神經(jīng)細(xì)胞分化及相關(guān)疾病的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究進(jìn)展

劉 青，徐 斌，元小冬，張麗麗，歐 亞，張萍淑

神經(jīng)細(xì)胞分化和神經(jīng)系統(tǒng)疾病形成是個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，要了解神經(jīng)細(xì)胞分化、變性、壞死過(guò)程中的基因表達(dá)變化， 需對(duì)不同狀態(tài)細(xì)胞中表達(dá)的差異基因進(jìn)行綜合分析[1]。 常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究是在高達(dá)數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞群體水平上進(jìn)行，忽略細(xì)胞異質(zhì)性，不能揭示細(xì)胞間分子變化機(jī)制[2]。隨著測(cè)序技術(shù)、細(xì)胞捕獲和生物信息學(xué)飛速發(fā)展，促進(jìn)了單細(xì)胞RNA 測(cè)序（single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq）技術(shù)和擬時(shí)序分析技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用這兩項(xiàng)技術(shù)可以解決細(xì)胞間異質(zhì)性和揭示細(xì)胞不同狀態(tài)下基因表達(dá)變化。 將scRNA-seq 和擬時(shí)序分析技術(shù)應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞分化和疾病研究，有助于深入理解不同神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、變性、壞死過(guò)程中分子變化機(jī)制。 筆者擬對(duì)scRNA-seq、數(shù)據(jù)分析，以及在神經(jīng)細(xì)胞分化和疾病研究中的應(yīng)用進(jìn)行概述。

1 單細(xì)胞RNA 測(cè)序技術(shù)

2009 年高通量測(cè)序技術(shù)改變了生物學(xué)領(lǐng)域基因組學(xué)研究[3]，但群體平均轉(zhuǎn)錄組無(wú)法捕捉單個(gè)細(xì)胞中重要轉(zhuǎn)錄信號(hào)。 隨著scRNA-seq 技術(shù)需求日益增加， 許多測(cè)序公司相繼推出新一代scRNA-seq 技術(shù)， 該技術(shù)能夠以前所未有的分辨率研究單個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)特性[4～7]。 scRNA-seq 技術(shù)與數(shù)據(jù)分析流程見(jiàn)圖1。

圖1 單細(xì)胞測(cè)序與數(shù)據(jù)分析流程Fig.1 Flow chart of single-cell RNA-sequencing and data analysis

1.1 單細(xì)胞RNA 測(cè)序流程

首先分離單細(xì)胞，傳統(tǒng)常用的方法有熒光激活細(xì)胞分選法、微流控分選法等[8]。目前市場(chǎng)上常用的分離方法主要有10×Genomics Chromium 的液滴法及BD Rhapsody 的微孔法， 這兩種測(cè)序平臺(tái)將細(xì)胞分離、mRNA 捕獲、反轉(zhuǎn)錄、cDNA 擴(kuò)增、測(cè)序、建庫(kù)集為一體。

1.1.1 10 × Genomics Chromium 測(cè)序平臺(tái)

10× Genomics[9，10]平臺(tái)利用液滴法原理和Gem-Code 技術(shù)， 通過(guò)控制微流體的進(jìn)入， 將帶有條形碼（barcode）、分 子 標(biāo) 簽（unique molecular index，UMI）、引物和酶的凝膠微珠（gel beads）與單細(xì)胞混合，barcode 用來(lái)標(biāo)記細(xì)胞，UMI 用來(lái)檢測(cè)和定量獨(dú)特的mRNA，從而實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的單細(xì)胞分離、捕獲mRNA、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增、測(cè)序和構(gòu)建文庫(kù)（圖2）。 10×Genomics平臺(tái)操作簡(jiǎn)便，barcode 較短，數(shù)據(jù)利用率高。 但對(duì)細(xì)胞消化的活性高，最低70%以上。

圖2 10×Genomics Chromium 測(cè)序技術(shù)流程Fig.2 Flow chart of 10×Genomics Chromium sequencing technology

1.1.2 BD Rhapsody 測(cè)序平臺(tái)

BD Rhapsody[11，12]平臺(tái)利用微孔進(jìn)行單細(xì)胞分離，一個(gè)微孔可以容納一個(gè)磁珠和一個(gè)細(xì)胞。磁珠上連接逆轉(zhuǎn)錄引物， 引物主要包括細(xì)胞標(biāo)簽 （用于標(biāo)記細(xì)胞）、單分子標(biāo)簽（unique molecular identifier，UMI）（區(qū)分mRNA 分子）、poly dT （與mRNA 3′端poly A 互補(bǔ)配對(duì)）。微孔捕獲單細(xì)胞后，裂解細(xì)胞、獲取mRNA、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增，建立文庫(kù)（圖3）。 BD Rhapsody 平臺(tái)對(duì)細(xì)胞活性要求低于10×平臺(tái)，細(xì)胞計(jì)數(shù)準(zhǔn)確度高。但整體操作時(shí)間較長(zhǎng)，約3.5 h。

圖3 BD Rhapsody 測(cè)序技術(shù)流程Fig.3 Flow chart of BD Rhapsody sequencing technology

1.2 單細(xì)胞RNA 測(cè)序的數(shù)據(jù)分析流程

1.2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

數(shù)據(jù)質(zhì)量控制：有些死亡細(xì)胞、過(guò)早破裂細(xì)胞、一個(gè)液滴中出現(xiàn)2 個(gè)甚至是多個(gè)細(xì)胞，或從細(xì)胞中溢出的mRNA 漂浮在懸液中都會(huì)影響測(cè)序的數(shù)據(jù)， 降低數(shù)據(jù)質(zhì)量，因此在進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)分析時(shí)，要先進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，篩出這些因素產(chǎn)生的數(shù)據(jù)[13，14]。

數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化：由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的生物因素、操作人員技術(shù)因素可引起數(shù)據(jù)偏差， 通過(guò)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，可以校正這些因素引起的偏倚，降低測(cè)序深度與不同表達(dá)模式導(dǎo)致的偏倚，降低干擾，提高數(shù)據(jù)可信度[15，16]。

1.2.2 數(shù)據(jù)降維與聚類(lèi)

scRNA-seq 數(shù)據(jù)具有高維性，在進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)時(shí)，通常需要降維處理，比較常用的降維算法有主成分分析 （principal component analysis，PCA）[17]、t 分布隨機(jī)領(lǐng)域嵌入 （t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）[18]算法、 均勻流形近似和投影（uniform manifold approximation and projection，UMAP)[19]。PCA 是一種相對(duì)簡(jiǎn)單的線(xiàn)性降維算法。t-SNE 算法是一種可視化的非線(xiàn)性降維方法。UMAP 是一種基于黎曼幾何和代數(shù)拓?fù)涞乃惴ǎ目梢暬|(zhì)量與t-SNE算法相仿。 然而UMAP 能體現(xiàn)細(xì)胞群分化的連續(xù)性。降維分析后，進(jìn)行聚類(lèi)分析，根據(jù)基因表達(dá)的相似性，將細(xì)胞分成不同的亞型。 常用的聚類(lèi)方法有K-means算法[20]、圖聚類(lèi)算法（Graph-based）[21]。

1.2.3 擬時(shí)序分析

降維分析與聚類(lèi)分析完成后， 進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)，細(xì)胞軌跡推斷。準(zhǔn)確的軌跡推斷是鑒定基因隨時(shí)間動(dòng)態(tài)表達(dá)的關(guān)鍵步驟[22，23]。 已有許多方法被提出用于擬時(shí)間重建，Saelens W 等[24]比較了29 種擬時(shí)序分析方法，從軌跡推斷的準(zhǔn)確性、可擴(kuò)展性、穩(wěn)定性和可用性這4 個(gè)方面評(píng)估， 發(fā)現(xiàn)不同的算法間有較大互補(bǔ)性。常用的算法Monocle[25，26]，在細(xì)胞基礎(chǔ)上構(gòu)建最小生成樹(shù)（minimum spanning tree，MST），找到MST 的最長(zhǎng)路徑，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行排序，產(chǎn)生單個(gè)細(xì)胞分化進(jìn)程的“軌跡”。 單細(xì)胞分析工具 （tools for single cell analysis，TSCAN）[27，28]使用基于簇的MST 獲得擬時(shí)間軌跡的主干之后，沿著擬時(shí)間路徑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行排序。TSCAN 降低了樹(shù)空間的復(fù)雜度，提高樹(shù)推理的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

2 單細(xì)胞測(cè)序擬時(shí)序分析在神經(jīng)細(xì)胞分化及疾病研究中的應(yīng)用

2.1 神經(jīng)細(xì)胞分化動(dòng)力研究應(yīng)用

scRNA-seq 技術(shù)與擬時(shí)序分析技術(shù)的結(jié)合可以重建細(xì)胞分化軌跡。 利用這項(xiàng)技術(shù)，可以進(jìn)一步研究腦組織發(fā)育過(guò)程中的分子機(jī)制。 Carter RA 等[29]取小鼠胚胎第10、11、12、13、14、15、16、17 天和出生后第0、4、7、10 天的12 個(gè)關(guān)鍵發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的小腦細(xì)胞，對(duì)這39 245 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序，用Monocle 2 構(gòu)建細(xì)胞分化軌跡，揭示出谷氨酸能祖細(xì)胞可分化為顆粒神經(jīng)元細(xì)胞和谷氨酸能神經(jīng)元，顆粒神經(jīng)元獨(dú)特表達(dá)基因配對(duì)盒因子6 基因 （paired box 6 gene，Pax6）、ZIC 家族成員1 基因（Zic family member 1 gene，Zic1）和神經(jīng)分化因子1 基因 （neuronal differentiation 1，Neurod1）在細(xì)胞分化軌跡起點(diǎn)低表達(dá)，在分化為顆粒神經(jīng)元的分支上高表達(dá)， 谷氨酸能神經(jīng)元獨(dú)特表達(dá)基因Meis同源盒2 基因（Meis homeobox 2 gene，Meis2）和LIM-同源異形框9 基因 （LIM homeobox 9 gene，Lhx9），在軌跡起點(diǎn)低表達(dá)， 在分化為谷氨酸能的分支上高表達(dá)。 Wizeman JW 等[30]取小鼠胚胎第13.5 d 的小腦細(xì)胞，對(duì)9 400 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，重建小腦祖細(xì)胞分化軌跡， 揭示出小腦祖細(xì)胞分化為Bergmann 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和γ 氨基丁酸能神經(jīng)元，同時(shí)揭示了這兩個(gè)軌跡之間有1 314 個(gè)基因表達(dá)存在顯著差異，沿這兩個(gè)分支，轉(zhuǎn)錄增加的基因分別是促膠質(zhì)形成的胰腺相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1a 基因（pancreas associated transcription factor 1a，Ptf1a）、 少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2 基因（oligodendrocyte transcription factor 2 gene，Olig2） 和促神經(jīng)元分化的ETS 變異轉(zhuǎn)錄因子基因（ETS variant transcription factor 4,Etv4）、Etv5。 Tasic B 等[31]用單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)、擬時(shí)序分析技術(shù)分析了來(lái)自小鼠初級(jí)視覺(jué)皮層和前外側(cè)運(yùn)動(dòng)皮層兩個(gè)區(qū)域的23 822 個(gè)細(xì)胞，鑒定出61 種γ 氨基丁酸能神經(jīng)元、56 種谷氨酸能神經(jīng)元和16 種非神經(jīng)元類(lèi)型細(xì)胞， 構(gòu)建了γ 氨基丁酸能神經(jīng)元、谷氨酸能神經(jīng)元的發(fā)育軌跡。Zhang R 等[10]測(cè)序了新生大鼠的19 202 個(gè)細(xì)胞，其中9 778 個(gè)細(xì)胞來(lái)自坐骨神經(jīng)，9 424 個(gè)細(xì)胞來(lái)自背神經(jīng)節(jié)， 鑒定出10 種細(xì)胞類(lèi)型，其中施萬(wàn)細(xì)胞包含4 種亞型，用Reversed Graph Embedding 構(gòu)建施萬(wàn)細(xì)胞分化軌跡，揭示施萬(wàn)細(xì)胞4 型成熟度最低， 高表達(dá)與細(xì)胞周期、增殖相關(guān)的基因[如著絲粒蛋白F 基因（centromere protein F gene，Cenpf）、增殖標(biāo)志物Ki-67 基因（marker of proliferation Ki-67 gene，Mki67）]； 施萬(wàn)細(xì)胞2 型高度成熟，高表達(dá)典型的髓磷脂基因[如閉合蛋白19 基因（claudin 19 gene，Cldn19）、EMI 結(jié) 合 域1 基 因（EMI domain containing 1，Emid1）]。 曹冰等[32]在研究胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，ESC）向神經(jīng)細(xì)胞分化關(guān)鍵性靶基因及分子機(jī)制時(shí)，從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus database，GEO）數(shù)據(jù)平臺(tái)下載人ESC 數(shù)據(jù)文件， 用Monocle 分析細(xì)胞分化軌跡，用基因本體論（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū) （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 富集分析等論證Marker基因調(diào)控人類(lèi)ESC 分化作用機(jī)制， 揭示了纖維連接蛋白1 基因 （fibronectin 1 gene，F(xiàn)N1）、Nanog 同源盒基因（Nanog homeobox gene，NANOG）和生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2 基因 （growth factor receptor bound protein 2 gene，GRB2） 是ESC 向神經(jīng)細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控基因。FN1 可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)通路介導(dǎo)人類(lèi)ESC 基質(zhì)環(huán)境的變化；上調(diào)Nanog 同源盒基因（Nanog homeobox gene，NANOG）、 生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2基 因 （growth factor receptor bound protein 2 gene，GRB2）的表達(dá)能夠介導(dǎo)人類(lèi)ESC 定向分化為神經(jīng)組織。 神經(jīng)細(xì)胞的分化是非常復(fù)雜、受多基因網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)控制的過(guò)程，了解神經(jīng)細(xì)胞分化中的分子機(jī)制，有助于進(jìn)一步理解其功能。

2.2 神經(jīng)系統(tǒng)疾病分子機(jī)制研究應(yīng)用

Hammond TR 等[33]分析了超過(guò)76 000 個(gè)小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞RNA 表達(dá)模式，這些細(xì)胞取自小鼠發(fā)育、衰老和腦損傷時(shí)期。 揭示了胚胎期表達(dá)Ms4a 的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與腦邊界巨噬細(xì)胞有相似的轉(zhuǎn)錄組。在大腦衰老時(shí)， 炎癥和干擾素反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞增加，上調(diào)半乳糖凝集素3 基因（galectin 3 gene，Lgals3）、胱抑素F 基因 （cystatin F gene，Cst7） 等與炎癥相關(guān)的基因。 在腦組織損傷時(shí)，選擇性表達(dá)趨化因子C-C 基序趨化因子配體4（C-C motif chemokine ligand 4，Ccl4）的小膠質(zhì)細(xì)胞亞群增加。 另一項(xiàng)研究，Wu F 等[34]對(duì)野生型和突變型視網(wǎng)膜細(xì)胞[非調(diào)性bHLH 轉(zhuǎn)錄因子7基因（atonal bHLH transcription factor 7 gene，Atoh7）缺失]進(jìn)行scRNA-seq，利用SCANPY 重建細(xì)胞軌跡，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞（retinal progenitor cells，RPC）分化為不同類(lèi)型視網(wǎng)膜細(xì)胞的能力是由過(guò)渡狀態(tài)下共表達(dá)的譜系特異性基因決定的，Atoh7 是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell，RGC）分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因，與其他因子協(xié)同作用， 將RPC 分化為RGC 譜系。Mukherjee S 等[35]取患阿爾茨海默病尸檢的腦組織樣本，用Illumina sequencing 技術(shù)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，用Monocle 分析阿爾茨海默病的進(jìn)展過(guò)程、基因表達(dá)變化和分子變化，發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)與推斷疾病階段相關(guān)的基因[Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶14 基因 （A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 14 gene，ADAMTS14）、 白細(xì)胞介素7 基因（interleukin 7 gene，IL-7）和α-甘露糖苷酶2B1 基因（mannosidase alpha class 2B member 1 gene，MAN2B1）]，這些基因與免疫和溶酶體儲(chǔ)存功能有關(guān)。IL-7 與疾病轉(zhuǎn)歸和阿爾茨海默病的嚴(yán)重程度相關(guān)。ADAMTS14 是阿爾茨海默病易感性相關(guān)位點(diǎn)的一部分，通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）信號(hào)在免疫功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。 并揭示了與疾病擬時(shí)間相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)[膽堿能毒蕈堿M2 受體（cholinergic receptor muscarinic 2，CHRM2）和CHRM3]信號(hào)傳遞過(guò)程。 發(fā)現(xiàn)疾病擬時(shí)間與tau 負(fù)荷、Aβ 及阿爾茨海默病的認(rèn)知診斷高度相關(guān)， 該方法通過(guò)識(shí)別在不同疾病階段患者亞群中異常調(diào)節(jié)的特定通路，提供了更好的線(xiàn)索理解疾病的分子異質(zhì)性。 這為更好地分層患者和精準(zhǔn)醫(yī)療開(kāi)辟了可能。Hook PW等[36]取胚胎期第15.5 天與出生后第7 天的腦組織，對(duì)多巴胺能神經(jīng)元、黑質(zhì)神經(jīng)元進(jìn)行測(cè)序，擬時(shí)序分析構(gòu)建細(xì)胞軌跡，使用基因差異表達(dá)分析、基因集富集分析、加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析、全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association studies，GWAS）揭示了多巴胺能神經(jīng)元13 種亞型， 證實(shí)了缺失突觸活性帶蛋白1 基因（Complexin-1 gene，cplx1）的小鼠黑質(zhì)紋狀體通路受損。 α-突觸核蛋白基因（synuclein alpha gene，SNCA）、PDZ 鋅指結(jié)構(gòu)域4 基因（PDZ domain containing ring finger 4 gene，PDZRN4）、富亮氨酸重復(fù)激酶2基因（leucine rich repeat kinase 2 gene，LRRK2）等基因可能導(dǎo)致帕金森病（Parkinson disease，PD) 易感性。單細(xì)胞測(cè)序與擬時(shí)序分析為理解神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生機(jī)制而提供了新的技術(shù)手段。

2.3 神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療研究應(yīng)用

誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，是目前理論上認(rèn)為可以應(yīng)用于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種替代療法，并且這些細(xì)胞可以從脂肪組織、臍帶血和骨髓等組織中獲得[37]。了解干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞過(guò)程的分子機(jī)制，有助于成功獲取神經(jīng)細(xì)胞，用于修復(fù)受損的神經(jīng)組織，有望促進(jìn)神經(jīng)損傷的治療。 Treutlein B 等[38]在研究小鼠胚胎纖維母細(xì)胞 （mouse embryonic fibroblasts，MEF) 誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞過(guò)程中，取多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，用擬時(shí)序分析，揭示出分子重編路徑是連續(xù)的，轉(zhuǎn)錄因子Ascl1（achaete-scute family bHLH transcription factor 1）促進(jìn)MEF 退出細(xì)胞周期，向神經(jīng)細(xì)胞分化。 另一項(xiàng)類(lèi)似研究，Wang J 等[39]誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞分化為RGC， 對(duì)6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序建立文庫(kù)，6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別是MEF 重編的第0 天、第2 天、第4 天、第7 天、第9 天、第13 天的細(xì)胞，構(gòu)建細(xì)胞分化軌跡，安排細(xì)胞擬時(shí)間值，確定在重編過(guò)程中顯著變化基因的表達(dá)模式， 誘導(dǎo)MEF 后迅速下調(diào)了與“血管生成”、“凋亡過(guò)程”、“正調(diào)控細(xì)胞增殖”和“細(xì)胞骨架組織”途徑有關(guān)的基因、神經(jīng)元功能基因，如參與“突觸傳遞”、“神經(jīng)元遷移”和“學(xué)習(xí)”的基因在重新編程的末期被激活。 揭示了3 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，Ascl1、POU4 同源異型盒2（POU class 4 homeobox 2，Brn3b） 和胰島素增強(qiáng)子結(jié)合蛋白1（insulin gene enhancer binding protein 1，Isl1）可以有效地將纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化為RGC 樣神經(jīng)元 （RGC-like neurons，IRGC）。 Ascl1 和Isl1 的表達(dá)可以上調(diào)許多與神經(jīng)元發(fā)育和成熟有關(guān)的基因，Brn3b 抑制與 “骨骼系統(tǒng)發(fā)育”相關(guān)基因的表達(dá)。 Li H 等[40]誘導(dǎo)皮膚來(lái)源的纖維母細(xì)胞和肺來(lái)源的纖維母細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞， 并對(duì)這2 類(lèi)分化中的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序擬時(shí)序分析，揭示了纖維母細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的幾個(gè)主要調(diào)控基因 [TWIST 家族bHLH 轉(zhuǎn)錄因子1 基因（twist family bHLH transcription factor 1 gene，TWIST1）、TWIST2、 配對(duì)相關(guān)同源框1 基因（paired related homeobox 1，PRRX1）和PRRX2]在肺成纖維細(xì)胞中顯著下調(diào)，而在皮膚成纖維細(xì)胞中則沒(méi)有。 通過(guò)敲除這些基因和其他抑制神經(jīng)分化的基因[RE1 沉默轉(zhuǎn)錄因子基因（RE1 silencing transcription factor gene，REST）、 發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1 基因 （hairy and enhancer of split 1，HES1） 和帶有YRPW 基序2 的HES相關(guān)家族bHLH 轉(zhuǎn)錄因子基因 （hes related family bHLH transcription factor with YRPW motif 2 gene，HEY2）]，HEY2 和PRRX2 的聯(lián)合衰減顯著增強(qiáng)了由Ascl1 和p53 小發(fā)夾環(huán)RNA （p53 small hairpin RNA，p53 shRNA）誘導(dǎo)的人皮膚纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。 高表達(dá)Ascl1，敲除p53、HEY2 和PRRX2 （ap2p2），可促使人皮膚纖維母細(xì)胞在14 d 內(nèi)高效轉(zhuǎn)分化為微管相關(guān)蛋白2（microtubule associated protein 2，MAP2）神經(jīng)元。這可以為神經(jīng)損傷替代治療提供有價(jià)值的細(xì)胞來(lái)源。

3 小結(jié)與展望

單細(xì)胞RNA 測(cè)序、 擬時(shí)序分析已成為研究神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的有力工具，其促進(jìn)了對(duì)神經(jīng)組織發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵基因變化的認(rèn)識(shí)，為探索神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的機(jī)制提供重要的參考，為相關(guān)疾病的基因靶向治療提供了重要理論基礎(chǔ)，以及為神經(jīng)疾病替代治療和藥物篩選研究提供了有價(jià)值的細(xì)胞來(lái)源。然而單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和擬時(shí)序分析主要應(yīng)用在動(dòng)物模型中的神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)阿爾茨海默病、PD、肌萎縮性側(cè)索硬化等神經(jīng)退行性疾病研究較少，并且單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)仍有很多地方需要改進(jìn)，例如測(cè)序的深度和背景噪聲，以及目前沒(méi)有一個(gè)最佳擬時(shí)序算法來(lái)處理測(cè)序數(shù)據(jù)，準(zhǔn)確描繪細(xì)胞軌跡。相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)，隨著技術(shù)不斷改進(jìn)，單細(xì)胞RNA 測(cè)序、擬時(shí)序分析能為神經(jīng)退行性疾病提供更多獨(dú)特見(jiàn)解。