基于TMT蛋白組學技術探討氯化汞致小鼠肝臟損傷的機制*

曹 鑫， 張雅楠， 毛侃敏， 楊 淼， 郝麗萍

華中科技大學同濟醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系，食品營養(yǎng)與安全湖北省重點實驗室，武漢 430030

汞是一種典型的重金屬食品污染物，2017年《食品安全國家標準-食品中污染物限量》(GB2762-2017)規(guī)定了汞的限量指標[1]。據(jù)美國毒物管理委員會(Agency for Toxic Substance and Disease Registry Agency，ATSDR)報道，汞是僅次于砷和鉛的第3大危險重金屬[2]。汞有3種不同的化學形式，分別是元素汞、有機汞(主要是甲基汞)、無機汞(主要是氯化汞)[3]，汞可通過呼吸道、消化道和皮膚接觸的方式被機體攝入導致毒性反應[4]。

造成環(huán)境污染的汞的來源主要分為自然排放與人為排放2種，自然排放包括火山活動、土壤釋放、自然風化等；人為排放是造成汞污染的主要原因，包括對于汞的使用、物質中含有汞雜質、廢物處理3大類。煤燃燒、廢物焚化、金屬冶煉、氯堿生產(chǎn)等是目前主要的人為排放類別[5]。無機汞是毒性最強的汞的化合物形式之一，在一些國家，暴露于過多無機汞制劑是人體汞中毒的重要原因。無機汞長期以來被用于藥物、殺菌肥皂和護膚霜。有些護膚霜含有高達6%～10%的氯化汞或氯化亞汞，此外無機汞也被用于牙粉、蠕蟲藥和止疼藥中[6]。研究顯示，氯化汞由胃腸道吸收進入人體可造成腎毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性和血液毒性等[7-10]。

肝臟是主要的代謝與解毒器官。研究顯示，肝臟是汞蓄積的主要場所，汞在肝臟中過量蓄積會改變肝臟的結構和功能[11]。二價汞離子可以結合一系列蛋白分子，如酶、谷胱甘肽、微管蛋白、離子通道和轉運蛋白等，這種結合抑制了這些蛋白分子的正常生理功能，誘導機體細胞發(fā)生炎癥、氧化應激和凋亡等損傷反應[12-15]，但具體的毒性機制需要進一步的研究探索。隨著組學技術的發(fā)展，定量蛋白質組學技術在毒理學研究中發(fā)揮了重要作用，而關于汞造成肝毒性的蛋白質組學研究報道較少。對此，本研究基于串聯(lián)質譜標簽(tandem mass tag，TMT)定量蛋白組學技術對氯化汞染毒小鼠的肝臟組織進行分析，篩選差異表達的蛋白質，并通過生物信息學方法分析差異表達蛋白的功能和涉及的分子通路，為氯化汞肝毒性機制研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

氯化汞、氨水、碘乙酰胺(iodoacetamide，IAM)、三乙基碳酸氫銨緩沖液(triethyl ammonium bicarbonate buffer，TEAB)購自Sigma公司；丙酮、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)購自上海國藥集團化學試劑有限公司；Trypsin蛋白酶購自PROMEGA公司；蛋白酶抑制劑、蛋白定量BCA試劑盒、10%蛋白電泳預制膠、三(2-羧乙基)膦[tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP]溶液、乙腈、甲醇、甲酸、TMT 16Plex購自ThermoFisher Scientific公司；丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和過氧化氫酶(catalase，CAT)檢測試劑盒購自南京建成公司。Spectra Max plus384酶標儀購自Molecular Devices公司；EPS-300數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購自上海天能科技有限公司；Vanquish F高效液相色譜儀、Orbitrap Exploris 480串聯(lián)質譜儀購自ThermoFisher Scientific公司；Tanon-3500R全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。

1.2 實驗動物

6周齡雄性C57BL/6小鼠，購自湖北省實驗動物研究中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(鄂)2020-0018；小鼠于SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，室溫(22±2)℃，相對濕度50%左右，12 h∶12 h晝夜交替。本動物實驗方案經(jīng)過華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物倫理委員會審批通過([2020]IACUC號：S2455)。

1.3 肝毒性小鼠模型建立

小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按照體質量隨機分為對照組、低劑量組(1 mg/kg)、中低劑量組(4 mg/kg)、中高劑量組(8 mg/kg)和高劑量組(16 mg/kg)，每組各9只，氯化汞的染毒劑量基于參考文獻[16-17]和預實驗結果。各劑量組給予相應劑量氯化汞溶液灌胃，對照組以等體積純水灌胃，灌胃體積為0.1 mL/10 g體重，連續(xù)灌胃28 d，每日1次。小鼠自由進食、飲水，每隔3 d監(jiān)測體質量變化。染毒28 d后，小鼠稱重并處死，采集血液與肝臟組織，用于后續(xù)檢測。

1.4 血清及肝臟組織生化指標檢測

分離血清，采用賴氏法檢測小鼠血清ALT、AST活性；取適量肝臟用0.9%的生理鹽水按照1∶9的質量體積比制作肝臟勻漿液，2500 r/min離心10 min，取上清液，用比色法、鉬酸銨法分別檢測肝臟GSH-Px活性、CAT活性，檢測步驟均按照相應試劑盒說明書操作。

1.5 肝臟組織病理學檢查

以4%多聚甲醛溶液固定小鼠肝臟，經(jīng)石蠟包埋、切片、染色，在顯微鏡下觀察肝臟組織的病理學、形態(tài)學變化。

1.6 肝臟蛋白提取及定量

肝臟解凍后于振蕩研磨管中加入適量蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑)，研磨儀充分研磨。4℃，16000×g離心30 min，取上清進行BCA定量測定和SDS-PAGE電泳檢測。

1.7 蛋白酶解及TMT標記

分別取對照組及高劑量組小鼠肝臟樣本100 μg，加入TEAB溶液，使TEAB終濃度為100 mmol/L；加入TCEP溶液，使TECP終濃度為100 mmol/L，37℃孵育60 min；加入IAM溶液，使IAM終濃度為40 mmol/L，室溫避光40 min；加入丙酮(丙酮∶樣本=6∶1)，-20℃沉淀4 h；10000×g離心20 min，留取沉淀；用100 μL 100 mmol/L TEAB溶液充分溶解；按照酶∶蛋白=1∶50加入胰蛋白酶，37℃酶解過夜。取200 μL微離心管，加入5 mg乙腈、100 μg樣本與20 μL TMT 16Plex，室溫孵育2 h；加入5 μL 5%羥胺，室溫放置30 min；真空濃縮儀抽干。

1.8 蛋白鑒定和生物信息學分析

使用EASY-nLC 1200色譜儀進行分離，流動相A：2%乙腈和0.1甲酸溶液，流動相B：80%乙腈和0.1%甲酸溶液。分離之后的樣本用Orbitrap Exploris 480串聯(lián)質譜儀檢測，利用UniProt(Universal protein)數(shù)據(jù)庫與Proteome Discoverer 2.4軟件進行蛋白質鑒定。對鑒定的差異蛋白(differentially expressed proteins，DEPs)進行GO富集分析、KEGG通路富集分析。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 氯化汞對小鼠生理指標影響

2.1.1 氯化汞對小鼠體質量影響 氯化汞染毒28 d，建立肝毒性小鼠模型，各組小鼠初始體質量(第1天)無顯著性差異。隨著氯化汞染毒時間延長，中高劑量組和高劑量組分別于第13天和第7天較對照組體質量明顯降低(均P<0.05)。結果見表1。

2.1.2 氯化汞對小鼠肝功能和肝臟氧化應激水平的影響 氯化汞中高劑量組和高劑量組小鼠的血清ALT活性較對照組分別升高了24%和45%，而各組血清AST水平并未出現(xiàn)顯著性差異(圖1A、1B)。與對照組相比，氯化汞中高劑量組和高劑量組小鼠肝臟的GSH-Px活性分別降低14%和19%，CAT活性分別降低25%和27%(圖1C、1D，均P<0.05)。

1：Control；2：HgCl2(1 mg/kg)；3：HgCl2(4 mg/kg)；4：HgCl2(8 mg/kg)；5：HgCl2(16 mg/kg)；A：血清ALT活性；B：血清AST活性；C：肝臟GSH-Px活性；D：肝臟CAT活性；與對照組比較，*P<0.05 **P<0.01圖1 氯化汞對小鼠肝功能和肝臟氧化應激水平影響Fig.1 Effect of mercury chloride on liver function and hepatic oxidative stress levels of each

2.1.3 氯化汞對小鼠肝組織結構影響 小鼠肝臟病理切片的HE染色結果如圖2所示，與對照組相比，氯化汞低劑量組肝臟并無顯著的病理學變化，中低劑量組有輕微的肝細胞腫脹現(xiàn)象，中高劑量組和高劑量組則有明顯的脂肪變性及肝細胞壞死的表現(xiàn)。

圖2 各組小鼠肝臟病理學表現(xiàn)(蘇木精-伊紅染色，×400)Fig.2 Pathological features of mice liver sample in each group(HE staining，×400)

2.2 氯化汞對小鼠肝毒性影響的生物信息學分析

2.2.1 氯化汞染毒小鼠肝臟DEPs篩選 取對照組與氯化汞高劑量組小鼠肝臟進行蛋白組學分析，經(jīng)過搜庫鑒定和波峰分析，獲得同一蛋白在不同樣本中的表達豐度，本研究以表達差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)和P值作為參考標準，以FC<0.83或FC>1.2，P<0.05為DEPs篩選標準。與對照組相比，高劑量組小鼠肝臟共篩選出195個DEPs，其中99個上調蛋白，96個下調蛋白。

2.2.2 DEPs的GO富集分析 將樣本總蛋白質和篩選的DEPs以GO數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析，結果如圖3所示。GO富集分析主要包括生物學過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)，結果顯示DEPs參與的BP有糖代謝的負調控、天冬氨酸家族氨基酸代謝、行為節(jié)律以及細胞產(chǎn)熱等；CC方面，DEPs主要富集于免疫球蛋白復合物；涉及到的MF有激素-激素受體結合、跨膜受體-酪氨酸激酶結合、信息素-細胞膜受體結合等。參與糖代謝負調控的DEPs為主要尿蛋白(major urinary proteins，Mups)家族(Mup2、Mup7、Mup14、Mup17、Mup20、Mup21)、Fam3c(family with sequence similarity 3，member C)蛋白等。

圖3 DEPs GO富集分析結果(前20位)Fig.3 GO enrichment analysis of DEPs(Top 20)

2.2.3 DEPs的KEGG功能注釋和富集分析 DEPs的KEGG功能注釋及富集分析結果見圖4。與對照組相比，氯化汞高劑量組小鼠肝臟的DEPs集中在類固醇激素生成、花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代謝、細胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP450)介導的外源化合物代謝、視黃醇代謝、膽汁分泌、化學致癌作用等信號通路。在本研究中，篩選出多個參與CYP450介導的外源化合物代謝通路的DEPs，包括有CYP2e1、多種谷胱甘肽S轉移酶(glutathione S-transferase，GST)亞型(GSTp1、GSTm1、GSTt3、mGST3)，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶(UDP-glucuronosyltransferase，UGT)各亞型(UGT2A3、UGT1a5、UGT2b37)，磺基轉移酶5a4(sulfotransferase 5a4，SULT5a4)、羰基還原酶1(carbonyl reductase 1，CBR1)。另外參與AA代謝通路的DEPs有CYP450酶(CYP8b1、CYP2e1、CYP2u1、CYP4v2、CYP4a12a、CYP2c67、CYP7b1、CYP4a12b)以及羰基還原酶1(carbonyl reductase 1，CBR1)。

圖4 DEPs KEGG通路富集結果(前20位)Fig.4 KEGG pathway enrichment of DEPs(Top 20))

3 討論

本研究給予雄性小鼠氯化汞灌胃處理，結果顯示氯化汞染毒能夠顯著降低小鼠體重(P<0.05)；中高劑量組(8 mg/kg)與高劑量組(16 mg/kg)染毒明顯增加小鼠血清的ALT活性，而顯著降低小鼠肝臟抗氧化酶GSH-Px與CAT活性(均P<0.05)，且呈劑量依賴性；氯化汞染毒后小鼠肝組織出現(xiàn)肝細胞腫脹、脂肪變性、細胞壞死等現(xiàn)象。本研究結果提示氯化汞染毒可能通過氧化應激途徑導致小鼠的肝臟損傷，與已有研究結果一致[18-20]。

2003年新型、高效的TMT標記技術被引入到蛋白組學領域，其特點是提高了檢測蛋白相對表達水平和蛋白翻譯后修飾的敏感性[21]。本研究通過TMT定量蛋白組學技術對小鼠氯化汞肝毒性進行DEPs的篩選，共鑒定出195種DEPs，其中99個上調蛋白，96個下調蛋白。DEPs的GO功能富集分析顯示，參與糖代謝負調控的DEPs主要為表達水平上調的Mups蛋白，提示氯化汞染毒后可以增加Mups的基因表達，從而導致小鼠肝臟的糖脂異常調控[22]。DEPs在細胞組分上富集在免疫球蛋白復合物，根據(jù)二價汞離子具有結合一系列蛋白質的特點，以及外源化合物在肝臟中經(jīng)過Ⅰ相代謝可形成毒性降低或升高的蛋白復合物，二價汞離子在代謝過程中有可能形成毒性較強的蛋白復合物，從而對肝臟造成損傷[23]。

Wang等[24]對無機汞暴露的清鳉魚進行腦組織蛋白組學分析，結果顯示汞離子暴露可引起抗氧化物GST、過氧化物還原酶-1(peroxiredoxin-1，Prx-1)的表達升高。Lee等[25]用氯化汞染毒SD大鼠，腎臟蛋白組學結果顯示GST多種亞基的表達上調。GST可以催化GSH與氧化物結合，在細胞的氧化應激防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，本研究的肝臟蛋白組學中也檢測到GST蛋白的上調，以及GSH代謝通路的KEGG富集結果。有研究表明，在氫氧化物存在的情況下，GST還可以起到谷胱甘肽還原酶的作用，通過增加還原型谷胱甘肽含量以減少ROS引起的細胞損傷[26]。

對于DEPs的KEGG通路富集分析顯示，氯化汞染毒涉及到肝臟中CYP450介導的代謝通路，這與Biswas等[27]關于斑馬魚經(jīng)硫化汞暴露后的腦組織蛋白組學研究結果一致。CYP450酶是一種膜結合蛋白，在外源化合物代謝、細胞代謝方面具有重要作用，各種外源化合物或內(nèi)源性底物可以通過與膜受體結合誘導或者抑制CYP450酶[28]。Ⅰ相代謝酶將外源化合物轉化為具備極性基團的中間體，由Ⅱ相代謝酶將中間體與內(nèi)源性結合劑(如谷胱甘肽)結合，形成活性降低、極性增加且易被排出的代謝物。CYP450酶在細胞中充當Ⅰ相代謝酶的作用，保護細胞免受外源化合物的損害。然而CYP450介導的生物轉化可能導致外源化合物代謝活化為毒性產(chǎn)物。在多種CYP450酶中，CYP2e1在肝毒素的代謝中具有重要作用，某些肝毒性物質如對乙酰氨基酚、四氯化碳等可通過CYP2e1的激活，在體內(nèi)轉換成具有毒性的中間代謝物[29]。和其他CYP450酶相比，CYP2e1表現(xiàn)出更高的氧化酶活性，是微粒體ROS的重要來源，研究顯示過表達CYP2e1的HepG2細胞ROS產(chǎn)生升高了40%～50%[30]。CYP2e1的誘導因素如二氯甲烷、1-硝基萘、二甲亞砜等能夠抑制CYP2e1的降解，從而使細胞內(nèi)CYP2e1水平較正常偏高[31]。本研究DEPs的KEGG富集分析結果顯示氯化汞的染毒影響到小鼠肝臟的CYP450代謝通路上的多種代謝酶，包含多種Ⅰ相代謝酶CYP450和Ⅱ相代謝酶GST、UGT等，表明氯化汞可通過引起小鼠肝臟CYP450介導的代謝通路上的部分代謝酶的表達量發(fā)生改變，提示氯化汞誘導產(chǎn)生的肝臟毒性可能是由CYP450介導的外源化合物代謝通路紊亂導致。

AA作為一種多不飽和脂肪酸，主要以磷脂的形式在細胞膜上存在，在肝臟的正常生理過程中發(fā)揮重要作用。AA主要通過4種酶代謝：環(huán)氧合酶-1/2(cyclooxygenase-1/2，COX-1/2)、脂氧合酶(lipoxygenases，LOX)、CYP450酶、脂肪酸酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH)。AA在經(jīng)過上述酶代謝后可形成大量具有生物活性的代謝產(chǎn)物，參與細胞的糖脂代謝、氧化應激、炎癥反應、內(nèi)質網(wǎng)應激等病理過程[32-33]。KEGG富集分析顯示AA代謝通路上的DEPs主要是CYP450酶，均為上調蛋白，CYP450酶可以參與AA的非酶氧化過程，將AA轉化為為ω-1和ω-2羥基化代謝物，提示氯化汞染毒可以通過增強AA的CYP450酶代謝途徑，產(chǎn)生活性代謝物從而導致肝臟糖脂代謝紊亂、氧化應激、炎癥反應等毒性反應[30]。

另外KEGG富集分析的結果顯示DEPs富集在視黃醇代謝通路，肝臟非實質細胞主要由肝臟星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)組成，該細胞內(nèi)具有大量含有視黃醇的脂滴，在肝細胞的損傷刺激下，HSCs可被激活，在形態(tài)學和生理功能上發(fā)生改變，在HSCs的激活過程中，視黃醇的釋放降解是特征之一[34-35]。視黃醇可對HSCs的DNA合成產(chǎn)生抑制作用從而抑制肝臟的纖維化改變，即氯化汞染毒可能會通過影響HSCs視黃醇代謝導致肝臟細胞的損傷[36]。

除上述通路外，生物信息學分析結果還顯示氯化汞的毒性作用還與肝臟的類固醇激素生成、膽汁分泌、化學致癌作用等通路相關。本研究采用TMT標記定量蛋白組學技術有效篩選了氯化汞染毒小鼠肝臟中的DEPs，并對其進行了相應的生物信息學分析，有助于了解氯化汞肝毒性的生物學過程和代謝通路，為氯化汞的肝毒性機制研究提供線索，但氯化汞肝毒性涉及的具體通路尚需進一步的研究與驗證。