關(guān)于限制酶的考點(diǎn)例析

山東 孔德星 孫 茜

在近幾年的山東省高考試題中，“基因工程”一直是必考題目之一，試題中與限制酶相關(guān)的題目靈活多樣，難度較大。因此，筆者結(jié)合一些典型例題，對(duì)限制酶的考點(diǎn)進(jìn)行了歸納整理，希望能夠提高學(xué)生的理解能力和解題能力，為高三學(xué)生的備考提供幫助。

一、限制酶的作用

在基因工程中，切割DNA分子的工具是限制酶，這類酶能夠識(shí)別并切割雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列。DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端，通常有兩種形式：黏性末端和平末端。切割并不是目的，目的是連接。因此，解題時(shí)要注意限制酶識(shí)別序列的特點(diǎn)。

【例1】關(guān)于如圖1所示黏性末端的說(shuō)法，錯(cuò)誤的是

( )

圖1

A.甲、乙、丙黏性末端是由不同限制酶作用產(chǎn)生的

B.甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重組DNA分子，但甲、丙不能

C.DNA連接酶的作用位點(diǎn)是b處

D.切割產(chǎn)生甲的限制酶不能識(shí)別由甲、乙黏性末端形成的重組DNA片段

【答案】C

【解析】限制酶能識(shí)別并切割特定的核苷酸序列。據(jù)圖1并補(bǔ)充完整限制酶識(shí)別序列后可知，甲、乙、丙是由不同的限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端，A正確。根據(jù)黏性末端的堿基序列可知，甲、乙單鏈部分堿基互補(bǔ)可形成重組DNA分子，甲、丙不能形成重組DNA分子，B正確。b是氫鍵，DNA連接酶的作用部位是磷酸二酯鍵，不是氫鍵，C錯(cuò)誤。產(chǎn)生甲黏性末端的限制酶識(shí)別的序列是5′-GAATTC-3′。甲、乙黏性末端形成的重組DNA分子的序列是5′-CAATTC-3′，由于限制酶具有特異性，因此切割產(chǎn)生甲的限制酶不能識(shí)別由甲、乙黏性末端形成的重組DNA片段，D正確。

【補(bǔ)充說(shuō)明】切割不同的DNA片段但產(chǎn)生相同的黏性末端的一類限制酶稱為同尾酶。兩個(gè)同尾酶切割的DNA片段連接后，一般情況下，不能再被原來(lái)的限制酶識(shí)別。

二、限制酶選擇的“三不一定位”原則

1.不破壞

基因表達(dá)載體中包含啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)、目的基因和標(biāo)記基因等組件。啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的位點(diǎn)，可以驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄；終止子用于終止轉(zhuǎn)錄；復(fù)制原點(diǎn)是DNA復(fù)制的特定起始位點(diǎn)；標(biāo)記基因便于重組DNA的篩選。以上組件在目的基因的復(fù)制和表達(dá)中均具有重要的作用，均不能被破壞，因此酶切位點(diǎn)位于組件內(nèi)部的限制酶都不能使用。當(dāng)然基因表達(dá)載體中往往有多個(gè)標(biāo)記基因，并非都不能破壞，要至少保留一個(gè)，以用于重組DNA的鑒定和篩選。

2.不自身環(huán)化

如果使用一種限制酶切割目的基因和載體，往往會(huì)出現(xiàn)自身黏性末端互補(bǔ)連接的情況，為了避免出現(xiàn)自身環(huán)化的現(xiàn)象，一般選擇兩種限制酶分別切割目的基因的上下游，產(chǎn)生不同的黏性末端。同時(shí)使用這兩種限制酶切割載體，以便目的基因和載體相連。

3.不反向連接

DNA的兩條鏈分別是模板鏈和非模板鏈，其中的脫氧核苷酸的排列順序不同，因此不能顛倒。目的基因和載體連接以后只有正確的連接順序才能保證目的基因的復(fù)制與表達(dá)。例如使用一種限制酶切割目的基因和載體，目的基因兩側(cè)就會(huì)形成相同的黏性末端，所以目的基因和載體就會(huì)有正向和反向連接的兩種情況。

【例2】圖2甲、乙中的箭頭表示三種限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述錯(cuò)誤的是

( )

圖2

A.在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，可用PstⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒和外源DNA

B.在酶切過(guò)程中，不能破壞質(zhì)粒中全部的標(biāo)記基因

C.若只用PstⅠ處理質(zhì)粒和外源DNA分子片段，無(wú)法避免自身環(huán)化和反向連接

D.導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)

【答案】D

【解析】在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，需要選擇相同的限制酶切割外源基因和質(zhì)粒，分析圖2甲和乙，質(zhì)粒和外源基因中相同且不會(huì)破壞目的基因的限制酶是PstⅠ和HindⅢ，并且質(zhì)粒上能夠保留一個(gè)完整的標(biāo)記基因，A正確；在酶切過(guò)程中，不能破壞質(zhì)粒中全部的標(biāo)記基因，要保證切割后的質(zhì)粒至少保留一個(gè)標(biāo)記基因，以便進(jìn)行篩選，B正確；若只用一種限制酶處理質(zhì)粒和外源DNA分子片段，因?yàn)楫a(chǎn)生的黏性末端相同，故無(wú)法避免自身環(huán)化和反向連接，C正確；本題只能使用PstⅠ和HindⅢ切割，用PstⅠ切割后，氨芐青霉素抗性基因被破壞了，因此導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌不可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，D錯(cuò)誤。

4.“一定位”

基因工程中，所選用的限制酶酶切位點(diǎn)應(yīng)位于啟動(dòng)子和終止子之間；若是質(zhì)粒上存在T-DNA，酶切位點(diǎn)應(yīng)位于T-DNA中，從而有利于目的基因嵌入其中，隨質(zhì)粒或T-DNA復(fù)制和表達(dá)。因此，還可以根據(jù)特殊的酶切位點(diǎn)選擇限制酶。

【例3】(2021年，山東卷，第25題節(jié)選)人類γ基因啟動(dòng)子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后，γ基因的表達(dá)被抑制。通過(guò)改變?cè)摻Y(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對(duì)γ基因表達(dá)的抑制，可對(duì)某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療?？蒲腥藛T擴(kuò)增了γ基因上游不同長(zhǎng)度的片段，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測(cè)，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信息如圖3所示。

圖3

(1)為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，需在引物末端添加限制酶識(shí)別序列。據(jù)圖3可知，在F1～F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是________，在R末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是________。本實(shí)驗(yàn)中，從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過(guò)程共需要________種酶。

【答案】(1)SalⅠEcoRⅠ 6

【解析】對(duì)于基因工程的題，一般要分析基因的位置，基因的上下游(因?yàn)樯舷掠我砑右?，還有基因的方向以及限制酶的識(shí)別序列。根據(jù)題干分析，從箭頭的方向以及終止子所在的位置可知，γ基因和熒光蛋白基因方向是相反的。限制酶MunⅠ與EcoRⅠ是同尾酶；限制酶XhoⅠ與SalⅠ是同尾酶，識(shí)別并切割后的黏性末端相同。要將調(diào)控序列和啟動(dòng)子插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，一定要將引物添加在F1的上游(左側(cè))和R的上游(右側(cè))。

在熒光蛋白基因上游進(jìn)行切割有兩種限制酶的組合：限制酶MunⅠ與EcoRⅠ和限制酶MunⅠ與XhoⅠ，但由于限制酶MunⅠ與EcoRⅠ是同尾酶，會(huì)發(fā)生自身連接，因此不能使用。所以，切割熒光蛋白基因上游只能使用限制酶MunⅠ與XhoⅠ。根據(jù)限制酶選擇的“三不一定位”原則，不能直接使用限制酶MunⅠ與XhoⅠ切割引物，因此只能使用同尾酶，分別是限制酶EcoRⅠ和SalⅠ。限制酶EcoRⅠ識(shí)別的位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的是R的上游(右側(cè))位置；限制酶SalⅠ識(shí)別的位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的是F1的上游(左側(cè))。綜上所述，對(duì)載體使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物用限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ識(shí)別序列，然后在DNA連接酶的催化作用下，連接形成重組載體；產(chǎn)物擴(kuò)增中需要使用Taq酶。因此，從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過(guò)程共需要6種酶，分別是Taq酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA連接酶。

三、根據(jù)切割后電泳片段，推導(dǎo)酶切位點(diǎn)

1.電泳

DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳。PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。

2.推斷方法

(1)DNA分子為鏈狀。若限制酶切割后電泳出現(xiàn)兩條電泳條帶，則說(shuō)明該DNA分子中含有一個(gè)限制酶的酶切位點(diǎn)；同理若限制酶切割后電泳出現(xiàn)三條電泳條帶，則說(shuō)明該DNA分子中含有兩個(gè)限制酶的酶切位點(diǎn)，以此類推。

(2)DNA分子為環(huán)狀。若限制酶切割后電泳出現(xiàn)一條電泳條帶，則說(shuō)明該DNA分子中含有一個(gè)限制酶的酶切位點(diǎn)；若限制酶切割后電泳出現(xiàn)兩條電泳條帶，則說(shuō)明該DNA分子中含有兩個(gè)限制酶的酶切位點(diǎn)，以此類推。

【例4】(2022·山東菏澤)在生物DNA的測(cè)序工作中，需要將某些限制性內(nèi)切核酸酶的限制位點(diǎn)在DNA上定位，使其成為DNA分子中的物理參照點(diǎn)，這項(xiàng)工作叫作“限制酶圖譜的構(gòu)建”。假設(shè)有以下一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)：分別用限制酶HindⅢ、BamHⅠ以及兩者的混合物降解一個(gè)4 kb(1 kb=1 000堿基對(duì))大小的線性DNA分子，并將降解產(chǎn)物分別進(jìn)行凝膠電泳。在電場(chǎng)的作用下，降解產(chǎn)物分開，如圖4所示。據(jù)此分析，這兩種限制性核酸內(nèi)切酶在該DNA分子上的限制位點(diǎn)數(shù)目是

( )

圖4

A.HindⅢ1個(gè)，BamHⅠ2個(gè)

B.HindⅢ2個(gè)，BamHⅠ3個(gè)

C.HindⅢ2個(gè)，BamHⅠ1個(gè)

D.HindⅢ2個(gè)，BamHⅠ2個(gè)

【答案】A

【解析】據(jù)圖4分析，限制酶HindⅢ將DNA切割為2段(2.8 kb和1.2 kb)，故限制酶HindⅢ有一個(gè)切點(diǎn)，BamHⅠ將DNA切割為3段(1.8 kb、1.3 kb、0.9 kb)，表明BamHⅠ有2個(gè)切點(diǎn)，分別在離該DNA一端0.9 kb處和2.2 kb處，同時(shí)用兩種酶切割，則限制酶HindⅢ將該DNA切割為2段(2.8 kb和1.2 kb)，BamHⅠ再將2.8 kb這段DNA切割為2段(1.8 kb和1.0 kb)，將1.2 kb切割為2段(0.9 kb和0.3 kb)。因此選A。

3.推斷酶切片段的長(zhǎng)度

對(duì)限制酶切割結(jié)果的考查，除了考查酶切位點(diǎn)的數(shù)量以外，還會(huì)判斷酶切片段的長(zhǎng)度。這一類題往往通過(guò)畫圖來(lái)幫助學(xué)生分析得出正確的結(jié)論。

【例5】用限制酶EcoRⅤ單獨(dú)切割某普通質(zhì)粒，可產(chǎn)生14 kb(1 kb即1 000個(gè)堿基對(duì))的長(zhǎng)鏈，而同時(shí)用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ聯(lián)合切割該質(zhì)粒，可得到三種長(zhǎng)度的DNA片段，如圖5(其中*表示EcoRⅤ限制酶切割后的一個(gè)黏性末端)。

圖5

若用MboⅠ限制酶單獨(dú)切割該普通質(zhì)粒，則產(chǎn)生的DNA片段的長(zhǎng)度為

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A.2.5和5.5 B.2.5和6

C.5.5和8 D.6和8

【答案】D

【解析】用限制酶EcoRⅤ單獨(dú)切割某普通質(zhì)粒，可產(chǎn)生14 kb(1 kb即1 000個(gè)堿基對(duì))的長(zhǎng)鏈，說(shuō)明質(zhì)粒中含有1個(gè)EcoRⅤ切點(diǎn)；同時(shí)用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ聯(lián)合切割該質(zhì)粒，通過(guò)畫圖分析，可得到三種長(zhǎng)度的DNA片段，說(shuō)明質(zhì)粒中含有2個(gè)MboⅠ切點(diǎn)。若用MboⅠ限制酶單獨(dú)切割該普通質(zhì)粒，則產(chǎn)生的DNA片段為2種，總長(zhǎng)度為14 kb，因此選D。酶切位點(diǎn)分布可能如圖6。

圖6