4]，衰老可能是導(dǎo)致肺癌發(fā)病率上升的原因[5]。目前大部分研究都關(guān)注免疫衰老與腫瘤發(fā)病的關(guān)系，但與腫瘤轉(zhuǎn)移的聯(lián)系仍不明確。

田建輝教授針對肺癌轉(zhuǎn)移的亞臨床階段提出“正虛伏毒”是肺癌發(fā)病和轉(zhuǎn)移的核心病機(jī)[6]，其中“正虛”主要指人體增齡性免疫衰老及其誘導(dǎo)的免疫監(jiān)視功能下降和免疫逃逸、神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)功能紊亂等，導(dǎo)致人體全身抗癌能力下降，該學(xué)說核心論文獲得2019年第四屆科協(xié)優(yōu)秀論文遴選計(jì)劃[7]。本研究從免疫衰老介導(dǎo)外周免疫抑制角度揭示“正虛伏毒”的生物學(xué)基礎(chǔ)，探索免疫衰老與肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并進(jìn)一步驗(yàn)證扶正中藥金復(fù)康口服液通過調(diào)控免疫衰老防治肺癌轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及動物

采用小鼠肺腺癌Lewis細(xì)胞結(jié)合熒光素酶構(gòu)建2LL-luc-GFP細(xì)胞株（由上海中醫(yī)藥大學(xué)朱詩國教授贈予）。近交系C57BL/6小鼠購自杭州子源實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司[許可證號為SCXK（浙）2019-0004]，雄性，15月齡30只；6月齡50只；2月齡30只。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境為無特殊病原體級屏障系統(tǒng)。環(huán)境參數(shù)為溫度（22±2）℃，相對濕度（55±10）%，12 h晝夜交替。小鼠自由攝食和飲水，造模前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理委員會審核。

1.2 藥物和試劑

FITC Anti-Mo CD3 抗體（批號100204，美國Biolegend公司）。APC Anti-Mo NK1.1抗體（批號108710，美國Biolegend公司）。PE/Cy7 Anti-Mo CD62L抗體（批號B269976，美國Biolegend公司）。PE Anti-Mo CD196抗體（批號B309195，美國Biolegend公司）。PE Anti-Mo CD4抗體（批號1923424，美國Invitrogen公司）。PerCP-Cy5.5 Anti-Hu/Mo CD44抗體（批號2142979，美國Invitrogen公司）。紅細(xì)胞裂解液（批號6208846，美國BD公司）。1%鹽酸酒精溶液、蘇木精染液、伊紅染液均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

MCO-18AIC型CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），5430R型高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），DMI3000B型熒光倒置顯微鏡（德國Leica公司），分析型流式細(xì)胞儀（FACSVerse flow cytometer，美國BD公司）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

取培養(yǎng)基DMEM，加10%胎牛血清、1%雙抗（100 u/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素），將消化后的2LL細(xì)胞與配置好的培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 小鼠分組

將所有小鼠按照年齡分為15月齡、6月齡、2月齡三組，每組各30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后造模。余下20只6月齡小鼠按照體質(zhì)量分為10個(gè)等級，采用隨機(jī)數(shù)字法將同一質(zhì)量等級的2只小鼠分為0.9%NaCl組和金復(fù)康口服液組，避免小鼠體質(zhì)量差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始給藥，兩周后造模。

1.6 構(gòu)建小鼠肺癌移植瘤模型

將對數(shù)生長期的2LL-luc-GFP細(xì)胞消化離心后，用0.9%NaCl重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/毫升。將小鼠用固定器固定后，小鼠尾靜脈注射0.1 ml細(xì)胞懸液。

1.7 小鼠給藥方法

將0.9%NaCl組和金復(fù)康給藥組小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，開始灌胃給藥。金復(fù)康給藥組每次灌胃0.2 ml金復(fù)康口服液流浸膏（批號：20200704），連續(xù)灌胃42天；0.9%NaCl組每次灌胃等劑量的0.9%NaCl。

1.8 觀察指標(biāo)及方法

1.8.1 活體成像法 對小鼠腹腔注射熒光素酶底物，濃度為15 mg/ml，注射量10 μl/g，10 min后置入麻醉機(jī)，以異氟烷吸入麻醉5 min，再放入活體熒光成像儀，進(jìn)行圖像拍攝。觀察小鼠肺轉(zhuǎn)移成瘤情況。

1.8.2 小鼠肺HE染色法 完整分離小鼠的雙肺標(biāo)本，組織標(biāo)本用0.9%NaCl清洗后，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透明和浸蠟，進(jìn)行石蠟包埋，切成3.5 μm厚度的切片，HE染色后，用中性樹膠封片。根據(jù)HE染色結(jié)果判定小鼠肺轉(zhuǎn)移發(fā)生情況。

1.8.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血免疫細(xì)胞 潔凈流式上樣管取100 μl小鼠外周血，加入5 μl的BSA封閉5 min。再加入相應(yīng)抗CD3、CD4、CD44、CD62L、CD196、NK1.1抗體，避光孵育20 min后，加入紅細(xì)胞裂解液，裂解8 min，當(dāng)上樣管細(xì)胞懸液澄清時(shí)，1 400 r/min離心4 min，棄上清液，加入2 ml PBS重懸清洗，1 400 r/min離心4 min，重復(fù)清洗2次后，棄上清液，加入300 μl NS重懸，流式細(xì)胞儀檢測。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 衰老對小鼠肺癌轉(zhuǎn)移的影響

通過小鼠尾靜脈注射小鼠肺癌細(xì)胞造模后第4周對小鼠進(jìn)行活體成像分析，結(jié)合取材小鼠肺部組織HE染色結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，15月齡小鼠較2月齡小鼠肺部轉(zhuǎn)移瘤成瘤率明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005），6月齡小鼠較2月齡小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤成瘤率差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.03），15月齡小鼠與6月齡小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤成瘤率有差異趨勢，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.472），提示衰老小鼠更容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，見圖1。

圖1 小鼠轉(zhuǎn)移瘤活體成像和HE染色結(jié)果Figure 1 In vivo imaging of metastatic tumor in mice and HE staining results

2.2 金復(fù)康口服液對小鼠生存率的影響

對實(shí)驗(yàn)小鼠生存時(shí)間行Cox分析，結(jié)果顯示造模后第9天0.9%NaCl組小鼠開始出現(xiàn)死亡，截至造模后49天，金復(fù)康組小鼠死亡3只，0.9%NaCl組死亡5只，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.230），見圖2。

圖2 造模后衰老小鼠累積生存率Figure 2 Cumulative survival ratio of aging mice after modeling

2.3 金復(fù)康抗免疫衰老作用

對肺癌轉(zhuǎn)移及金復(fù)康口服液灌胃兩次實(shí)驗(yàn)小鼠取材的外周血進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果顯示，衰老小鼠外周血記憶CD4+T細(xì)胞出現(xiàn)與免疫衰老相關(guān)的比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2月齡vs.6月齡，P=0.041；2月齡vs.15月齡，P=0.041），6月齡與15月齡間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.953），其余記憶效應(yīng)T細(xì)胞未出現(xiàn)顯著免疫衰老表型，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血記憶T細(xì)胞亞群比例Figure 3 Flow cytometry results for memory T cells subset percentage in peripheral blood of mice

各年齡組小鼠的NK細(xì)胞比例隨著小鼠年齡的上升而下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2月齡vs.15月齡，P<0.001；6月齡vs.15月齡，P=0.001），出現(xiàn)免疫抑制的免疫衰老表征，2月齡與6月齡間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.203）。而金復(fù)康口服液灌胃組小鼠較0.9%NaCl組小鼠外周血NK細(xì)胞比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.029）。說明金復(fù)康口服液具有調(diào)控小鼠外周血NK細(xì)胞比例，抗免疫衰老作用，見圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血NK細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Figure 4 Flow cytometry results for NK cells percentage in peripheral of mice

3 討論

免疫衰老是衰老的重要特征，這一概念由Walford在1969年提出，被認(rèn)為在腫瘤發(fā)病過程中起到至關(guān)重要的作用[3]。免疫衰老涵蓋各級免疫器官與各種免疫細(xì)胞的衰老變化，臨床表現(xiàn)為老年人的抗感染能力降低、疫苗反應(yīng)減弱、自身免疫性疾病增多、慢性炎性反應(yīng)持續(xù)和惡性腫瘤發(fā)病率上升等[8]。而衰老會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)、促炎因子分泌增加、氧化應(yīng)激產(chǎn)生而引起慢性炎性反應(yīng)狀態(tài)，促進(jìn)免疫衰老，造成免疫監(jiān)視減弱，促進(jìn)免疫逃逸。研究顯示，增齡與腸道菌群多樣化呈負(fù)相關(guān)[9]，衰老的腸道菌群降低了樹突狀細(xì)胞對腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的誘導(dǎo)，并增強(qiáng)腫瘤病灶中髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的浸潤[10]。衰老同樣導(dǎo)致促炎因子TNF-α和IL-6水平增加，導(dǎo)致單核-巨噬細(xì)胞活化，進(jìn)而產(chǎn)生老年人慢性炎性反應(yīng)狀態(tài)[11]?；钚匝酰╮eactive oxygen species,ROS）水平則與衰老呈正相關(guān)，腸道菌群作用機(jī)制可能與NADPH氧化酶Nox被激活有關(guān)[12]。ROS會通過直接攻擊附近的線粒體膜和線粒體DNA，導(dǎo)致線粒體功能障礙和更多的ROS產(chǎn)生，引起氧化應(yīng)激，同樣導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[13]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，健康人群隨著年齡增高出現(xiàn)典型的免疫衰老，初始T 細(xì)胞（CD4+CD45RA+）、T細(xì)胞總?cè)海–D3+）、細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD3+CD8+）、CD4+/CD8+比值降低，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+CD25+）升高[14-15]，促進(jìn)了外周免疫抑制環(huán)境的形成，進(jìn)而導(dǎo)致循環(huán)腫瘤細(xì)胞逃逸，引起腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，衰老可導(dǎo)致小鼠尾靜脈肺移植瘤成瘤率上升，出現(xiàn)記憶CD4+T細(xì)胞比例上升和NK細(xì)胞比例下降等免疫衰老表征，而NK細(xì)胞豐度下降的免疫抑制正是導(dǎo)致肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[14]。金復(fù)康口服液具有抗肺癌轉(zhuǎn)移作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)外周血NK細(xì)胞比例有關(guān)。

《醫(yī)宗必讀》說：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”，說明腫瘤的形成是正氣不足后邪氣內(nèi)侵所致，正虛是腫瘤發(fā)生的前提條件，癌毒是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的根本原因。因虛致瘀，或留或積，久居一處而不散，產(chǎn)生的“癥瘕積聚”。這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為腫瘤的發(fā)生與機(jī)體免疫紊亂變化的前提相一致。而田建輝教授認(rèn)為“正虛伏毒”不但是腫瘤發(fā)生，也是腫瘤轉(zhuǎn)移的基本發(fā)病機(jī)制，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中“正虛”主要指人體增齡性免疫衰老及其誘導(dǎo)的免疫監(jiān)視功能下降和免疫逃逸的發(fā)生，導(dǎo)致全身抗癌能力下降，從而不能制約各種毒邪；而“伏毒”指術(shù)后患者體內(nèi)已經(jīng)存在發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell,CSC）和CTC、休眠腫瘤細(xì)胞等。本研究從增齡性免疫衰老介導(dǎo)的外周免疫抑制狀態(tài)出發(fā)，驗(yàn)證了衰老小鼠外周血NK細(xì)胞減少和記憶CD4+T細(xì)胞增多的“正虛”免疫衰老表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)衰老對于肺癌轉(zhuǎn)移具有顯著促進(jìn)作用。同時(shí)課題組前期臨床已驗(yàn)證，扶正中藥金復(fù)康具有抗肺癌轉(zhuǎn)移發(fā)生作用[16]，本研究初步探索了其抗肺癌轉(zhuǎn)移作用機(jī)制主要通過調(diào)節(jié)NK細(xì)胞比例，揭示了腫瘤轉(zhuǎn)移核心病機(jī)“正虛伏毒”的生物學(xué)基礎(chǔ)和形成機(jī)制，豐富了“扶正治癌”的學(xué)術(shù)思想。