高寒草甸植物根際溶磷菌的篩選鑒定及其溶磷與促生效果

藺寶珺，楊文權(quán)，趙 帥，柴港寧，魚楊華，武燕茹，韓顯忠，李希來(lái)，寇建村*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.門源縣草原站，青海 門源 810300；4.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

土壤中的磷以有機(jī)和無(wú)機(jī)的形式存在，其作為植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)提高具有重要意義[1-2]。然而磷作為一種沉積性礦物，絕大部分與土壤中陽(yáng)離子等結(jié)合，植物難以吸收利用，所以往往成為植物生長(zhǎng)的主要限制因素[3-5]。施用磷肥是提高土壤有效磷常用的方法，但磷肥施入土壤后常會(huì)被金屬離子固定形成磷酸鈣等難溶性磷酸鹽，降低了磷肥效果。此外，長(zhǎng)期施用磷肥會(huì)造成一系列環(huán)境問(wèn)題如土壤板結(jié)、酸化和水體富營(yíng)養(yǎng)化等[6]。

溶磷菌可以將難溶無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷酸鹽，或是將有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)磷，易于植物和土壤微生物的吸收利用，既能緩解土壤速效磷的缺乏問(wèn)題，又能減少環(huán)境污染，因此，溶磷微生物的開(kāi)發(fā)利用成為研究熱點(diǎn)[7-10]。土壤中溶磷細(xì)菌的種類和磷素來(lái)源不同，其溶磷的機(jī)制不同，此外土壤結(jié)構(gòu)類型、質(zhì)地、土壤有機(jī)質(zhì)和耕作方式對(duì)溶磷菌的數(shù)量和分布也有很大影響[11-12]。目前，關(guān)于溶磷菌在水稻(OryzasativaL.)、小麥(TriticumaestivumL.)、玉米(ZeamaysL.)等農(nóng)作物上的研究較多[13-18]，而高寒草地等特殊生境下的植物根際溶磷菌的研究也引起了不少關(guān)注，且大部分研究集中在篩選、溶磷能力及作用機(jī)理等方面。其中，在川西北高寒草甸植物根際篩選出12株兼具溶磷、固氮和解鉀的多功能菌株[19]；在四川紅原高寒草地篩選出的部分溶磷菌株既分泌吲哚-3-乙酸(IAA)，又能分泌赤霉素(GA3)和玉米素(t-Z)[20]；在西藏阿里的高寒牧草根際篩選出的高效溶磷菌對(duì)植物有較好的促生作用[21]。盡管如此，青藏高原高寒地區(qū)的溶磷菌資源的篩選及其應(yīng)用的研究鮮有報(bào)道，挖掘該地區(qū)的溶磷菌用于菌肥開(kāi)發(fā)和高寒退化草地修復(fù)已成為一項(xiàng)具有重要意義的工作。為此，本研究對(duì)祁連山國(guó)家公園青海片區(qū)的門源縣硫磺溝高寒草甸植物根際土壤中的溶磷細(xì)菌進(jìn)行了分離，并對(duì)分離的4株溶磷菌的溶磷特性、促生效果等進(jìn)行了研究，為青藏高原特殊環(huán)境下的微生物菌肥的開(kāi)發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 土壤來(lái)源

采樣地點(diǎn)位于祁連山公園青海片區(qū)的青海省門源回族自治縣硫磺溝。選擇生長(zhǎng)旺盛的小嵩草(Kobresiamyosuroides(Villars)Foiri)和洽草(Koeleriamacrantha(Ledebour)Schultes)，用鏟子將植物連根挖出，刷掉根際土壤裝于無(wú)菌密封袋中并編號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室于4℃冰箱保存。

1.2 溶磷菌株的分離、篩選

溶磷菌采用稀釋平板涂布法在無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基表面進(jìn)行分離純化[22]。28℃培養(yǎng)3—5 d后，挑選出現(xiàn)透明圈的不同形態(tài)菌落，在無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基上劃線數(shù)次，得到純化的單菌落并編號(hào)。將純化后的溶磷菌株保存于裝有已滅菌的LB液體培養(yǎng)基[21,23]和甘油的保菌管中，置于-80℃冰箱備用。

1.3 菌株溶磷能力的測(cè)定

1.3.1溶磷圈直徑的測(cè)定 采用溶磷圈法對(duì)溶磷菌的溶磷性能進(jìn)行定性測(cè)試[24]，用游標(biāo)卡尺測(cè)量D,d值，并計(jì)算SI值。D表示透明圈直徑，d表示菌落直徑，單位均為mm。公式如下。

SI=D/d

1.3.2溶磷菌磷增量的測(cè)定 挑取待測(cè)菌株單菌落于LB液體培養(yǎng)基，置于搖床培養(yǎng)24 h，調(diào)OD700至1，再按1%的接種量將菌液分別接種到無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，以未接菌培養(yǎng)基作空白對(duì)照(CK)，置于28℃，190 r·min-1搖床震蕩培養(yǎng)7 d后，在4℃，8 000 r·min-1下離心20 min，取上清液用鉬銻抗比色法測(cè)定扣除對(duì)照后各個(gè)菌株有效磷增量[24]，并計(jì)算解磷率[25]。同時(shí)用酸度計(jì)測(cè)定上清液的pH值。

式中，ρ為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得有效磷的濃度(μg·mL-1)，Ts為分取倍數(shù)，V0為測(cè)定培養(yǎng)液的體積(mL)，V為顯色時(shí)定容體積(mL)。

1.4 菌株分泌有機(jī)酸能力的測(cè)定

采用不同分析純有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品(草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸)制備不同梯度有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品混合液。取上述培養(yǎng)液離心后的上清液，參照管國(guó)強(qiáng)等人[26]試驗(yàn)方案進(jìn)行有機(jī)酸測(cè)定。

1.5 菌株16S rRNA序列鑒定

將篩選出來(lái)的菌株純培養(yǎng)后送至北京擎科生物科技有限公司西安分公司進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序[27]，并使用MEGA10軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 盆栽試驗(yàn)

所用營(yíng)養(yǎng)土來(lái)源于品氏托普?qǐng)@藝(上海)有限公司。種植前將營(yíng)養(yǎng)土置于高溫高壓滅菌鍋中滅菌三次作為培養(yǎng)基質(zhì)，披堿草種子用75%酒精和2%(v/v)次氯酸鈉溶液消毒促生，并用無(wú)菌水清洗數(shù)次[27-28]。每盆均勻播種25粒，待披堿草出苗一周后進(jìn)行接菌試驗(yàn)。挑取所接菌株單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，在28℃，190 r·min-1搖床上震蕩培養(yǎng)，調(diào)節(jié)菌液OD700=1時(shí)接菌，每周接菌一次，共接種4次。試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)，分別為添加25 mL未接菌(CK)和接種了MXSC5，MXSC6，MXSC7及MQC13的LB液體培養(yǎng)基。第一次接菌28 d后測(cè)量植株絕對(duì)株高，收獲地上部分測(cè)定鮮重、干重并計(jì)算含水量。參考鮑士旦《農(nóng)化分析第三版》[29]，測(cè)定土壤pH值、有機(jī)質(zhì)、速效磷和速效氮以及植物全氮、全磷、全鉀。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件對(duì)菌株溶磷能力、分泌有機(jī)酸含量及盆栽試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理并處理，SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和最小顯著差異(LSD)檢驗(yàn)，用Origin2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株溶磷能力測(cè)定

從小嵩草和洽草根際土中篩選到具有溶磷效果的菌株4株。源自小嵩草根際土壤的菌株命名為MXSC5，MXSC6和MXSC7，篩選自洽草根際土壤的菌株命名為MQC13。4株溶磷菌均能在固體培養(yǎng)基上良好生長(zhǎng)，并可形成肉眼可見(jiàn)的透明圈，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)均在增大(表1)。菌株MXSC5和MXSC7的SI值在第14 d達(dá)到最大，菌株MXSC6和MQC13的SI值在第16 d時(shí)略有增加。

表1 4株溶磷菌在固體培養(yǎng)條件下的溶磷表現(xiàn)

液體培養(yǎng)條件下，4株菌株在第7 d的溶磷能力測(cè)定結(jié)果顯示，有效磷增量在156.17～511.33 μg·mL-1之間，各處理組間差異顯著(P<0.05)，其中MQC13磷增量最大，MXSC7的磷增量最小，解磷率范圍為3.12%～10.23%；與對(duì)照組相比，接菌培養(yǎng)液pH值都有所降低(表2)。

表2 4株溶磷菌第7 d在液體培養(yǎng)條件下的溶磷能力和培養(yǎng)液的pH值

2.2 菌株分泌有機(jī)酸的種類及濃度

4株菌株在溶磷過(guò)程中均分泌草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸，草酸含量最高?？傆袡C(jī)酸量在522.36～986.69 mg·L-1之間，MQC13培養(yǎng)液的總有機(jī)酸量最高，MXSC7總有機(jī)酸含量最低，且MXSC5的總有機(jī)酸量與MXSC6和MXSC7的差異極顯著(P<0.01)，這與MQC13的表現(xiàn)一致(表3)。由此可見(jiàn)，4株溶磷菌分泌的有機(jī)酸含量差異較大。

表3 4株溶磷菌分泌的有機(jī)酸的含量

2.3 菌株的鑒定

對(duì)篩選出的4株溶磷菌株進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序，提交所得序列至EZbiocloud并進(jìn)行比對(duì)，選取了相似度較高的菌株16S rRNA基因序列與所篩選菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。結(jié)果顯示，MXSC6和MQC13分別鑒定為P.brassicacearumsubsp.Neoaurantiaca和P.atacamensis；4株溶磷菌株均為假單胞菌屬。

圖1 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的4株溶磷菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 盆栽試驗(yàn)

接菌增加了披堿草的株高和地上部干重(圖2，圖3a，3b)。4組接菌處理植株的株高在44.73～47.43 cm之間，較對(duì)照組增加顯著(P<0.05)。5組處理中，披堿草地上部干重在3.05～4.34 g之間，除MXSC6處理外，其余接菌處理較對(duì)照組增加顯著(P<0.05)。

圖2 接菌對(duì)披堿草生長(zhǎng)狀況的影響

5組處理中披堿草地上部全氮、全磷、全鉀含量高低不同(圖3 d，3e，3f)。除MQC13處理外，其余接菌處理全氮含量較對(duì)照組增加顯著(P<0.05)。植株地上部全磷含量為MXSC5處理最高，較對(duì)照組增加顯著(P<0.05)，MXSC7處理則低于其他處理組及對(duì)照。此外4組接菌處理植株地上部全鉀含量較對(duì)照組增加顯著(P<0.05)。

圖3 接菌對(duì)披堿草生長(zhǎng)指標(biāo)及養(yǎng)分含量的影響

接菌處理后土壤養(yǎng)分發(fā)生不同程度的變化，與對(duì)照組相比，接菌處理組的土壤速效氮、速效磷和有機(jī)質(zhì)含量均高于對(duì)照組(圖4)。其中接菌處理的土壤速效氮含量較對(duì)照組增加顯著；除MXSC6處理外，其他接菌處理的土壤速效磷含量增加顯著；而對(duì)于土壤有機(jī)質(zhì)含量，MXSC5處理較對(duì)照組增加顯著(P<0.05)。

圖4 接菌對(duì)土壤pH值及養(yǎng)分含量的影響

3 討論

3.1 高寒草甸溶磷菌的篩選鑒定及溶磷能力分析

土壤中的溶磷菌主要有細(xì)菌、真菌和放線菌，種類、數(shù)量及實(shí)際應(yīng)用最多的是細(xì)菌，包括芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、歐文氏菌屬(Erwiniasp.)等[2,30]。本研究從高寒草甸篩選出4株可以溶解無(wú)機(jī)磷的菌株，經(jīng)16S rRNA基因序列分析，MXSC6和MQC13分別鑒定為P.brassicacearumsubsp.Neoaurantiaca和P.atacamensis，4株溶磷菌株均鑒定為假單胞菌屬。前人針對(duì)不同溶磷菌的溶磷特性與適應(yīng)能力都有較多研究，同時(shí)也有將溶磷菌與其他根際促生菌等結(jié)合以促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分的吸收，為更好地將溶磷菌與實(shí)際生產(chǎn)相結(jié)合提供理論基礎(chǔ)[30-32]。本研究中4株溶磷菌在無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基上隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，溶磷圈直徑也在變化，最后均達(dá)到最大或增長(zhǎng)幅度趨于平緩，這可能與培養(yǎng)基中難溶性磷酸鹽的含量、菌株代謝產(chǎn)物釋放速度等有關(guān)。4株菌株在無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中的磷增量在156.17～511.33 μg·mL-1之間，高于楊婉秋[19]、張英等人[21]在高寒草地植物根際篩選的溶磷菌。其原因可能是，一方面不同植物根際促生菌的種類及其產(chǎn)生的有機(jī)酸、菌體內(nèi)代謝途徑不同，另一方面培養(yǎng)基或土壤養(yǎng)分也會(huì)對(duì)溶磷菌的生長(zhǎng)狀況和代謝途徑產(chǎn)生影響，進(jìn)而表現(xiàn)出不同溶磷效果[19]。

3.2 菌株分泌有機(jī)酸及溶磷能力相關(guān)性研究

溶磷菌分泌的有機(jī)酸可以跟陽(yáng)離子形成螯合物，釋放磷酸根離子，菌種不同，其產(chǎn)酸的種類、含量和溶磷能力也不相同[33-36]。本試驗(yàn)所篩選的4株菌均可分泌草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸7種有機(jī)酸，各菌株均為草酸含量最高，在溶磷過(guò)程中發(fā)揮主要作用。同時(shí)有效磷增量最高的菌株MQC13，其總有機(jī)酸量最高。各菌株在固體培養(yǎng)基上的SI值大小比較為MQC13>MXSC5>MXSC6>MXSC7，這與總有機(jī)酸量的表現(xiàn)一致，而在液體培養(yǎng)條件下的磷增量大小為MQC13>MXSC6>MXSC5>MXSC7。對(duì)總有機(jī)酸量與磷增量之間相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)兩者之間并無(wú)相關(guān)性，這可能是由于金屬離子與不同種類的有機(jī)酸的結(jié)合能力不同，因此單一的總有機(jī)酸量并不能完全代表菌株的溶磷效果；也有可能是因?yàn)榫暝谌芰走^(guò)程中自身吸收利用了一部分磷元素，或是以無(wú)機(jī)磷酸鹽的形式貯藏在溶磷菌株細(xì)胞內(nèi)，使得該菌株的溶磷能力被低估[4,37]。有研究認(rèn)為溶磷菌溶磷量與pH值呈負(fù)相關(guān)[38-39]，然而也有研究指出微生物的溶磷量與pH值之間不存在顯著的相關(guān)性[40]。本試驗(yàn)中接菌處理的培養(yǎng)液的pH值與CK培養(yǎng)液相比有所降低。這與馬文文等人在東祁連山高寒地區(qū)分離的溶磷菌在液體培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液的pH值變化情況相一致[24]。相關(guān)性分析顯示培養(yǎng)液pH值與總有機(jī)酸量相關(guān)性顯著(P<0.05)，與磷增量之間無(wú)顯著相關(guān)性，說(shuō)明本試驗(yàn)中有機(jī)酸降低了培養(yǎng)液pH值，但pH值的降低對(duì)菌株的溶磷能力作用較微弱。

3.3 菌株對(duì)披堿草促生效果研究

諸多研究表明溶磷微生物可以增加土壤養(yǎng)分，提高作物產(chǎn)量[41-42]。本試驗(yàn)盆栽結(jié)果顯示，從高寒草甸根際土中所篩選出的4株溶磷菌株均可顯著提高披堿草的株高和地上部干重(P<0.05)，這與張英在高寒草原分離出的溶磷菌在披堿草盆栽接種試驗(yàn)的結(jié)果一致[21]。此外，菌株培養(yǎng)液提高了土壤速效養(yǎng)分，這與Kurek、Wu等人分別接種溶磷菌于蘋果樹(shù)(MalusdomesticaBorkh.)幼苗和油茶(CamelliaoleiferaAbel)的盆栽試驗(yàn)中，溶磷菌對(duì)土壤速效氮和速效磷有正向影響的結(jié)果相似[43-44]。接種溶磷菌使得植物生長(zhǎng)和土壤養(yǎng)分發(fā)生變化，可能是由于溶磷菌株通過(guò)產(chǎn)生有機(jī)酸和胞外磷酸酶溶解土壤中的不溶性磷酸鹽，緩解土壤中磷素的限制，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[45-46]；另一方面可能與其代謝有關(guān)，溶磷菌通過(guò)分泌多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、維生素，對(duì)解磷以及植物生長(zhǎng)具有雙重促進(jìn)效果[47]。此外，本試驗(yàn)所用營(yíng)養(yǎng)土有機(jī)質(zhì)含量較高，為溶磷菌提供足夠有機(jī)碳源，促進(jìn)其生命活動(dòng)，也進(jìn)一步提高了土壤速效養(yǎng)分[48]。

4 結(jié)論

本研究從青海高寒草甸洽草和小嵩草根際土壤中分離篩選出4株優(yōu)良溶磷菌，均屬于假單胞菌屬；4株優(yōu)良溶磷菌能有效促進(jìn)植物生長(zhǎng)，在高寒地區(qū)植物促生和微生物菌肥開(kāi)發(fā)利用方面具有良好的潛力。