人工生物瓣抗鈣化性能檢測中陽性對照樣品限值的研究

付海洋，于秋航，2，楊 柳，王召旭，陳丹丹，付步芳

生物瓣屬于長期植入人體的第三類高風(fēng)險(xiǎn)醫(yī)療器械，產(chǎn)品質(zhì)量直接關(guān)系公眾身體健康和生命。 為了配合高風(fēng)險(xiǎn)醫(yī)療器械的監(jiān)管需求， 完善檢測方法，筆者探索應(yīng)用大鼠皮下植入模型檢測生物瓣抗鈣化性能實(shí)驗(yàn)中陽性對照的限值范圍，為制定相關(guān)方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支持。

生物瓣的材料來源于牛心包或豬心包，生物相容性好，植入后無需終身抗凝治療，植入生物瓣的患者比植入機(jī)械瓣的患者具有更高的生存質(zhì)量。但是由于材料的天然特性，生物瓣容易發(fā)生衰敗，使用壽命僅為10 ～15 年，耐久性能方面不如機(jī)械瓣[1～4]，鈣化是生物瓣衰敗的重要原因之一，抗鈣化性能是評價(jià)產(chǎn)品安全有效的一個(gè)重要指標(biāo)[5，6]。大鼠皮下植入實(shí)驗(yàn)評價(jià)抗鈣化性能的原理是檢測宿主對植入物的反應(yīng)，以易發(fā)生鈣化反應(yīng)的剛離奶幼年大鼠作宿主模型，觀察其對植入材料的鈣化反應(yīng)，驗(yàn)證材料抗鈣化處理工藝是否有效。 臨床數(shù)據(jù)顯示，不同個(gè)體對鈣化的敏感性不一樣；對于動(dòng)物個(gè)體而言，在鈣化方面也存在個(gè)體差異[6]。如何排除對鈣化不敏感的動(dòng)物個(gè)體？為了解決這個(gè)問題，制定可行可靠的方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，筆者通過非參數(shù)檢驗(yàn)的單樣本Kolmogorov-Smirnov 法對陽性對照鈣含量的數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)分析[7]，用正態(tài)分布法計(jì)算參考值范圍， 以此來限定陽性對照的最低限，以保證實(shí)驗(yàn)體系的可靠性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品與動(dòng)物

陽性對照樣品： 來自不同廠家12 批次未經(jīng)抗鈣化工藝處理的?；蜇i心包材料。

SPF 級3 周剛斷乳Wistar 雄性大鼠384 只，體質(zhì)量45 ～55 g。購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0006。

1.1.2 主要儀器與試劑

儀器： 火焰-原子吸收分光光度計(jì) （MKⅡM6）（Thermo Fisher 公司， 美國）； 微波消解儀MARS5（CEM 公司，美國）

試劑質(zhì)量濃度：1 000 μg/mL 鈣標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（GSB G 62012-90）， 中國計(jì)量科學(xué)研究院提供； 氧化鑭（99.99 %）、硝酸（優(yōu)級純）、鹽酸（分析純）、過氧化氫（分析純）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1 樣本制備

將未經(jīng)抗鈣化工藝處理的心包材料在無菌條件下剪成1 cm×1 cm 大小作為陽性對照樣品384 個(gè)。

1.2.2 動(dòng)物皮下植入實(shí)驗(yàn)

大鼠背部皮下分別植入陽性對照樣品，在植入第8 周對大鼠實(shí)施CO2安樂死， 取出植入陽性對照樣品，經(jīng)恒溫烘箱干燥至恒質(zhì)量，記錄每片樣品的恒質(zhì)量（M1）。

1.2.3 鈣含量測定和計(jì)算

樣品經(jīng)微波消解后，采用火焰原子吸收分光光度計(jì)測定樣品中鈣含量（M2）。

樣品中鈣元素的含量按式（1）計(jì)算：

其中：X 為樣品中鈣含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)百分比，以% 表示；M2 為樣品中鈣的質(zhì)量，單位為微克（μg）；M1 為樣品的恒質(zhì)量，單位為毫克（mg）。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析方法

利用SPSS 21 軟件， 對過去12 次實(shí)驗(yàn)中不同廠家的陽性對照樣品檢測結(jié)果進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)的單樣本Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)， 判斷是否符合正態(tài)分布。 如符合，則用正態(tài)分布法計(jì)算參考值范圍。

2 結(jié)果

2.1 陽性對照樣品鈣含量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

選取12 次實(shí)驗(yàn)中植入8 周后的陽性對照樣品鈣含量數(shù)據(jù)共384 份，計(jì)算其最大值、最小值、均值、方差、變異系數(shù)（表1）。 用非參數(shù)檢驗(yàn)的單樣本Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)法對所有陽性對照樣品鈣含量數(shù)值進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)分析， 得出其漸進(jìn)顯著性（雙側(cè)）sig.=0.279（P ＞0.05），符合正態(tài)分布。

表1 陽性對照樣品鈣含量統(tǒng)計(jì)Tab.1 Statistics of calcium content in positive controls

2.2 陽性對照樣品數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果

為了制作直方圖和正態(tài)分布圖，需要對384 份數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)計(jì)算，具體計(jì)算結(jié)果：最大值29.8%，最小值6.3%，極差23.5%，分組數(shù)20，分組組距1.1，均值（）19.6%，標(biāo)準(zhǔn)差（s）4.3%。

2.3 陽性對照樣品直方圖、正態(tài)分布圖

計(jì)算陽性對照樣品中鈣含量的頻數(shù)，在Excel 軟件中制作頻數(shù)分布直方圖；計(jì)算鈣含量的正態(tài)分布曲線函數(shù)值，添加正態(tài)分布曲線，調(diào)整圖表形式，形成正態(tài)分布曲線圖[8]（圖1）。

2.4 陽性對照樣品鈣含量的正常參考值范圍

采用正態(tài)分布法計(jì)算參考值范圍，按其給定的百分范圍計(jì)算，計(jì)算公式見表2[8，9]。 參考值范圍取95%的概率為正常值參考區(qū)間，陽性對照樣品鈣含量的正常參考值范圍為11%～28%。

表2 醫(yī)學(xué)參考值范圍的正態(tài)分布計(jì)算公式Tab. 2 Normal distribution calculation formula of medical reference value range

3 討論

臨床分析表明，生物瓣植入年齡小的宿主體內(nèi)更易發(fā)生嚴(yán)重鈣化。 在生物瓣植入10 年內(nèi)，年齡＞65歲患者有不到10%的會(huì)發(fā)生瓣膜衰??； 而年齡＜35歲患者，在植入后5 年就會(huì)幾乎一致地出現(xiàn)嚴(yán)重的瓣膜衰敗狀況[10，11]。 同樣幼年動(dòng)物普遍具有較高的鈣化敏感性，但動(dòng)物個(gè)體仍然存在差異性，即使都是幼年動(dòng)物，也有少數(shù)動(dòng)物對鈣化不敏感。 筆者研究中的陽性對照樣品來自多個(gè)廠家，所采取的處理工藝也不盡相同，共同之處是都未經(jīng)抗鈣化處理。 筆者研究匯集了12 次檢驗(yàn)中的陽性對照樣品384 個(gè)數(shù)據(jù)， 通過統(tǒng)計(jì)分析的方法驗(yàn)證了其鈣含量數(shù)據(jù)分布符合正態(tài)分布。 綜合考量大鼠模型的鈣化情況后，認(rèn)為95%的概率范圍能較好地兼顧可信度和精確度[9]，故實(shí)驗(yàn)中的參考值范圍取95%的概率為正常參考值區(qū)間，即陽性對照樣品的鈣含量的正常參考值范圍為11%～28%，與均值19.6%的出現(xiàn)區(qū)間相吻合。 設(shè)置陽性對照樣品的目的是為了排除對鈣化不敏感的動(dòng)物個(gè)體，若動(dòng)物對鈣化敏感性高，則陽性對照樣品鈣含量高，其檢測值可能會(huì)大于95%正常參考值區(qū)間的上限， 但這種個(gè)體更加有利于人們進(jìn)行抗鈣化性能檢測，因此這種個(gè)體不應(yīng)被排除在外，陽性對照樣品只需設(shè)置鈣含量的下限參考值，該值的確定有助于對實(shí)驗(yàn)體系的可靠性進(jìn)行控制。 例如在進(jìn)行抗鈣化評價(jià)實(shí)驗(yàn)時(shí)，大鼠背部左右兩側(cè)分別植入陽性對照樣品和實(shí)驗(yàn)樣品，如果陽性對照樣品鈣含量的值小于11%， 可以推測該動(dòng)物不是對鈣化敏感的個(gè)體，則實(shí)驗(yàn)樣品的檢測值可靠性就差，該動(dòng)物個(gè)體就不是合格的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，該樣品的檢測結(jié)果應(yīng)該被排除。在筆者所在課題組起草的醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物源性心血管植入物抗鈣化評價(jià)：大鼠皮下植入實(shí)驗(yàn)》中，陽性對照樣品是未經(jīng)抗鈣化處理的生物材料，其目的是通過設(shè)立陽性對照樣品以獲得確定的陽性結(jié)果，以此來判定實(shí)驗(yàn)體系的可靠性，陽性對照樣品下限值是該標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)重要技術(shù)參數(shù)，對制定該方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的制定具有重要意義。