同型半胱氨酸水平及MTHFR C677T基因多態(tài)性與腦卒中關(guān)系分析

張劍，張娟，魯鳳榮，唐中玉，焦淑芬，程麗娟，韓利

腦卒中是由于血管原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)缺陷，具有高發(fā)病率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，已成為全球性公共衛(wèi)生問題[1]。近年來，有多項(xiàng)研究指出高同型半胱氨酸血癥癥（hyperhomocystinemia，HHcy）與腦卒中的發(fā)生密切相關(guān)[2,3]。Hcy的濃度取決于遺傳因素和環(huán)境因素之間的相互作用。濃度升高可導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷、平滑肌增生和凝血異常，從而引起動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成，可增加腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)。亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）編碼的N5、N10 是Hcy 代謝的關(guān)鍵控制酶[4]，MTHFR 多態(tài)性是677位的胞嘧啶（C）與胸腺嘧啶（T）被取代，導(dǎo)致丙氨酸在氨基酸222 處轉(zhuǎn)化為纈氨，C677T 多態(tài)性與酶活性降低有關(guān)，導(dǎo)致Hcy 升高[5]。目前研究較多的是MTHFR 基因突變?yōu)镃677T 點(diǎn)突變，其頻率分布受人種、地域等因素的影響較大，并且其多態(tài)性與腦卒中的關(guān)系目前國(guó)內(nèi)外研究還存在爭(zhēng)議。本研究擬調(diào)查腦卒中人群和健康人群血清總Hcy 水平，MTHFR C677T 基因多態(tài)性是否存在差異，結(jié)合個(gè)體Hcy 水平及MTHFR C677T 基因多態(tài)性及對(duì)腦卒中進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為腦卒中的防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2020年10月至2021年4月，在某三甲醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科招募腦卒中患者236 例為病例組，其中男135 例，女81 例；平均年齡（63.2±12.8）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床診斷，頭顱MRI或CT掃描確診為腦卒中，符合1995年第四屆全國(guó)腦血管會(huì)議診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。另選擇同期在本院門診體檢的健康人群164 例為對(duì)照組，其中男90 例，女74 例；平均年齡（62.6±13.3）歲。2 組均排除腦出血、心房顫動(dòng)、甲狀腺功能亢進(jìn)、心源性卒中、靜脈血栓形成、外周血管疾病、肝臟疾病或腎臟疾病患者。本研究方案通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血漿Hcy 測(cè)定 受試者禁食水12 h，晨起采集空腹血2 mL，置于EDTA 抗凝試管中，于4 ℃下分離血漿，使用Hcy 試劑（北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司）通過酶循環(huán)測(cè)定法檢測(cè)Hcy 水平。Hcy正常范圍為5～15 μmol/L，＞15 μmol/L 是HHcy 的指征。

1.2.2 MTHFR 的基因分型 使用苯酚-氯仿法從EDTA 抗凝的2 mL 外周靜脈血中提取基因組DNA。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法對(duì)MTHFR 基因多態(tài)性進(jìn)行基因分型。使用以下引物對(duì)擴(kuò)增DNA：5'-TGAAGGAG AAGGTGTCTGCGGGA-3'（有義）和5'-AGGACGG TGCGGTGAGAGTG-3'（反義）。PCR混合物（25 μL）含有2.5 μL STR 緩沖液（MgCl2，dNTP 和10×緩沖液），有義和反義引物各2.5 μL，0.4 μL TaqDNA聚合酶（購于上海寶生公司），使用ddH2O將1.5 μL基因組DNA總體積調(diào)節(jié)至25μL，擴(kuò)增如下進(jìn)行：94 ℃預(yù)變性2 min；然后進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，94 ℃變性30 s，62 ℃變性30 s，72 ℃變性30 s；72 ℃延伸5 min。用限制酶Hinf I（Promega Corp，Madison）消化PCR 產(chǎn)物。通過混合10 μL PCR產(chǎn)物，0.5 μL HinfI，2.0 μL緩沖液R 和7.5 μL ddH2O 制備20 μL 的反應(yīng)混合物。將反應(yīng)混合物在37 ℃下溫育3 h。然后，通過在2%瓊脂糖凝膠上在100 V 電泳30 min 分離PCR片段。沒有限制酶位點(diǎn)的野生型（CC）基因型產(chǎn)生198 bp 片段。雜合（CT）基因型產(chǎn)生2個(gè)片段：198 bp和175 bp，純合突變體（TT）產(chǎn)生175 bp片段。

1.2.3 DNA測(cè)序分析 為驗(yàn)證PCR-RFLP的基因分型結(jié)果，隨機(jī)選擇20例不同基因型的受試者進(jìn)行DNA測(cè)序分析。所有基因型與第一輪PCR-RFLP基因分型獲得的基因型相同。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Hardy-Weinberg平衡定律計(jì)算各等位基因頻率數(shù)據(jù)分布可靠性。

2 結(jié)果

2.1 2組MTHRF C677T基因型檢測(cè)結(jié)果

病例組MTHFR 基因TT 型及T 等位基因等位基因頻率均高于對(duì)照組（P＜0.05），CC 型及C 等位基因均低于對(duì)照組（P＜0.01），見表1。

表1 各組MTHFR基因及等位基因頻率分布[例(%)]

2.2 病例組MTHFR基因分布頻率

病例組MTHFR等位基因頻率分布符合Hardly-Weinberg遺傳平衡定律（χ2=2.782，P=0.249），數(shù)據(jù)來自同一遺傳群體，見表2。

表2 病例組MTHFR C677T基因Hardly-Weinberg遺傳平衡分析

2.3 MTHFRC667T不同基因型和Hcy水平關(guān)系

不同MTHFRC667T基因型中，病例組的Hcy濃度顯著高于對(duì)照組（均P＜0.01）；不同基因人群Hcy 濃度不同，TT 型最高，CT型次之，CC型最低，提示T等位基因突變可能會(huì)引起Hcy升高（P＜0.01），見表3。

表3 2組不同MTHFRC667T基因型的Hcy水平比較（μmol/L，±s）

表3 2組不同MTHFRC667T基因型的Hcy水平比較（μmol/L，±s）

組別對(duì)照組病例組t值P值例數(shù)164 236 CC 10.49±4.72 14.59±4.16 5.370 0.005 CT 10.09±3.78 16.30±4.05 10.970 0.001 TT 17.67±5.06 26.90±10.37 5.810 0.005

3 討論

腦卒中已成為我國(guó)居民首要死亡原因，據(jù)預(yù)測(cè)，2030年腦卒中發(fā)生率比2010年增加50%[7]。隨著我國(guó)人口老齡化的加劇，腦卒中日益成為危害居民健康的問題之一，造成嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，探索腦卒中預(yù)防及治療新手段至關(guān)重要。腦卒中發(fā)生與高血壓、血脂異常、肥胖、飲食、吸煙、飲酒、缺乏體育鍛煉等因素有關(guān)。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，遺傳因素越來越受重視。MTHFR 是葉酸代謝的主要酶之一，將5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸[8]，5-甲基四氫葉酸作用于Hcy與甲硫氨酸的再甲基化反應(yīng)。MTHFR C677T多態(tài)性與血漿HCY水平升高有關(guān)[9]，METHFR基因677位點(diǎn)上有C/C、C/T、T/T3種分型，其中TT酶活性比CC酶活性低55%，酶活性的降低導(dǎo)致Hcy濃度的升高。Hcy 濃度增加會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮的損傷、血管平滑肌增殖、凝血因子的激活影響纖溶酶原激活物抑制劑的表達(dá)，從而抑制硫酸化肝素，血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)和組織型纖溶酶原激活物合成的合成，其可導(dǎo)致血小板聚集引起腦卒中的發(fā)生[10]。有研究指出Hcy濃度增高，是血栓形成的重要因素之一，排除混雜因素后，Hcy濃度增加5 μmol/L，腦卒中風(fēng)險(xiǎn)增加59%[11,12]。

本研究中共檢測(cè)出3 種MTHFR 基因型分別是：CC 型、CT型、TT型。卒中組MTHFR基因TT型及T等位基因頻率均高于對(duì)照組（P＜0.05），CC 型及C 等位基因均低于對(duì)照組（P＜0.01）。說明腦卒中患者中TT型基因及T等位基因比例高于健康人群，而CC型基因及C等位基因低于健康人群，提示TT型基因人群是可能腦卒中高發(fā)人群。國(guó)外學(xué)者對(duì)于MTHFR C677T與腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)已有研究，Li等[13]納入300例腦卒中患者和216例對(duì)照者，結(jié)果顯示TT 型患者腦卒中發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)是CC 型的2.15 倍。翁秋燕等[14]分析78 例腦卒中患者和82 例非卒中人群的基因分型，結(jié)果顯示TT型患者腦卒中腦卒中風(fēng)險(xiǎn)是CC型的2.717 倍。上述結(jié)果與本研究結(jié)果相一致。但也有研究發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T基因與腦卒中的發(fā)生沒有相關(guān)性[15]，這可能與入組人群差異有關(guān)。

病例組和對(duì)照組的MTHFR基因C677T基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律，表明本研究對(duì)象具有人群代表性。本研究中TT型基因人群中Hcy水平高于CT和CC基因型（P＜0.01），說明Hcy與MTHFR C677T多態(tài)性密切相關(guān)，但作用機(jī)制尚不明確，可能是677位的胞嘧啶（C）與胸腺嘧啶（T）取代導(dǎo)致丙氨酸在氨基酸222 處轉(zhuǎn)化為纈氨酸，然后降低MTHFR 酶活性，參與Hcy新陳代謝。

本研究證實(shí)Hcy 水平升高與腦卒中相關(guān)，MTHFR C677T多態(tài)性可能與遺傳因素相關(guān)，綜合考慮患者Hcy水平和基因分型，對(duì)腦卒中的防治發(fā)生意義重大。本研究由于樣本量較小，單中心研究，結(jié)果可能存在局限性，將來開展大樣本、多中心研究以期得到更為精確的結(jié)果。