細(xì)胞焦亡的生物學(xué)機(jī)制及其在乳腺癌中的研究進(jìn)展

竇赫，馬爽，邾月，劉宇琪，肖敏

0 引言

近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率呈上升趨勢，中國每年惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率居全世界首位[1]。乳腺癌已經(jīng)成為女性最常見的惡性疾病，每年我國新發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者為40萬例，占女性惡性腫瘤的16.5%。乳腺癌目前已成為嚴(yán)重影響女性身體健康的一種惡性腫瘤[2]。對于乳腺癌，我們提倡盡量做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的“三早”預(yù)防。乳腺癌的治療主要分為以手術(shù)和放療為主的局部治療和以化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療為主的全身系統(tǒng)治療。

細(xì)胞死亡普遍存在于生物界中，細(xì)胞死亡形式主要包括細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、內(nèi)源性死亡、壞死性凋亡等[3]。除壞死與凋亡兩種常見的死亡形式外，隨著研究的不斷進(jìn)展，細(xì)胞焦亡也引起了越來越多的關(guān)注，不同于其他細(xì)胞死亡形式，細(xì)胞焦亡可以更加迅速地引起炎性反應(yīng)[4]，它不僅與人體的免疫系統(tǒng)緊密相連，在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)歸中也起到了重要作用，本文將就細(xì)胞焦亡的生物學(xué)機(jī)制及其在乳腺癌中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 細(xì)胞焦亡的定義

細(xì)胞焦亡的發(fā)現(xiàn)要追溯到二十世紀(jì)80年代。1986年，F(xiàn)riedlander發(fā)現(xiàn)，在小鼠的巨噬細(xì)胞中加入炭疽致死毒素，可使其快速裂解死亡并發(fā)生炎性反應(yīng)[5]。1992年，Zychlinsky等發(fā)現(xiàn)了志賀氏菌和沙門氏菌感染巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性機(jī)制，可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞死亡，囿于當(dāng)時知識的缺乏，最初將此種死亡形式歸類于凋亡，隨后發(fā)現(xiàn)此過程特異性依賴Caspase-1介導(dǎo)，并且介導(dǎo)釋放白細(xì)胞介素IL-1β，引起炎性反應(yīng)[6]，這與既往所認(rèn)知的凋亡是不同的。2001年，Cookson和Brennan將這種新的細(xì)胞程序性死亡命名為“Pyroptosis”，希臘語中“pyro”意指火與熱，“ptosis”意指凋零[7]。2015年，研究[8]發(fā)現(xiàn)，消皮素Gasdermin-D（GSDMD）是細(xì)胞焦亡的最關(guān)鍵因素，Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11通過切割GSDMD使細(xì)胞裂解并釋放炎性內(nèi)容物。2018年，細(xì)胞死亡命名委員會（nomenclature committee on cell death,NCCD）正式將由Gasdermin家族蛋白介導(dǎo)的質(zhì)膜膜孔形成的可控性細(xì)胞死亡命名為“細(xì)胞焦亡”[9]。細(xì)胞焦亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡形式以及被越來越多的研究人員熟悉并應(yīng)用于腫瘤治療中。

2 細(xì)胞焦亡的特點

2.1 細(xì)胞焦亡與細(xì)胞凋亡的區(qū)別

細(xì)胞焦亡是一種由半胱天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）介導(dǎo)的程序性死亡，與細(xì)胞凋亡有著本質(zhì)區(qū)別。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的主要類型，已被人們熟知，在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞萎縮、細(xì)胞核破裂，并伴隨著凋亡小體的形成[10]，在凋亡過程中由Caspase-2、8、9、10識別信息，識別后由Caspase-3、6、7執(zhí)行凋亡，細(xì)胞凋亡是一種生理性的基因調(diào)控，一般過程中不涉及炎性反應(yīng)。焦亡同樣是源于細(xì)胞的程序性死亡，由病理性刺激誘發(fā)，依賴Caspase-1、3、4、5、11介導(dǎo)切割GSDMD蛋白使細(xì)胞膜孔形成，細(xì)胞呈現(xiàn)充氣球樣，進(jìn)而細(xì)胞破裂并釋放炎性介質(zhì)達(dá)到抗炎和抗菌的作用[11]，在腫瘤和遺傳病方面也扮演著重要的角色。

2.2 Gasdermin家族蛋白在細(xì)胞焦亡中的作用

Gasdermin家族蛋白是細(xì)胞焦亡過程中最重要的“媒介”，廣泛存在于不同細(xì)胞中。Gasdermin家族成員包括GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDME和Pejvakin，除了Pejvakin蛋白，其余蛋白均參與細(xì)胞膜孔形成[12]，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，近年來已經(jīng)證實GSDMD是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵底物，GSDMD約由480個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為53 kDa，擁有兩個結(jié)構(gòu)域-氨基酸效應(yīng)域[13]，GSDMD在靜息狀態(tài)下保持自抑狀態(tài)，當(dāng)受到半胱天冬氨酸酶刺激后，兩個效應(yīng)域則會裂解為GSDMD-N端片段和GSDMD-C端片段，并發(fā)生顯著的構(gòu)象改變，其中，GSDMD-N端片段高度親和心磷脂、磷脂酸等脂質(zhì)成分，具有固有的細(xì)胞膜毒性作用。細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層存在磷脂酰絲氨酸和磷酸肌醇等脂質(zhì)成分，GSDMD-N端片段可以與之結(jié)合破壞細(xì)胞膜的完整性，使其形成12～14 nm的蛋白孔樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜上的孔隙使細(xì)胞外側(cè)和內(nèi)側(cè)形成了通道，細(xì)胞膜的離子濃度梯度消失，破壞了滲透壓[14]，水分子涌入細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，進(jìn)而破裂，GSDMD具有多效性，同時發(fā)揮促炎和抗炎作用，使其成為抗菌和抗炎治療的潛在靶點，釋放大量的炎性因子引起炎性反應(yīng)。

3 細(xì)胞焦亡的生物學(xué)機(jī)制

3.1 經(jīng)典通路

3.1.1 炎性小體復(fù)合物的組成 經(jīng)典通路是細(xì)胞焦亡最主要的發(fā)生方式，當(dāng)機(jī)體受到刺激或被病原菌等其他因素感染威脅健康時，會迅速做出免疫應(yīng)答，組裝成炎性小體復(fù)合物，激活Caspase-1，切割GSDMD。炎性小體主要由凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck like protein,ASC），模式識別受體（pattern recognition receptor,PRR）和半胱氨酸蛋白酶-1前體（procaspase-1）組成[15]。其中，ASC是一種接頭蛋白，是由熱蛋白結(jié)構(gòu)域（pyrin domain,PYD）和半胱天冬氨酸蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域（caspase activation and recruitment,CARD）組成，PYD屬于N端，CARD屬于C端。PRR主要分為四種，核苷酸結(jié)合寡聚化域養(yǎng)受體（nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor,NLR）、C型凝集素受體（C-type lectin receptors,CLR）、黑色素瘤缺乏因子2樣受體（absent in melaroma 2 like receptor,ALR）和Toll樣受體（toll-like receptor,TLR），與procaspase-1前體共同組裝成炎性小體。

3.1.2 Caspase-1介導(dǎo)細(xì)胞焦亡 Caspase-1在細(xì)胞焦亡的經(jīng)典通路中起著至關(guān)重要的作用。炎性小體中的PRR共有兩種分子模式，識別細(xì)胞內(nèi)容物的模式稱為病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern,PAMP），識別細(xì)胞釋放的危險信號的模式稱為危險相關(guān)分子模式（damage associated molecular pattern,DAMP）[3]，PAMP和DAMP不僅可以與細(xì)胞膜上的Toll樣受體結(jié)合，從而觸發(fā)炎性小體復(fù)合物及其靶物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，還可以被炎性小體感受器識別，與轉(zhuǎn)換器形成炎性小體復(fù)合物。作為機(jī)體的第一道防線，PRR率先識別危險信號并做出反應(yīng)，機(jī)體受到PAMP和DAMP的刺激后，為了遏制入侵的微生物，與N端的PYD相結(jié)合，釋放CARD，ASC再通過反平行二聚作用，形成Caspase-1酶原激活平臺，Caspase-1在通常情況下是一種惰性酶原，當(dāng)激活位點與酶原激活平臺相接近時，Caspase-1會自動激活，這是細(xì)胞焦亡經(jīng)典通路最具特點的部分[16]，激活的Caspase-1可以特異性的切割GSDMD，使其分為N端和C端，前者可以通過脂質(zhì)相互作用破壞細(xì)胞膜，形成質(zhì)膜孔，不僅使水分子進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹進(jìn)而裂解，還釋放了白細(xì)胞介素IL-1β（interleukin-1β,IL-1β）和IL-18等免疫因子，招募炎性細(xì)胞，進(jìn)一步引起炎性反應(yīng)[17]。這種依賴Caspase-1介導(dǎo)切割GSDMD的細(xì)胞死亡方式則成為細(xì)胞焦亡的經(jīng)典通路，見圖1。

圖1 細(xì)胞焦亡的經(jīng)典通路Figure 1 Classical pathway of cell pyroptosis

3.2 非經(jīng)典通路

與經(jīng)典通路不同的是，非經(jīng)典通路是由Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11介導(dǎo)的。研究[18]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠受到革蘭陰性細(xì)菌感染后，被感染的細(xì)胞進(jìn)入囊泡中，被感染的細(xì)胞胞膜上的干擾素受體結(jié)合通過與γ干擾素結(jié)合，使囊泡破裂釋放出脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）。革蘭陰性菌細(xì)胞壁上的LPS可以激活小鼠體內(nèi)的Caspase-11（人體內(nèi)存在Caspase-4和Caspase-5），Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11被激活后，可以特異性地切割GSDMD，從而產(chǎn)生GSDMD-N端致使細(xì)胞膜成孔、腫脹、溶解，誘導(dǎo)焦亡的發(fā)生。除此之外，激活的Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11也可以在ACS的作用下完成炎性小體復(fù)合物的構(gòu)建，活化Caspase-1，還可以激活縫隙連接蛋白1（Pannexin-1,Panx-1），并引起ATP的釋放、和K+的外流。刺激經(jīng)典通路的發(fā)生[19]，同時，Caspase-1還可以活化并分泌 IL-1β前體和IL-18前體，進(jìn)一步擴(kuò)大炎性反應(yīng)，見圖2。

圖2 細(xì)胞焦亡的非經(jīng)典通路Figure 2 Non-classical pathways of cell pyroptosis

3.3 其他通路

Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，除了Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11可以介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，Caspase-3和Hela細(xì)胞也可以介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，他們將GSDME的Hela細(xì)胞經(jīng)過放線菌酮（cycloheximide,CHX）處理后，可以將細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞焦亡，不僅如此，活化后的Caspase-3也可以作用GSDME的DMPD位點，特異性的剪切GSDME，使GSDME同樣生成N端和C端，介導(dǎo)細(xì)胞焦亡。Shen等[21]研究發(fā)現(xiàn)，GSDME也是一種新定義的焦亡執(zhí)行者，順鉑和阿霉素均以濃度和時間依賴性的方式誘導(dǎo)了GSDME的裂解，從而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡；Kambara等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在老化的中性粒細(xì)胞中，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（ELANE）從胞質(zhì)顆粒釋放到胞質(zhì)中。ELANE介導(dǎo)的GSDMD裂解位于Caspase裂解位點的上游，并產(chǎn)生完全活性的ELANE衍生N片段，其誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的效果與GSDMD方式相同，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞發(fā)生焦亡。Sarhan等[23]研究發(fā)現(xiàn)，耶爾森氏菌在感染過程中與細(xì)胞死亡和炎性反應(yīng)形成密切相關(guān)。致病性耶爾森氏菌通過效應(yīng)分子YopJ抑制MAP激酶轉(zhuǎn)化生長因子激活激酶1（TGFβ-activated kinase 1,Tak1），激活Caspase-8，介導(dǎo)細(xì)胞死亡的同時沉默細(xì)胞因子的表達(dá)。

4 細(xì)胞焦亡在乳腺癌中的研究進(jìn)展

世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，2020年全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬例，超過了肺癌的220萬例，乳腺癌已經(jīng)取代肺癌，成為全球第一大癌癥，而在我國，每年新發(fā)乳腺癌患者約為40萬人[24]。對于乳腺癌，很多研究發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞焦亡在其發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。石瑛等[25]研究發(fā)現(xiàn)，給予紫杉醇治療時，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的Caspase-3和GSDME的活性明顯增加，LDH釋放也會增加，通過誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡發(fā)揮抗腫瘤作用，GSDME啟動子區(qū)在大部分腫瘤細(xì)胞中處于甲基化狀態(tài)，因而處于基因沉默狀態(tài)，而當(dāng)研究人員通過RNA干擾技術(shù)敲除MCF-7細(xì)胞中的GSDME片段，則紫杉醇的效果會大幅度降低。Jiao等[26]研究也發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell,HUC-MSC）可作為細(xì)胞癌癥治療的新工具，通過將HUC-MSCs的分泌因子暴露于HUC-MSCs的條件培養(yǎng)基中來評估HUCMSCs分泌因子對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的影響，發(fā)現(xiàn)其可以通過細(xì)胞焦亡導(dǎo)致MCF-7死亡，起到抑制腫瘤生長的作用。Huang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中，GSDME表達(dá)的增加使細(xì)胞更容易觸發(fā)Caspase-3依賴的凋亡信號通路，將GSDME基因敲除后增加了體外細(xì)胞侵襲性，證明了GSDME與乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Pizato等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中補(bǔ)充二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA），并分析炎性反應(yīng)細(xì)胞死亡。發(fā)現(xiàn)與未處理的細(xì)胞相比，DHA處理的乳腺癌細(xì)胞觸發(fā)Caspasase-1和GSDMD激活增加，增強(qiáng)IL-1β分泌，發(fā)現(xiàn)了DHA誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的一種新的細(xì)胞死亡途徑，并指出細(xì)胞焦亡是介導(dǎo)抗癌治療的一個新的突出靶點，DHA可以觸發(fā)MDA-MB-231三陰性乳腺癌細(xì)胞的焦亡，這為DHA的抗癌作用提供了新的線索。

乳腺癌被認(rèn)為是免疫原性差的腫瘤類型，Elion等[29]研究發(fā)現(xiàn)，使用工程化的維甲酸誘導(dǎo)基因I（retinoic acid inducible gene I,RIG-I）激動劑治療乳腺癌，導(dǎo)致RIG-I的上調(diào)以及促炎轉(zhuǎn)錄因子的活化，從而引發(fā)細(xì)胞焦亡，RIG-I激動劑還誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞募集趨化因子的表達(dá)，乳腺腫瘤中的RIG-I活化增加了腫瘤淋巴細(xì)胞并減少了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。Li等[30]研究發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素對乳腺癌也有抑制作用，研究人員建立了乳腺癌移植瘤模型，通過qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分別分析乳腺癌細(xì)胞mRNA和蛋白質(zhì)水平，ELISA試劑盒用于評估IL-1β和IL-18的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素激活了黑色素瘤2、Caspase-3和GSDME的表達(dá)，通過誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤發(fā)生，這突出了一種有前途的乳腺癌治療策略。Li等[31]研究發(fā)現(xiàn)，P2X7受體的過表達(dá)與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)，研究人員將伊維菌素作為變構(gòu)調(diào)節(jié)P2X4受體的原型藥物，可以在乳腺癌細(xì)胞中嘌呤能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的雙重存活和細(xì)胞毒性功能之間取得平衡，激活Caspase-1，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Cheng等[32]研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎性反應(yīng)在轉(zhuǎn)移的早期階段招募髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSC），通過細(xì)胞焦亡誘導(dǎo)的IL-1β生成來促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移，此研究定義了IL-1β在乳腺癌轉(zhuǎn)移進(jìn)展中的作用，并強(qiáng)調(diào)了控制牙周炎性反應(yīng)的必要性。Faria等[33]研究也發(fā)現(xiàn)，慢性炎性反應(yīng)通過改變腫瘤的免疫微環(huán)境來影響乳腺癌的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移潛力和治療結(jié)果，導(dǎo)致急性和慢性炎性反應(yīng)的關(guān)鍵途徑是NLRP3炎性小體被激活，然后依賴Caspase-1激活釋放IL-1β和IL-18促炎性細(xì)胞因子，研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)NLRP3炎性小體活化時，會促進(jìn)乳腺癌生長，了解細(xì)胞焦亡的雙重性，可能會極大地促進(jìn)乳腺癌新治療策略的發(fā)展。

5 小結(jié)與展望

既往人們對細(xì)胞焦亡的認(rèn)知較少，主要集中在細(xì)胞凋亡，細(xì)胞焦亡是新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞程序性死亡方式。細(xì)胞焦亡的經(jīng)典通路是通過Caspase-1介導(dǎo)的，非經(jīng)典通路是通過Caspase-4、5、11介導(dǎo)的，兩種通路均可產(chǎn)生IL-1β和IL-18等內(nèi)源性免疫因子，可以對腫瘤起到殺傷作用，但也會引起腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，釋放過度甚至?xí)?dǎo)致免疫性疾病和炎性反應(yīng)，還有Caspase-3或Hela細(xì)胞介導(dǎo)的特殊通路。多個證據(jù)已經(jīng)表明，細(xì)胞焦亡的生物學(xué)機(jī)制任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)變化，都可能對腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸起到不同的影響。

經(jīng)過多年的研究，細(xì)胞焦亡的生物學(xué)機(jī)制研究已經(jīng)有了很大進(jìn)展，并且發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞焦亡與其他惡性腫瘤之間的關(guān)系，尤其是乳腺癌，已經(jīng)將其應(yīng)用在臨床和基礎(chǔ)研究上。但目前細(xì)胞焦亡在腫瘤上的具體機(jī)制還不完善，臨床應(yīng)用還面臨著諸多考驗，但細(xì)胞焦亡在腫瘤的治療方面有著良好的前景，我們需要進(jìn)行更多的臨床試驗和數(shù)據(jù)分析。