細胞焦亡的生物學機制及其在乳腺癌中的研究進展

竇赫，馬爽，邾月，劉宇琪，肖敏

0 引言

近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率呈上升趨勢，中國每年惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率居全世界首位[1]。乳腺癌已經(jīng)成為女性最常見的惡性疾病，每年我國新發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者為40萬例，占女性惡性腫瘤的16.5%。乳腺癌目前已成為嚴重影響女性身體健康的一種惡性腫瘤[2]。對于乳腺癌，我們提倡盡量做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的“三早”預防。乳腺癌的治療主要分為以手術和放療為主的局部治療和以化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療為主的全身系統(tǒng)治療。

細胞死亡普遍存在于生物界中，細胞死亡形式主要包括細胞壞死、細胞凋亡、細胞自噬、內(nèi)源性死亡、壞死性凋亡等[3]。除壞死與凋亡兩種常見的死亡形式外，隨著研究的不斷進展，細胞焦亡也引起了越來越多的關注，不同于其他細胞死亡形式，細胞焦亡可以更加迅速地引起炎性反應[4]，它不僅與人體的免疫系統(tǒng)緊密相連，在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)歸中也起到了重要作用，本文將就細胞焦亡的生物學機制及其在乳腺癌中的研究進展作一綜述。

1 細胞焦亡的定義

細胞焦亡的發(fā)現(xiàn)要追溯到二十世紀80年代。1986年，F(xiàn)riedlander發(fā)現(xiàn)，在小鼠的巨噬細胞中加入炭疽致死毒素，可使其快速裂解死亡并發(fā)生炎性反應[5]。1992年，Zychlinsky等發(fā)現(xiàn)了志賀氏菌和沙門氏菌感染巨噬細胞的細胞毒性機制，可誘導宿主細胞死亡，囿于當時知識的缺乏，最初將此種死亡形式歸類于凋亡，隨后發(fā)現(xiàn)此過程特異性依賴Caspase-1介導，并且介導釋放白細胞介素IL-1β，引起炎性反應[6]，這與既往所認知的凋亡是不同的。2001年，Cookson和Brennan將這種新的細胞程序性死亡命名為“Pyroptosis”，希臘語中“pyro”意指火與熱，“ptosis”意指凋零[7]。2015年，研究[8]發(fā)現(xiàn)，消皮素Gasdermin-D（GSDMD）是細胞焦亡的最關鍵因素，Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11通過切割GSDMD使細胞裂解并釋放炎性內(nèi)容物。2018年，細胞死亡命名委員會（nomenclature committee on cell death,NCCD）正式將由Gasdermin家族蛋白介導的質(zhì)膜膜孔形成的可控性細胞死亡命名為“細胞焦亡”[9]。細胞焦亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡形式以及被越來越多的研究人員熟悉并應用于腫瘤治療中。

2 細胞焦亡的特點

2.1 細胞焦亡與細胞凋亡的區(qū)別

細胞焦亡是一種由半胱天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）介導的程序性死亡，與細胞凋亡有著本質(zhì)區(qū)別。細胞凋亡是細胞程序性死亡的主要類型，已被人們熟知，在形態(tài)學上表現(xiàn)為細胞萎縮、細胞核破裂，并伴隨著凋亡小體的形成[10]，在凋亡過程中由Caspase-2、8、9、10識別信息，識別后由Caspase-3、6、7執(zhí)行凋亡，細胞凋亡是一種生理性的基因調(diào)控，一般過程中不涉及炎性反應。焦亡同樣是源于細胞的程序性死亡，由病理性刺激誘發(fā)，依賴Caspase-1、3、4、5、11介導切割GSDMD蛋白使細胞膜孔形成，細胞呈現(xiàn)充氣球樣，進而細胞破裂并釋放炎性介質(zhì)達到抗炎和抗菌的作用[11]，在腫瘤和遺傳病方面也扮演著重要的角色。

2.2 Gasdermin家族蛋白在細胞焦亡中的作用

Gasdermin家族蛋白是細胞焦亡過程中最重要的“媒介”，廣泛存在于不同細胞中。Gasdermin家族成員包括GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDME和Pejvakin，除了Pejvakin蛋白，其余蛋白均參與細胞膜孔形成[12]，誘導細胞焦亡，近年來已經(jīng)證實GSDMD是細胞焦亡的關鍵底物，GSDMD約由480個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為53 kDa，擁有兩個結構域-氨基酸效應域[13]，GSDMD在靜息狀態(tài)下保持自抑狀態(tài)，當受到半胱天冬氨酸酶刺激后，兩個效應域則會裂解為GSDMD-N端片段和GSDMD-C端片段，并發(fā)生顯著的構象改變，其中，GSDMD-N端片段高度親和心磷脂、磷脂酸等脂質(zhì)成分，具有固有的細胞膜毒性作用。細胞膜脂質(zhì)雙分子層存在磷脂酰絲氨酸和磷酸肌醇等脂質(zhì)成分，GSDMD-N端片段可以與之結合破壞細胞膜的完整性，使其形成12～14 nm的蛋白孔樣結構，細胞膜上的孔隙使細胞外側和內(nèi)側形成了通道，細胞膜的離子濃度梯度消失，破壞了滲透壓[14]，水分子涌入細胞，導致細胞腫脹，進而破裂，GSDMD具有多效性，同時發(fā)揮促炎和抗炎作用，使其成為抗菌和抗炎治療的潛在靶點，釋放大量的炎性因子引起炎性反應。

3 細胞焦亡的生物學機制

3.1 經(jīng)典通路

3.1.1 炎性小體復合物的組成 經(jīng)典通路是細胞焦亡最主要的發(fā)生方式，當機體受到刺激或被病原菌等其他因素感染威脅健康時，會迅速做出免疫應答，組裝成炎性小體復合物，激活Caspase-1，切割GSDMD。炎性小體主要由凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck like protein,ASC），模式識別受體（pattern recognition receptor,PRR）和半胱氨酸蛋白酶-1前體（procaspase-1）組成[15]。其中，ASC是一種接頭蛋白，是由熱蛋白結構域（pyrin domain,PYD）和半胱天冬氨酸蛋白酶募集結構域（caspase activation and recruitment,CARD）組成，PYD屬于N端，CARD屬于C端。PRR主要分為四種，核苷酸結合寡聚化域養(yǎng)受體（nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor,NLR）、C型凝集素受體（C-type lectin receptors,CLR）、黑色素瘤缺乏因子2樣受體（absent in melaroma 2 like receptor,ALR）和Toll樣受體（toll-like receptor,TLR），與procaspase-1前體共同組裝成炎性小體。

3.1.2 Caspase-1介導細胞焦亡 Caspase-1在細胞焦亡的經(jīng)典通路中起著至關重要的作用。炎性小體中的PRR共有兩種分子模式，識別細胞內(nèi)容物的模式稱為病原體相關分子模式（pathogen associated molecular pattern,PAMP），識別細胞釋放的危險信號的模式稱為危險相關分子模式（damage associated molecular pattern,DAMP）[3]，PAMP和DAMP不僅可以與細胞膜上的Toll樣受體結合，從而觸發(fā)炎性小體復合物及其靶物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，還可以被炎性小體感受器識別，與轉(zhuǎn)換器形成炎性小體復合物。作為機體的第一道防線，PRR率先識別危險信號并做出反應，機體受到PAMP和DAMP的刺激后，為了遏制入侵的微生物，與N端的PYD相結合，釋放CARD，ASC再通過反平行二聚作用，形成Caspase-1酶原激活平臺，Caspase-1在通常情況下是一種惰性酶原，當激活位點與酶原激活平臺相接近時，Caspase-1會自動激活，這是細胞焦亡經(jīng)典通路最具特點的部分[16]，激活的Caspase-1可以特異性的切割GSDMD，使其分為N端和C端，前者可以通過脂質(zhì)相互作用破壞細胞膜，形成質(zhì)膜孔，不僅使水分子進入細胞，導致細胞腫脹進而裂解，還釋放了白細胞介素IL-1β（interleukin-1β,IL-1β）和IL-18等免疫因子，招募炎性細胞，進一步引起炎性反應[17]。這種依賴Caspase-1介導切割GSDMD的細胞死亡方式則成為細胞焦亡的經(jīng)典通路，見圖1。

圖1 細胞焦亡的經(jīng)典通路Figure 1 Classical pathway of cell pyroptosis

3.2 非經(jīng)典通路

與經(jīng)典通路不同的是，非經(jīng)典通路是由Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11介導的。研究[18]發(fā)現(xiàn)，當小鼠受到革蘭陰性細菌感染后，被感染的細胞進入囊泡中，被感染的細胞胞膜上的干擾素受體結合通過與γ干擾素結合，使囊泡破裂釋放出脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）。革蘭陰性菌細胞壁上的LPS可以激活小鼠體內(nèi)的Caspase-11（人體內(nèi)存在Caspase-4和Caspase-5），Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11被激活后，可以特異性地切割GSDMD，從而產(chǎn)生GSDMD-N端致使細胞膜成孔、腫脹、溶解，誘導焦亡的發(fā)生。除此之外，激活的Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11也可以在ACS的作用下完成炎性小體復合物的構建，活化Caspase-1，還可以激活縫隙連接蛋白1（Pannexin-1,Panx-1），并引起ATP的釋放、和K+的外流。刺激經(jīng)典通路的發(fā)生[19]，同時，Caspase-1還可以活化并分泌 IL-1β前體和IL-18前體，進一步擴大炎性反應，見圖2。

圖2 細胞焦亡的非經(jīng)典通路Figure 2 Non-classical pathways of cell pyroptosis

3.3 其他通路

Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，除了Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11可以介導細胞焦亡，Caspase-3和Hela細胞也可以介導細胞焦亡，他們將GSDME的Hela細胞經(jīng)過放線菌酮（cycloheximide,CHX）處理后，可以將細胞凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎雇?，不僅如此，活化后的Caspase-3也可以作用GSDME的DMPD位點，特異性的剪切GSDME，使GSDME同樣生成N端和C端，介導細胞焦亡。Shen等[21]研究發(fā)現(xiàn)，GSDME也是一種新定義的焦亡執(zhí)行者，順鉑和阿霉素均以濃度和時間依賴性的方式誘導了GSDME的裂解，從而促進細胞發(fā)生凋亡；Kambara等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在老化的中性粒細胞中，中性粒細胞彈性蛋白酶（ELANE）從胞質(zhì)顆粒釋放到胞質(zhì)中。ELANE介導的GSDMD裂解位于Caspase裂解位點的上游，并產(chǎn)生完全活性的ELANE衍生N片段，其誘導細胞死亡的效果與GSDMD方式相同，介導中性粒細胞發(fā)生焦亡。Sarhan等[23]研究發(fā)現(xiàn)，耶爾森氏菌在感染過程中與細胞死亡和炎性反應形成密切相關。致病性耶爾森氏菌通過效應分子YopJ抑制MAP激酶轉(zhuǎn)化生長因子激活激酶1（TGFβ-activated kinase 1,Tak1），激活Caspase-8，介導細胞死亡的同時沉默細胞因子的表達。

4 細胞焦亡在乳腺癌中的研究進展

世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，2020年全球乳腺癌新發(fā)病例高達226萬例，超過了肺癌的220萬例，乳腺癌已經(jīng)取代肺癌，成為全球第一大癌癥，而在我國，每年新發(fā)乳腺癌患者約為40萬人[24]。對于乳腺癌，很多研究發(fā)現(xiàn)了細胞焦亡在其發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。石瑛等[25]研究發(fā)現(xiàn)，給予紫杉醇治療時，人乳腺癌細胞MCF-7中的Caspase-3和GSDME的活性明顯增加，LDH釋放也會增加，通過誘導細胞焦亡發(fā)揮抗腫瘤作用，GSDME啟動子區(qū)在大部分腫瘤細胞中處于甲基化狀態(tài)，因而處于基因沉默狀態(tài)，而當研究人員通過RNA干擾技術敲除MCF-7細胞中的GSDME片段，則紫杉醇的效果會大幅度降低。Jiao等[26]研究也發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell,HUC-MSC）可作為細胞癌癥治療的新工具，通過將HUC-MSCs的分泌因子暴露于HUC-MSCs的條件培養(yǎng)基中來評估HUCMSCs分泌因子對乳腺癌細胞MCF-7的影響，發(fā)現(xiàn)其可以通過細胞焦亡導致MCF-7死亡，起到抑制腫瘤生長的作用。Huang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中，GSDME表達的增加使細胞更容易觸發(fā)Caspase-3依賴的凋亡信號通路，將GSDME基因敲除后增加了體外細胞侵襲性，證明了GSDME與乳腺癌患者的淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關。Pizato等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌MDA-MB-231細胞中補充二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA），并分析炎性反應細胞死亡。發(fā)現(xiàn)與未處理的細胞相比，DHA處理的乳腺癌細胞觸發(fā)Caspasase-1和GSDMD激活增加，增強IL-1β分泌，發(fā)現(xiàn)了DHA誘導乳腺癌細胞的一種新的細胞死亡途徑，并指出細胞焦亡是介導抗癌治療的一個新的突出靶點，DHA可以觸發(fā)MDA-MB-231三陰性乳腺癌細胞的焦亡，這為DHA的抗癌作用提供了新的線索。

乳腺癌被認為是免疫原性差的腫瘤類型，Elion等[29]研究發(fā)現(xiàn)，使用工程化的維甲酸誘導基因I（retinoic acid inducible gene I,RIG-I）激動劑治療乳腺癌，導致RIG-I的上調(diào)以及促炎轉(zhuǎn)錄因子的活化，從而引發(fā)細胞焦亡，RIG-I激動劑還誘導淋巴細胞募集趨化因子的表達，乳腺腫瘤中的RIG-I活化增加了腫瘤淋巴細胞并減少了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。Li等[30]研究發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素對乳腺癌也有抑制作用，研究人員建立了乳腺癌移植瘤模型，通過qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分別分析乳腺癌細胞mRNA和蛋白質(zhì)水平，ELISA試劑盒用于評估IL-1β和IL-18的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素激活了黑色素瘤2、Caspase-3和GSDME的表達，通過誘導乳腺癌細胞凋亡來抑制腫瘤發(fā)生，這突出了一種有前途的乳腺癌治療策略。Li等[31]研究發(fā)現(xiàn)，P2X7受體的過表達與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移相關，研究人員將伊維菌素作為變構調(diào)節(jié)P2X4受體的原型藥物，可以在乳腺癌細胞中嘌呤能信號轉(zhuǎn)導的雙重存活和細胞毒性功能之間取得平衡，激活Caspase-1，誘導細胞凋亡。Cheng等[32]研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎性反應在轉(zhuǎn)移的早期階段招募髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSC），通過細胞焦亡誘導的IL-1β生成來促進乳腺癌轉(zhuǎn)移，此研究定義了IL-1β在乳腺癌轉(zhuǎn)移進展中的作用，并強調(diào)了控制牙周炎性反應的必要性。Faria等[33]研究也發(fā)現(xiàn)，慢性炎性反應通過改變腫瘤的免疫微環(huán)境來影響乳腺癌的進展、轉(zhuǎn)移潛力和治療結果，導致急性和慢性炎性反應的關鍵途徑是NLRP3炎性小體被激活，然后依賴Caspase-1激活釋放IL-1β和IL-18促炎性細胞因子，研究人員發(fā)現(xiàn)當NLRP3炎性小體活化時，會促進乳腺癌生長，了解細胞焦亡的雙重性，可能會極大地促進乳腺癌新治療策略的發(fā)展。

5 小結與展望

既往人們對細胞焦亡的認知較少，主要集中在細胞凋亡，細胞焦亡是新近發(fā)現(xiàn)的一種細胞程序性死亡方式。細胞焦亡的經(jīng)典通路是通過Caspase-1介導的，非經(jīng)典通路是通過Caspase-4、5、11介導的，兩種通路均可產(chǎn)生IL-1β和IL-18等內(nèi)源性免疫因子，可以對腫瘤起到殺傷作用，但也會引起腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，釋放過度甚至會導致免疫性疾病和炎性反應，還有Caspase-3或Hela細胞介導的特殊通路。多個證據(jù)已經(jīng)表明，細胞焦亡的生物學機制任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)變化，都可能對腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸起到不同的影響。

經(jīng)過多年的研究，細胞焦亡的生物學機制研究已經(jīng)有了很大進展，并且發(fā)現(xiàn)了細胞焦亡與其他惡性腫瘤之間的關系，尤其是乳腺癌，已經(jīng)將其應用在臨床和基礎研究上。但目前細胞焦亡在腫瘤上的具體機制還不完善，臨床應用還面臨著諸多考驗，但細胞焦亡在腫瘤的治療方面有著良好的前景，我們需要進行更多的臨床試驗和數(shù)據(jù)分析。