杞月茶對卵巢儲備功能下降大鼠卵巢組織Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

肖慧，劉宇，朱英英，李軍

卵巢儲備功能下降(decreasing ovarian reserve，DOR)是指卵巢內(nèi)存留的可募集的卵泡數(shù)量減少，卵巢產(chǎn)生卵子的能力減弱，卵母細胞質(zhì)量下降，導致生育能力下降。卵巢功能減退臨床表現(xiàn)為月經(jīng)周期紊亂、閉經(jīng)、潮熱、失眠、不孕等癥狀。DOR沒有統(tǒng)一的診斷標準，實驗室檢測中常以基礎FSH水平升高但未達到絕經(jīng)期的水平，AMH水平降低，竇卵泡計數(shù)減少為標準[1]。輔助生殖技術(shù)協(xié)會臨床結(jié)果報告系統(tǒng)(SART CORS)稱[2]，2004—2011年診斷為DOR的人數(shù)從19%增加到26%，而年齡在40歲以下的診斷人數(shù)增加了42%。DOR是一個復雜的臨床現(xiàn)象，其病因不詳，受年齡、遺傳、自身免疫和環(huán)境因素的影響[3]。目前治愈較為困難，已成為婦科內(nèi)分泌相關(guān)領(lǐng)域關(guān)注的難點及熱點問題。

前期動物實驗研究發(fā)現(xiàn)[4]，杞月茶能夠改善DOR模型大鼠的性激素水平，并探索出藥物的適宜濃度，本研究在此基礎上，進一步研究杞月茶改善大鼠卵巢儲備功能的機制，報道如下。

1 材料及方法

1.1 材料 (1)動物及分組：SPF級雌性SD大鼠24只[北京維通利華，動物許可證號: SCXK(京)2016- 0011]，6周齡，體質(zhì)量190～210 g，動物倫理審查批號(21-23)。(2)試藥試劑：1，4-乙烯基-1-環(huán)己烯二環(huán)氧化物(VCD，sigma BCBV1352),戊酸雌二醇片[補佳樂，拜爾醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司],杞月茶(枸杞子15 g，月季花10 g)免煎顆粒(北京康仁堂藥業(yè)有限公司)。血清促卵泡激素(FSH)、雌二醇(E2)、抗苗勒管激素(AMH)酶聯(lián)免疫試劑盒(BLUE GENE公司)、兔抗BCL-2抗體(Proteintech SJ08108)、小鼠BAX抗體(Proteintech SJ08109)。(3)儀器設備: 離心機(上海趙迪生物科技有限公司，型號AXTGL16M)、切片機(德國H93，型號RM2126)、石蠟包埋機(德國Leica EG1160)、顯微鏡(日本ECLIPSE LV100POL公司，型號50IPOL)、全自動酶標儀(美國BioTek公司，型號ELx800)、水浴鍋(江蘇金壇市榮華儀器公司，型號SHA-C)。

1.2 實驗方法 2021年3—5月于北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中心實驗室進行實驗。大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、杞月茶組、補佳樂組，每組 6 只，屏障環(huán)境喂養(yǎng)。除空白組外，其余大鼠進行卵巢儲備功能下降造模[5]：按VCD 160 mg/kg予大鼠腹腔注射，每日1次，連續(xù)給藥5 d。大鼠卵巢儲備功能下降模型造模成功判斷標準：每日做陰道脫落細胞涂片，觀察動情周期。腹腔注射結(jié)束1個動情周期后動情期紊亂者，認為造模成功。造模成功后，杞月茶組予杞月茶24 g/kg劑量灌胃，補佳樂組予補佳樂0.12 mg/kg灌胃，空白組及模型組正常飲食并予生理鹽水3 ml/kg灌胃，各組均每天1次，連續(xù)灌胃4周，每周停止灌胃1 d[4]。模型組1只大鼠在實驗第33天意外死亡。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 大鼠一般情況觀察：記錄大鼠體質(zhì)量、雙側(cè)卵巢體質(zhì)量指數(shù)、子宮體質(zhì)量指數(shù)[6]、飲食活動情況，光鏡下觀察陰道上皮脫落細胞變化情況及動情周期變化。

1.3.2 性激素水平檢測：大鼠最后1次給藥后，禁食12 h，腹腔注射0.4%戊巴比妥 1 ml/100 g，大鼠麻醉后，75%酒精消毒腹部皮膚，打開腹腔，腹主動脈取血 4 ml，離心取血清，以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清FSH、E2、AMH的含量。

1.3.3 卵巢形態(tài)學觀察：選取大鼠右側(cè)卵巢,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋、切片，HE染色，普通光學顯微鏡觀察卵巢組織形態(tài)學變化。

1.3.4 卵巢顆粒細胞(granulosa cell，GC)凋亡因子Bcl-2、Bax免疫組化檢測：各組隨機選取3只大鼠右側(cè)卵巢組織石蠟切片脫蠟，用PBS沖洗3次，3%H2O2室溫孵育10 min，蒸餾水沖洗，滴加Fas、FasL單克隆抗體，37℃孵育1～2 h,PBS沖洗2 min×3次，分別滴加1∶1 000、1∶400稀釋的一抗Bax、Bcl-2，37℃孵育1 h,PBS沖洗2 min×3次，滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃孵育30 min,PBS沖洗2 min×3次，DAB顯色劑顯色，自來水充分沖洗，蘇木精復染、封片。免疫組化染色后，細胞質(zhì)為棕色或深棕色為陽性標記。使用高倍顯微鏡隨機選擇5個視網(wǎng)膜視野用IPP 6.0 軟件定量測量各個指標平均光密度(IOD)。

1.3.5 卵巢顆粒細胞Bcl-2/Bax蛋白印跡檢測：蛋白印跡法檢測卵巢顆粒細胞Bcl-2/Bax表達水平，取出左側(cè)卵巢組織(-80℃冰箱保存)，取50 μg蛋白在冰浴條件下加入細胞裂解液提取總蛋白并測定濃度，待檢測蛋白樣品上樣量為10 μl，打開電泳裝置，濃縮膠恒壓90 V，約120 min；分離膠恒壓120 V，通過預染蛋白marker來確定電泳停止時間。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜條件：300 mA恒流；0.45 μm孔徑PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時間90 min。封閉：將膜完全浸沒于5%BSA-TBST中，水平搖床孵育1 h。 加入稀釋1∶10 000、1∶1 000的Bax及Bcl-2一抗, 4℃水平搖床孵育過夜，Beta actin作為內(nèi)參。次日，TBST洗膜洗3次，每次10 min。加入1∶10 000稀釋的二抗，室溫孵育45 min。洗膜同上。ECL滴加到膜的蛋白面，反應3 min；膠片曝光顯影2 min，定影。利用IPP 6.0軟件定量測量平均光密度。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 大鼠造模后出現(xiàn)躁動表現(xiàn)，陰道上皮脫落細胞處于動情間期,經(jīng)干預后可見明顯動情周期。各組間大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與空白組比較，模型組卵巢體質(zhì)量指數(shù)降低(P<0.05)；與模型組比較，杞月茶組、補佳樂組卵巢體質(zhì)量指數(shù)升高(P<0.05),但杞月茶組與補佳樂組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各組大鼠子宮體質(zhì)量指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

（1）自新中國成立以來，我國已建立了相對完善的城市規(guī)劃體系，各級建設管理機制也相對完善，部門之間分工較為明確與合理，但在村鎮(zhèn)規(guī)劃建設管理上，還存在一系列問題，各項規(guī)劃建設制度也不夠完善。但是在具體實施過程中，由于缺乏資金的保障與支持，因此，經(jīng)常會出現(xiàn)規(guī)劃落后、管理混亂的問題，個別農(nóng)村地區(qū)還未建立專門的建設管理部門，由于村鎮(zhèn)規(guī)劃屬于一項綜合性、系統(tǒng)性的工程，實踐過程中，對于各種硬件設施要求較高，如辦公設施、車輛等等，一旦這些設施準備不齊全，便會為村鎮(zhèn)規(guī)劃建設管理工作帶來諸多不便，個別村鎮(zhèn)容易缺乏完善可行的管理機制，從而直接對工程建設質(zhì)量產(chǎn)生影響，不利于農(nóng)村經(jīng)濟的健康穩(wěn)定發(fā)展。

2.2 各組大鼠血清性激素水平比較 與空白組比較，模型組血清FSH水平升高，AMH水平降低(P<0.05)；

表1 各組大鼠一般情況比較

與模型組比較，杞月茶組及補佳樂組血清FSH水平均降低，AMH水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但杞月茶組與補佳樂組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各組血清E2水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清性激素水平比較

2.3 各組大鼠卵巢形態(tài)學比較 空白組可見較多原始卵泡及初次級卵泡，顆粒細胞多，未見明顯閉鎖卵泡；模型組大鼠卵巢可見少量初次級卵泡及少量原始卵泡，顆粒細胞較少，可見較多閉鎖卵泡；杞月茶組及補佳樂組初次級卵泡及成熟卵泡較多，顆粒細胞及閉鎖卵泡較模型組減少，見圖1。

注：.原始卵泡；.初次級卵泡；.顆粒細胞；.閉鎖卵泡

2.4 大鼠卵巢顆粒細胞中Bcl-2、Bax凋亡因子及其Bcl-2/Bax蛋白表達比較 卵巢顆粒細胞免疫組化中，各組Bax蛋白主要表達在顆粒層細胞、黃體及間質(zhì)。與空白組比較，模型組Bax蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，杞月茶組及補佳樂組Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)，而杞月茶組與補佳樂組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Bcl-2蛋白主要表達在各級卵泡的細胞核中，其表達在各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2、表3。為進一步明確Bcl-2及Bax蛋白在卵巢組織中的表達，同時進行了組織蛋白印跡檢測，與空白組比較，模型組Bcl-2/Bax凋亡因子比值降低(P<0.05)；與模型組比較，杞月茶組及補佳樂組Bcl-2/Bax凋亡因子比值顯著升高(P<0.05)，而杞月茶組與補佳樂組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3、表3。

表3 各組大鼠卵巢組織細胞Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較

3 討 論

在DOR的治療上，西醫(yī)主要采用激素替代療法，但僅具有改善癥狀、促進月經(jīng)來潮的作用，對于改善生育能力方面療效有限。多項研究顯示，中醫(yī)在DOR的治療中發(fā)揮著良好的作用。中醫(yī)認為，該病在病機上多以腎精虧虛、天癸不足為其根本，并可伴有肝郁、脾虛、血瘀等證[7]。

圖3 各組大鼠卵巢組織Bcl-2、Bax蛋白表達電泳圖

郭志強認為,卵巢儲備功能下降的病機是以肝腎陰虛為主，兼見脾腎陽虛、肝郁化火、心腎不交等[8]。其發(fā)生與現(xiàn)代女性的一些不良生活習慣有關(guān)。王云歡[9]通過對臨床病例數(shù)據(jù)挖掘，分析出女性卵巢功能低下與性生活、情緒、鍛煉及睡眠有密切關(guān)系，郭氏中藥序貫療法可有效改善患者月經(jīng)、妊娠率、改良中醫(yī)癥狀評分、卵巢直徑等，臨床療效滿意，并基于此提出滋補肝腎、養(yǎng)血柔肝的治療方法。實驗采用郭志強臨床常用滋腎養(yǎng)肝法的君臣藥——“枸杞子”和“月季花”制備代茶飲“杞月茶”，具有補腎填精養(yǎng)血、柔肝疏肝、理氣活血的作用，可從根本上調(diào)理肝腎，刺激卵巢發(fā)育和卵泡生長，在緩解癥狀的同時提高一定的生育能力[4]。

顆粒細胞(GC)的增殖、凋亡及激素分泌與卵泡的發(fā)育、卵母細胞的成熟密切相關(guān)。已有研究表明，Bcl-2家族成員在調(diào)節(jié)卵巢細胞凋亡、決定卵巢顆粒細胞和卵泡壽命等方面發(fā)揮重要作用[10-12]。其中，Bcl-2是一種抑制細胞凋亡、延長細胞存活的細胞內(nèi)蛋白，而Bax是Bcl-2同源基因，過度表達的Bax可促進細胞凋亡[13-15]。

圖2 各組大鼠卵巢組織Bcl-2、Bax蛋白表達情況比較(免疫組化染色,×400)

卵巢顆粒細胞在卵泡生長中起到重要作用，相關(guān)激素均由卵巢顆粒細胞卵泡分泌，或在其上表達[16-18]。卵泡的生長主要是由FSH調(diào)節(jié)的，F(xiàn)SH由垂體分泌，負責卵巢卵泡的刺激和生長，而卵泡刺激激素受體(FSHR)主要在卵泡顆粒細胞上表達。E2由卵泡中的卵泡膜細胞和卵巢顆粒細胞產(chǎn)生，E2水平升高對下丘腦—垂體—卵巢軸FSH分泌呈負反饋調(diào)節(jié)。AMH可由原發(fā)性和繼發(fā)性卵泡的顆粒細胞分泌，并抑制原始卵泡生長的發(fā)育，調(diào)控卵泡的發(fā)育速度。FSH和E2是主要的抗凋亡因子[19]。因此在VCD造模法誘導的DOR大鼠模型存在卵泡閉鎖，AMH水平降低，F(xiàn)SH水平升高現(xiàn)象，干預后可改善DOR大鼠內(nèi)分泌紊亂，改善卵巢狀態(tài)，且補佳樂及杞月茶治療效果相當。

Bcl-2家族已被證明在調(diào)節(jié)卵巢生殖細胞的命運中起著至關(guān)重要的作用。Bax是Bcl-2同源基因，二者互為拮抗作用，Bax蛋白表達水平上調(diào)，Bcl-2活性下降會促進細胞凋亡。Bax對原始生殖細胞、卵原細胞和卵母細胞凋亡有著重要作用[13]。Bax可從原始卵泡開始出現(xiàn)，而Bcl-2僅出現(xiàn)在原始卵泡向次級卵泡轉(zhuǎn)化過程中，進而導致原始卵泡閉鎖[19]。Bcl-2可通過抑制胚胎生殖細胞或生長卵泡的凋亡來增加原始卵泡數(shù)量，以潛在地延長卵巢功能和生育能力。其編碼的蛋白主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)，受到凋亡信號誘導后，其結(jié)構(gòu)可發(fā)生改變，轉(zhuǎn)移至線粒體膜上并形成通道，從而誘導細胞凋亡[20]。

多項研究中卵巢中Bax蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，導致GC凋亡增加，導致大量閉鎖卵泡[16]，與本結(jié)果部分相似。一項研究表明，細胞質(zhì)Bcl-2陽性可阻止細胞凋亡，而細胞核Bcl-2陽性可抑制轉(zhuǎn)錄因子和核因子κB的活化，從而誘導細胞凋亡[21]。本結(jié)果中Bcl-2主要表達在細胞核中，其可能是導致細胞凋亡的另一因素。

綜上，杞月茶及補佳樂可降低DOR大鼠血清中FSH水平、升高AMH水平，兩者治療效果與下調(diào)細胞凋亡因子Bax在卵巢組織中的表達有關(guān)。杞月茶與補佳樂治療效果之間差別不大，但杞月茶代茶飲更為便捷，更適合大眾保健的需求，可從中醫(yī)治未病角度出發(fā)，防止DOR的進一步進展。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

肖慧:實施研究過程,數(shù)據(jù)收集、分析,論文撰寫;劉宇:協(xié)助實驗實施、數(shù)據(jù)收集;朱英英:協(xié)助數(shù)據(jù)分析;李軍:提出研究思路和研究選題,設計研究方案、研究流程,設計論文框架,論文修訂及審核