布魯氏菌生物恐怖戰(zhàn)劑RTqPCR現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法研究

張立安,宗 鵬，任小俠，侯亞欣，王 楠，王慧飛

1.煙臺(tái)市消防救援支隊(duì)，山東 煙臺(tái) 264000； 2.撫州市消防救援支隊(duì)，江西 撫州 344000； 3.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081； 4.中國(guó)人民警察大學(xué) a.研究生院； b.偵查學(xué)院，河北 廊坊 065000

0 引言

生物恐怖襲擊是指利用細(xì)菌、病毒和毒素等生物制劑作為武器針對(duì)人類、動(dòng)物和農(nóng)作物實(shí)施攻擊，造成傷亡、制造恐慌的一種恐怖主義形式。布魯氏菌作為失能型生物恐怖戰(zhàn)劑，可以感染人和牲畜導(dǎo)致布魯氏菌病[1-3]。根據(jù)《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》，布魯氏菌病為乙類傳染病[4]，世界衛(wèi)生組織將其列為B類法定傳染病[5]。根據(jù)疾病預(yù)防控制局的資料顯示，2018年我國(guó)布魯氏菌發(fā)病人數(shù)為37 947人，截止到2019年11月，2019年發(fā)病人數(shù)達(dá)43 635人。2010年?yáng)|北農(nóng)業(yè)大學(xué)27名學(xué)生和1名教師感染了布魯氏菌病，2019年12月蘭州獸醫(yī)研究所發(fā)現(xiàn)96人感染布魯氏菌病。布魯氏菌病原體可通過(guò)體表皮膚黏膜、消化道、呼吸道侵入機(jī)體，人類患病的途徑多樣，包括食用未經(jīng)高溫消毒的牛奶和奶制品，直接接觸受感染的動(dòng)物組織，誤食、吸入或注射培養(yǎng)的布魯氏菌等[6]。布魯氏菌病會(huì)造成嚴(yán)重的并發(fā)癥甚至有死亡危險(xiǎn)，因此快速精準(zhǔn)檢測(cè)布魯氏菌、及時(shí)進(jìn)行應(yīng)急處置顯得尤為重要。

自2000年以來(lái)，人類布魯氏菌病是發(fā)病數(shù)上升速度最快的傳染病之一[7-8]，而且布魯氏菌病具有潛伏期，臨床分為急性、亞急性、慢性三類，急性潛伏期在3個(gè)月以內(nèi)，慢性潛伏期可達(dá)6個(gè)月[9]。因此，及時(shí)準(zhǔn)確偵檢是應(yīng)對(duì)布魯氏菌生物恐怖襲擊的有效措施。目前血培養(yǎng)檢測(cè)布魯氏菌病是金標(biāo)準(zhǔn)[10-11]，我國(guó)現(xiàn)行《布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS 269—2019)規(guī)定SAT和分離布魯氏菌均為檢測(cè)方法。布魯氏菌傳統(tǒng)血清學(xué)方法檢測(cè)的特異性不強(qiáng)，且檢測(cè)結(jié)果受檢測(cè)人員主觀意識(shí)影響較大。細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，檢測(cè)對(duì)試驗(yàn)環(huán)境、設(shè)備及操作人員要求較高，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)?，F(xiàn)場(chǎng)試紙檢測(cè)受檢測(cè)時(shí)機(jī)限制及環(huán)境溫度等影響，其靈敏度檢出限還有待技術(shù)完善和提高。分子生物學(xué)鑒定是近幾年逐步發(fā)展的技術(shù)，具有特異高效的優(yōu)點(diǎn)，在布魯氏菌基因檢測(cè)方面利用核糖體RNA、Omp25、IS711、BCSP31等保守序列做了大量研究和方法構(gòu)建。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RTqPCR)方法具有靈敏性高、特異性好等特點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用廣泛，反恐應(yīng)急等部門(mén)也做了大量嘗試和探索[12-14]。1990年，F(xiàn)ekete等開(kāi)創(chuàng)了布魯氏菌PCR檢測(cè)先河，并利用多重PCR進(jìn)行基因分型[15-17]。本文探討適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)布魯氏菌的PCR方法，以期提高應(yīng)急處突檢測(cè)能力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器

試驗(yàn)材料：布魯氏菌滅活疫苗株(S2)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所惠贈(zèng)；Sybr Green qPCR mix、Taq PCR MasterMix、細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒均購(gòu)自北京艾德萊(Aidlab)生物有限公司；D2000 DNA Ladder購(gòu)自Biosharp公司；Petrifim 6406菌落測(cè)試片(3M公司)；布魯氏菌基因的載體構(gòu)建由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司完成；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┗蚱渑渲贫?。主要儀器：LightCycler 1.5型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)，MyCycler型PCR儀(美國(guó)Bio-rad公司)，JY600C型水平電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，AlphaDigiDoc實(shí)時(shí)凝膠處理系統(tǒng)(美國(guó)Alpha Innotech公司)，MSC12型生物安全柜(美國(guó)Thermog公司)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

利用NCBI公布的16S核糖體RNA基因序列，通過(guò)BLAST和DNAMAN 6.0對(duì)比分析，利用MEGA 6.06軟件的鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，分析基因相似性。用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)上下游引物，如表1所示，引物由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成。

表1 引物序列及參數(shù)

1.2.2 質(zhì)粒的提取與鑒定

按照Aidlab高純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒的操作步驟提取質(zhì)粒，作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。利用普通PCR進(jìn)行目的基因鑒定，20 μL反應(yīng)體系，Taq PCR MasterMix(Aidlab)10 μL，上下游引物B16SF、B16SR各0.5 μL，底物1 μL，雙蒸水8 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃，3 min，1個(gè)循環(huán)；變性94 ℃，10 s；退火/延伸60 ℃，30 s，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后成像鑒定。

1.2.3 熒光定量正交試驗(yàn)

選擇退火時(shí)間、退火溫度、引物量設(shè)計(jì)3水平3因素如表2所示的L9(34)正交試驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL：Sybr Green qPCR mix 10 μL，上下游引物qBSF1、qBSR2各nμL，底物1 μL，雙蒸水8 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃，3 min，1個(gè)循環(huán)；變性94 ℃，10 s；退火/延伸m℃，ks，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線40～85 ℃，升溫速率0.2 ℃·s-1。

表2 參數(shù)設(shè)置

1.2.4 靈敏度與特異性檢測(cè)

以10倍梯度稀釋得到濃度為10-1～10-7的稀釋菌液，取100 μL噴涂在菌落測(cè)試片上，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)菌斑，計(jì)算菌液濃度。使用稀釋濃度菌液，按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行RTqPCR反應(yīng)，Ct值和溶解曲線分析反應(yīng)靈敏度和特異性。

1.2.5 環(huán)境樣本測(cè)試

采集草坪里的積水和地表土壤樣本，樣本處理方法為：使用移液槍吸取1 mL采集樣本到一個(gè)離心管中，3 000 rpm離心5 min，使用移液槍吸取上清液轉(zhuǎn)入新離心管中，13 000 rpm離心30 s，吸取下層液體作為檢測(cè)樣品，進(jìn)行RTqPCR檢測(cè)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

通過(guò)NCBI獲得羊、牛、豬等種類布魯氏菌(Brucella_melitensis_16M、Brucella_abortus、Brucella_ovis、Brucella_suis)的16S rRNA基因序列，通過(guò)生物信息學(xué)分析，選取高度同源保守序列片段，PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳獲得如圖1所示結(jié)果，與預(yù)期相符，且不在其他位置產(chǎn)生擴(kuò)增條帶。測(cè)序?qū)Ρ确治鰹椴剪斒暇?6S rRNA目標(biāo)基因片段。

圖1 PCR擴(kuò)增凝膠鑒定結(jié)果

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

PCR反應(yīng)過(guò)程以單鏈DNA為模板，在反應(yīng)溶液中經(jīng)過(guò)變性、退火、延伸、循環(huán)使目的基因得以迅速擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系主要有Mix、水、引物和樣品模板。由于Mix為緩沖體系，具有一定緩沖能力，兩步反應(yīng)中退火過(guò)程是引物與模板結(jié)合復(fù)制的過(guò)程，直接影響PCR的反應(yīng)效率，引物量是一個(gè)重要變量。退火溫度和退火時(shí)間是影響RTqPCR反應(yīng)的兩個(gè)條件變量，通過(guò)這三個(gè)要素的3水平3因素L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。在正交試驗(yàn)中極差R值越大，則表明該因素水平的改變對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響越大，結(jié)果顯示引物量的R值為4.68，遠(yuǎn)大于退火時(shí)間的1.93和退火溫度的1.62，反應(yīng)中一般增加反應(yīng)物濃度有利于反應(yīng)的正向進(jìn)行，因此引物量為主要影響因素。k值體現(xiàn)出各單因素對(duì)反應(yīng)的影響。由圖2(a)看出隨著引物量不斷增加，Ct值呈遞減趨勢(shì)，0.8 μL時(shí)最低，說(shuō)明隨著引物量的增加，反應(yīng)進(jìn)入指數(shù)反應(yīng)越早，反應(yīng)越快。但同時(shí)也要考慮成本等其他因素，PCR是一個(gè)典型的酶促反應(yīng)，選擇反應(yīng)體系的最適溫度顯然有利于反應(yīng)的進(jìn)行。從圖2(b)看出隨著退火溫度升高，Ct值呈現(xiàn)先增后降趨勢(shì)，59 ℃時(shí)最低，60 ℃時(shí)最高，表明在59 ℃時(shí)更有利于反應(yīng)的進(jìn)行。圖2(c)則隨著退火時(shí)間的增加，Ct值先抑后揚(yáng)，30 s時(shí)Ct值最低，說(shuō)明退火時(shí)間過(guò)短和過(guò)長(zhǎng)都不利反應(yīng)的進(jìn)行。因此，通過(guò)正交試驗(yàn)確定三個(gè)要素的最優(yōu)反應(yīng)條件為A3B1C2，最終確定的最優(yōu)反應(yīng)條件為：總反應(yīng)體系為20 μL，包括Sybr Green qPCR mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，超純水7.4 μL，引物1 μL；采用兩步法預(yù)變性94 ℃持續(xù)5 min，變性94 ℃持續(xù)10 s，退火延伸59 ℃持續(xù)30 s；擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增階段溫度變化速率20 ℃·s-1，每次在退火結(jié)束后收集熒光信號(hào)；溶解階段從40 ℃向85 ℃升溫溶解，升溫速率0.2 ℃·s-1，持續(xù)收集熒光信號(hào)。

表3 正交反應(yīng)結(jié)果分析

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度與特異性分析

2.3.1 菌落的確定

細(xì)菌在Petrifilm測(cè)試片上生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞代謝產(chǎn)物與上層指示劑氯化三苯基四氮唑(TTC)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，將指示劑還原成紅色非溶解性產(chǎn)物三苯甲，從而使細(xì)菌著色，故測(cè)試片上紅色菌落判斷為菌落總數(shù)，測(cè)試片菌落計(jì)數(shù)適宜范圍為25～250 CFU。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在區(qū)間，則以最接近區(qū)間的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。將培養(yǎng)的菌液稀釋10-1～10-7倍，噴涂于菌落測(cè)試膜片上，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，結(jié)果如圖3所示，稀釋10-5倍的菌液在菌落測(cè)試片上形成菌斑遠(yuǎn)超250個(gè)，稀釋10-7倍的菌液在測(cè)試片上幾乎看不到菌落，稀釋10-6倍的菌液在測(cè)試片上形成菌斑平均為22個(gè)，其菌落數(shù)量處理如表4所示，原始菌落濃度為2.2×108CFU·mL-1。

(a)引物量

(b)退火溫度

(c)退火時(shí)間

2.3.2 RTqPCR靈敏性分析

RTqPCR是利用熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)PCR過(guò)程，只要有熒光信號(hào)便可以監(jiān)測(cè)出擴(kuò)增過(guò)程。根據(jù)菌落計(jì)數(shù)，進(jìn)行菌液濃度梯度實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，圖4中1號(hào)樣為陽(yáng)性對(duì)照，2～6號(hào)樣分別為菌液稀釋10-3、10-4、10-5、10-6和10-7倍濃度，7號(hào)樣為陰性對(duì)照。表5列出各組Ct值，隨著稀釋倍數(shù)的增加，Ct值不斷增大，5號(hào)樣本菌液稀釋10-6倍時(shí)Ct值平均為25.3±0.057，6號(hào)樣本菌液稀釋10-7倍時(shí)Ct值平均為30.3±0.027。由于采用熒光染料法，實(shí)時(shí)熒光信號(hào)曲線的Ct值在30個(gè)循環(huán)后可能出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，且菌液稀釋10-7倍時(shí)菌落無(wú)法計(jì)數(shù)，因此RTqPCR檢測(cè)的菌液濃度至少為220 CFU·mL-1。

圖3 不同稀釋倍數(shù)菌液測(cè)試片培養(yǎng)結(jié)果

表4 菌落計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)表

表5 不同稀釋濃度布魯氏菌RTqPCR擴(kuò)增Ct值

圖4 不同稀釋濃度布魯氏菌RTqPCR反應(yīng)

2.3.3 RTqPCR特異性分析

利用RTqPCR溶解曲線來(lái)檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性，理想的特異性PCR反應(yīng)一對(duì)引物只生成一種產(chǎn)物，且溶解曲線峰值只有一個(gè)，圖5(a)陽(yáng)性樣本和布魯氏菌疫苗株S2反應(yīng)迅速，很快進(jìn)入指數(shù)反應(yīng)階段，呈現(xiàn)S形熒光擴(kuò)增曲線，其Ct值分別為9.8和13.6；陰性對(duì)照和大腸桿菌檢測(cè)結(jié)果均為一條平滑直線，均無(wú)熒光值增長(zhǎng)。圖5(b)顯示在65 ℃附近，出現(xiàn)明顯單一峰，沒(méi)有出現(xiàn)雙峰、疊峰、多峰等現(xiàn)象，說(shuō)明RTqPCR反應(yīng)沒(méi)有出現(xiàn)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。表明引物設(shè)計(jì)具有非常強(qiáng)的特異性，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，利用16S rRNA基因片段作為檢測(cè)鑒定布魯氏菌具有相當(dāng)可靠性。

2.4 環(huán)境樣本測(cè)試

通過(guò)采集室外草坪里的積水和土壤樣本，樣本處理后，進(jìn)行RTqPCR檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示，陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)生特異性擴(kuò)增，土壤樣本和水體樣本Ct值在30以內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，表明目標(biāo)檢測(cè)區(qū)域沒(méi)有陽(yáng)性樣本存在。

圖5 RTqPCR特異性檢測(cè)圖

3 結(jié)論

根據(jù)NCBI公布的16S核糖體RNA基因保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)合成特異性引物，通過(guò)PCR反應(yīng)進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，構(gòu)建并鑒定重組質(zhì)粒，優(yōu)化反應(yīng)條件和擴(kuò)增體系。用于檢測(cè)的特異性目的片段16S rDNA是一種常用的布魯氏菌PCR檢測(cè)目標(biāo)，擴(kuò)增片段在布魯氏菌屬DNA中高度保守，可以有效將布魯氏菌與其他細(xì)菌分離，有利于熒光定量PCR檢測(cè)的應(yīng)用。檢測(cè)樣本經(jīng)簡(jiǎn)單處理直接作為PCR檢測(cè)底物，省去了核酸提取步驟，適用于從各種相態(tài)環(huán)境樣本中快速篩選存在布魯氏菌基因組DNA的樣品。得到本方法用于樣品檢測(cè)的檢測(cè)限為220 CFU·mL-1菌濃度，并且體系有助于反應(yīng)快速進(jìn)入指數(shù)反應(yīng)，Ct值出現(xiàn)早，且表現(xiàn)出良好特異性。通過(guò)采集自然水樣和土壤樣本進(jìn)行環(huán)境樣本實(shí)際檢測(cè)，結(jié)果表明該檢測(cè)方法對(duì)布魯氏菌具有特異性，環(huán)境中其他菌株不會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響?？梢?jiàn)，在執(zhí)行生物恐怖襲擊現(xiàn)場(chǎng)偵檢任務(wù)時(shí)，基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的基因檢測(cè)方法能對(duì)布魯氏菌快速、準(zhǔn)確識(shí)別，滿足檢測(cè)需求，為生物恐怖襲擊現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)布魯氏菌提供一種實(shí)用檢測(cè)手段。

圖6 模擬檢測(cè)熒光信號(hào)圖