干細(xì)胞在心血管疾病治療中的應(yīng)用研究

張海峰 韋 植

(1 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東省廣州市 510080；2 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二三醫(yī)院心胸外科，廣西南寧市 530021)

近年來(lái)我國(guó)心血管疾病的患病率持續(xù)上升，《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2020》[1]數(shù)據(jù)顯示，2020年我國(guó)心血管疾病現(xiàn)患病人數(shù)約3.3億，居各類疾病之首。心血管疾病可造成心肌細(xì)胞缺血壞死、壞死區(qū)域瘢痕組織修復(fù)、心肌收縮功能下降、心律失常，最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)心力衰竭而死亡。目前，心肌缺血的主要治療方法有藥物治療、冠狀動(dòng)脈介入或搭橋手術(shù)、心臟輔助裝置、心房分流、終末期的心臟移植等，前5種方法可在一定程度上延緩心力衰竭的進(jìn)展，但不能使死亡心肌再生，而目前心臟移植的供體仍嚴(yán)重匱乏且費(fèi)用高，手術(shù)要求和條件高，難以普及。干細(xì)胞在特定誘導(dǎo)條件下可定向分化成有收縮功能的心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，將其移植至缺血壞死的心肌區(qū)域，可通過(guò)肌電耦連和旁分泌作用，使心肌收縮增強(qiáng)、血管再生、心肌再生，從而改善心功能，因此干細(xì)胞一直是生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。目前，治療心血管疾病的干細(xì)胞主要有誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)、心臟干細(xì)胞(cardiac stem cell，CSC)和胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)。其中，ESC為同種異體干細(xì)胞，其主要來(lái)源于早期發(fā)育的胚胎，但由于其存在倫理和免疫排斥等問(wèn)題，限制了其在臨床上的應(yīng)用。本文就iPSC、MSC和CSC在心血管疾病治療方面的優(yōu)點(diǎn)和局限性進(jìn)行總結(jié)，旨在為干細(xì)胞在心血管疾病治療中的應(yīng)用提供參考。

1 iPSC

iPSC是自體成熟體細(xì)胞經(jīng)過(guò)重編程后獲得的具有自我更新和多能分化能力的一種細(xì)胞。2006年，Takahashi等[2]將轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4轉(zhuǎn)染到小鼠的成纖維細(xì)胞中，首次獲得了類似ESC的多能干細(xì)胞。次年，該團(tuán)隊(duì)對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行重編程，獲得了具有細(xì)胞再生及分化能力的細(xì)胞，這是首個(gè)誘導(dǎo)出的人源iPSC[3]。iPSC來(lái)源廣泛，且其不存在倫理和免疫排斥等方面的問(wèn)題，因此極利于研究及臨床試驗(yàn)的開(kāi)展。但因c-Myc這一常見(jiàn)原癌基因的加入和病毒的參與，iPSC在分化過(guò)程中有向腫瘤細(xì)胞分化的風(fēng)險(xiǎn)，且定向分化成心肌細(xì)胞的效率也比較低。因此，關(guān)于iPSC的主要研究方向是如何改進(jìn)重編程技術(shù)，使其在誘導(dǎo)過(guò)程中去腫瘤細(xì)胞化，提高其向心臟祖細(xì)胞分化的純度，以及采用何種培養(yǎng)分化方法提高其分化成心肌細(xì)胞的數(shù)量、移植區(qū)的富集。2009年，Yu等[4]通過(guò)新的編程方法，去除病毒載體和原癌基因 c-Myc而獲得iPSC，解決了病毒載體和原癌基因 c-Myc導(dǎo)致癌變的難題。目前，制備iPSC的主要方法有細(xì)胞核移植、轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)及化學(xué)重編程?；瘜W(xué)重編程具有操作簡(jiǎn)便、時(shí)空調(diào)控性強(qiáng)、作用可逆、細(xì)胞重編程過(guò)程高度可控等優(yōu)點(diǎn)。另外，小分子誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程技術(shù)規(guī)避了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因操作引發(fā)的安全問(wèn)題，使其應(yīng)用于臨床的可能性大大增加。促進(jìn)iPSC分化成心肌細(xì)胞的方法有擬胚體生成法、與內(nèi)臟內(nèi)胚層樣細(xì)胞共培養(yǎng)、2D單層培養(yǎng)法、3D懸浮培養(yǎng)法等。其中3D懸浮培養(yǎng)法能產(chǎn)生大量心肌細(xì)胞，且生產(chǎn)成本低、效率相對(duì)較高。2014年，一例年齡相關(guān)性黃斑變性患者接受了iPSC衍生細(xì)胞移植，移植后第1年，該患者沒(méi)有出現(xiàn)畸胎瘤形成等移植后的免疫排斥跡象，且視力得到相應(yīng)改善[5]，該方法的安全性和有效性由此得到了初步認(rèn)可。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，把iPSC注入大鼠的缺血心肌區(qū)域，iPSC可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，并且可以增加心臟射血分?jǐn)?shù)、減少纖維化[6-7]。另有研究結(jié)果顯示，通過(guò)心肌內(nèi)的微球移植術(shù)將iPSC衍生的心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞整合到豬的缺血心肌內(nèi)，可以提高左室射血分?jǐn)?shù)，改善心肌代謝及減少梗死面積[8]。移植定向分化的心肌干細(xì)胞不僅可與周圍正常心肌細(xì)胞建立電生理整合、增加心肌細(xì)胞收縮功能，還能分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管緊張素-1、血管緊張素-2、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、趨化因子-1、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-10、血小板衍化生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、胸腺素-β4、Wnt5a和促紅細(xì)胞生成素等因子營(yíng)養(yǎng)心肌，改善心臟的收縮功能[9]。2015 年，Menasché等[10]將人ESC來(lái)源的心肌祖細(xì)胞移植到晚期缺血性心力衰竭患者的心臟中，結(jié)果未見(jiàn)腫瘤生成，患者的心功能獲得改善。這使得iPSC在心血管疾病治療中的應(yīng)用前景更加廣闊。但不管采用何種編程方法，一次編程所產(chǎn)生的iPSC的效率仍較低，其定向分化成心肌細(xì)胞的數(shù)量尚少，且其潛在的致瘤風(fēng)險(xiǎn)尚不能完全排除，這限制了iPSC在臨床上的廣泛應(yīng)用。如何攻克這一難點(diǎn)，將是今后重點(diǎn)研究的方向。值得注意的是，2018年日本批準(zhǔn)了一項(xiàng)將iPSC衍生的心肌樣細(xì)胞用于治療心臟病的臨床試驗(yàn)[11]，該研究主要觀察iPSC衍生的心肌樣細(xì)胞治療心臟病的安全性及其對(duì)心功能恢復(fù)情況的影響。這是該細(xì)胞首次被批準(zhǔn)用于治療心臟病的臨床研究，研究的結(jié)果將會(huì)引起全球的廣泛關(guān)注。

2 MSC

MSC是非終末分化細(xì)胞的一種，主要存在于骨髓、脂肪組織、臍帶血和胎盤等多種組織中，其主要表達(dá)典型標(biāo)志物如CD146、CD90、CD105、CD73等，具有極強(qiáng)的多向分化潛能和自我更新能力。在體外特定的誘導(dǎo)條件下，MSC可以分化為心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后其仍具有多向分化潛能[12]。研究顯示，不論是自體還是同種異源的MSC，一般都不會(huì)引起宿主免疫反應(yīng)，因此其應(yīng)用較為廣泛。通過(guò)富含多種生長(zhǎng)因子培養(yǎng)基的定向誘導(dǎo)，可以使MSC分化成不同類型的心肌細(xì)胞用于心臟的修復(fù)[13]。臨床中，用于治療心血管疾病的MSC主要來(lái)自骨髓和脂肪組織，取材容易，來(lái)源方便。MSC主要通過(guò)以下幾種機(jī)制治療缺血性心血管疾?。?1)通過(guò)MSC刺激心臟細(xì)胞的增殖和分化，以及血管的生成。有研究人員在豬的心肌缺血模型中驗(yàn)證了MSC可以刺激心臟細(xì)胞的增殖和分化這一結(jié)論，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)MSC可以分化成心肌細(xì)胞和血管，并且具有調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的功能[14]。(2)通過(guò)分泌生長(zhǎng)因子及旁分泌作用促進(jìn)心臟修復(fù)，減少心肌細(xì)胞凋亡。MSC可以促進(jìn)外泌體和細(xì)胞外囊泡以可溶性形式分泌、釋放出多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。Zhang等[15]將MSC分泌的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子與CSC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其可增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化能力，促進(jìn)血管新生，減少纖維化，這提示含有這些細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子的外泌體是MSC的關(guān)鍵活性成分。此外，通過(guò)旁分泌機(jī)制也可刺激內(nèi)源性心臟祖細(xì)胞釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1等因子，使其向心肌缺血區(qū)遷移和增殖，進(jìn)而分化成心肌細(xì)胞，增強(qiáng)心肌功能[16]。有研究表明，MSC可釋放出富含miR-22的外泌體，這些外泌體進(jìn)入心肌細(xì)胞內(nèi)與甲基CpG結(jié)合蛋白2 (Mecp2) 相互作用，可阻止心肌細(xì)胞凋亡[17]。(3)免疫調(diào)節(jié)。Krampera等[18]研究發(fā)現(xiàn)MSC能夠抑制梗死心肌細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，減少炎癥細(xì)胞與炎癥因子對(duì)心肌造成的急性損傷。Luger等[19]發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注時(shí)，靜脈輸注MSC能抑制自然殺傷細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的活性，緩解左心室功能減弱和逆轉(zhuǎn)心肌重塑。在動(dòng)物模型中，將同種異體的骨髓 MSC 注入心肌梗死后的綿羊冠狀動(dòng)脈內(nèi)，可使其左心室射血分?jǐn)?shù)增加，并使心肌梗死面積減少約40%[20]。免疫組化分析和心臟核磁成像結(jié)果顯示，在異位心臟移植大鼠術(shù)后48 h靜脈注射骨髓 MSC，治療28 d后可觀察到大鼠移植心臟的心功能增強(qiáng)、心肌纖維化減少、心肌細(xì)胞凋亡受到抑制，此外該法還可以促進(jìn)心室重構(gòu)和新血管生成[21]。多種動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)都表明MSC治療缺血性心臟病可獲得良好的效果。例如，2004年Chen等[22]將69例發(fā)病12 h內(nèi)的急性ST段抬高型心肌梗死患者隨機(jī)分成兩組，予冠狀動(dòng)脈分別注射自體骨髓MSC和生理鹽水，隨訪6個(gè)月顯示干細(xì)胞治療組患者的心肌功能較對(duì)照組改善。骨髓MSC治療急性心肌梗死的多中心隨機(jī)臨床試驗(yàn)[23]結(jié)果顯示，經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植骨髓MSC治療急性心肌梗死可提高患者的心肌血流灌注和左室射血分?jǐn)?shù)，且治療的可行性和安全性均較高，未見(jiàn)發(fā)生相關(guān)的室性心律失常或其他主要不良心臟事件。為了更大規(guī)模地評(píng)估MSC在臨床應(yīng)用中的安全性和有效性，2018年Lalu等[24]對(duì)MSC治療心肌缺血的23個(gè)臨床研究(包含1 148例患者)進(jìn)行了一項(xiàng)薈萃分析，結(jié)果顯示，MSC治療急性心肌梗死和缺血性心力衰竭整體上是安全有效的，能改善心臟功能，縮小心肌梗死面積，明顯降低心肌梗死復(fù)發(fā)率和死亡率，雖然部分患者輸注MSC后可引起短暫性發(fā)熱，但無(wú)治療相關(guān)的急性毒性反應(yīng)、感染、腫瘤形成，無(wú)致死性心律失常發(fā)生。此后大規(guī)模的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步展開(kāi)，如NCT01652209、NCT03404063等，截至2021年6月，在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的臨床試驗(yàn)注冊(cè)網(wǎng)站(clinicaltrials.gov)上有關(guān)MSC治療缺血性心臟病的臨床項(xiàng)目達(dá)到56項(xiàng)，且近幾年來(lái)該類研究項(xiàng)目不斷呈現(xiàn)增多的趨勢(shì)，顯示出巨大的應(yīng)用潛力和前景。目前，已有用于治療心臟病的MSC產(chǎn)品在美國(guó)、韓國(guó)、歐盟國(guó)家等獲批使用，我國(guó)也有多款MSC產(chǎn)品獲準(zhǔn)進(jìn)行臨床試驗(yàn)研究。

3 CSC

成體心臟曾一度被認(rèn)為是終末分化器官，心肌梗死后不能再生。2003年，Beltrami等[25]在《Cell》雜志發(fā)表一項(xiàng)研究成果，其認(rèn)為成體心臟中存在著一群能在體內(nèi)分化為心肌細(xì)胞的c-Kit+細(xì)胞(即心肌干細(xì)胞)，其將c-Kit+細(xì)胞分離后在體外進(jìn)行培養(yǎng)、富集后注射到壞死心肌細(xì)胞區(qū)域，20 d后發(fā)現(xiàn)移植c-Kit+細(xì)胞分化產(chǎn)生的心肌細(xì)胞可以修復(fù)大部分壞死區(qū)域、改善心臟收縮功能，由此認(rèn)為心臟內(nèi)存在內(nèi)源性干細(xì)胞。該研究成果發(fā)布后在學(xué)術(shù)界引起巨大反響，隨后陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)不同表面標(biāo)志的CSC，包括胚胎抗原-1+CSC、干細(xì)胞抗原-1+CSC、胰島素增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-1+CSC、側(cè)群細(xì)胞、心肌球源性細(xì)胞和心肌球細(xì)胞、心外膜源性細(xì)胞，但各種CSC分布的位置和比例均不相同[26-29]，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明CSC具有心肌細(xì)胞和血管的結(jié)構(gòu)特性[30]。自體CSC可從心耳、心室、心外膜活檢中獲得，在移植前將CSC進(jìn)行體外培養(yǎng)、增殖[31]，可得到大量的CSC，足以進(jìn)行心肌干細(xì)胞移植，且其對(duì)心肌收縮功能的改善作用顯著，因此，CSC移植治療心肌缺血具有廣闊的應(yīng)用前景。但在2004年，Murry等[32]采用類似的細(xì)胞譜系追蹤實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)骨髓來(lái)源的c-Kit+細(xì)胞在體內(nèi)可分化為心肌細(xì)胞，而只能分化為血細(xì)胞。2012年Jesty等[33]采用相同方法并不能重復(fù)Beltrami等[25]關(guān)于c-Kit+心肌干細(xì)胞在成年梗死的心肌中可轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞的研究結(jié)果。2014年van Berlo等[34]在《Nature》上發(fā)文質(zhì)疑Beltrami等[25]聲稱的心肌干細(xì)胞在治療心肌梗死中的作用，該研究發(fā)現(xiàn)心肌干細(xì)胞治療心肌梗死的效果非常有限，其不能在梗死的患者中產(chǎn)生足夠量的心肌細(xì)胞。2018年，經(jīng)哈佛大學(xué)等相關(guān)部門調(diào)查后認(rèn)定[35]，Beltrami等[25]研究者涉嫌捏造數(shù)據(jù)和論文造假，最終其發(fā)表的34篇論文被相關(guān)雜志撤銷，這使得CSC治療心血管疾病的臨床試驗(yàn)基本停滯。但在一些臨床試驗(yàn)如SCIPIO試驗(yàn)[28]、CADUCEUS試驗(yàn)[29]中發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射內(nèi)源性CSC，能提高心肌缺血患者的左室射血分?jǐn)?shù)，縮小心肌梗死面積和瘢痕組織，增強(qiáng)心臟局部收縮功能，患者的生活質(zhì)量獲得提高。這可能與以下原因有關(guān)：不同表面標(biāo)志的CSC雖不能分化成心肌細(xì)胞，但其旁分泌作用可以促進(jìn)心臟內(nèi)源性干細(xì)胞的遷移、增殖、分化和血管形成，還可以促進(jìn)內(nèi)源性CSC的募集，抑制梗死區(qū)細(xì)胞的凋亡，抗心肌重塑，從而改善心臟功能[36-39]。由于成體心肌細(xì)胞中仍存在非常緩慢的細(xì)胞分裂能力，在心肌缺血出現(xiàn)后，如何提升其分裂成心肌細(xì)胞的能力，代替壞死心肌細(xì)胞發(fā)揮作用，改善心功能，或?qū)⑹墙窈笱芯康臒狳c(diǎn)。

4 小結(jié)與展望

心力衰竭是心血管疾病患者死亡的主要原因，干細(xì)胞移植不僅能提供新生的心肌細(xì)胞，還可通過(guò)分泌各種營(yíng)養(yǎng)心肌的因子來(lái)改善心功能，是治療急性心肌梗死、心臟缺血再灌注損傷、缺血性心臟病的理想選擇。由于ESC存在倫理和免疫排斥等問(wèn)題，導(dǎo)致其在臨床上的應(yīng)用受到限制。而iPSC具有類似ESC的特性，能分化形成大量心肌細(xì)胞，但由于其存在誘發(fā)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，因此需要在重編程技術(shù)方面作進(jìn)一步研究，以達(dá)到在移植前將其定向分化為心肌細(xì)胞的目的。MSC具有免疫調(diào)節(jié)特性且來(lái)源方便，還可以進(jìn)行同種異體移植，目前其在臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用已經(jīng)取得一定的成果，應(yīng)用前景十分廣闊，但仍面臨移植存活力低、體外培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)移植后細(xì)胞的歸巢率越低等問(wèn)題。內(nèi)源性CSC能否分化為心肌細(xì)胞目前未能得到公認(rèn)，且其療效尚存疑，而成體心肌細(xì)胞仍有細(xì)胞分裂能力，但其數(shù)量少，分裂效率低下，如何提高其分裂能力或是今后研究的方向之一。在臨床實(shí)踐中，干細(xì)胞治療的時(shí)機(jī)、細(xì)胞數(shù)量、療程、輸注方式、如何提高靶區(qū)富集等仍是需要解決的問(wèn)題。不同技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用應(yīng)是今后臨床治療心血管疾病的主要方向，例如通過(guò)生物材料為干細(xì)胞提供生物性能和結(jié)構(gòu)上的支持，以促進(jìn)干細(xì)胞的定植、生長(zhǎng)和分化，從而提高細(xì)胞的移植率[40]；將干細(xì)胞與ESC來(lái)源的外泌體共培養(yǎng)，然后移植到心肌缺血處以促進(jìn)干細(xì)胞存活和增殖，提高其分化成心肌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力，以改善心肌收縮功能[41]。此外，選擇何種給藥方式來(lái)避免肺部對(duì)干細(xì)胞的清除，如何一次取得足夠量的原代細(xì)胞以減少干細(xì)胞體外培養(yǎng)的時(shí)間，讓干細(xì)胞更好地保持其干性，從而更好地發(fā)揮其療效也是今后研究的重點(diǎn)，需要進(jìn)行大量的臨床實(shí)踐。