骨巨細(xì)胞瘤發(fā)病現(xiàn)狀及驅(qū)動(dòng)RANKL/OPG失衡機(jī)制的研究進(jìn)展*

曹 理， 吳 蔚， 景豆豆， 郭昊宇， 浦飛飛， 邵增務(wù)

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科，武漢 430022

1 骨巨細(xì)胞瘤的發(fā)病現(xiàn)狀

1.1 流行病學(xué)特點(diǎn)

世界范圍內(nèi)原發(fā)的骨巨細(xì)胞瘤(giant cell tumor of bone，GCTB)占所有骨腫瘤的4%～5%，但我國(guó)骨腫瘤患者中這一比例明顯偏高，可達(dá)13%～20%，發(fā)病高峰出現(xiàn)在30歲前后，男女比例為1.4∶1，20歲至40歲的患病人群占總患病人群的70%以上[1-4]。一般而言，90%的GCTB好發(fā)于四肢長(zhǎng)骨干骺端，如股骨遠(yuǎn)端(32%～37%)、脛骨近端(25%～28%)、橈骨遠(yuǎn)端(10%～11%)、股骨近端(7%～8%)和腓骨近端(5%～8%)等部位，隨疾病進(jìn)展常侵犯骨骺部[5-6]。10%的GCTB則見(jiàn)于短骨、扁骨或某些不規(guī)則骨，如骶骨(5%～9%)、胸腰椎骨(2%～3%)和手足(1%～2%)等部位[7-8]。少部分GCTB可繼發(fā)于Paget骨病(Paget’s disease of bone，PDB)，發(fā)生率約1%，簡(jiǎn)稱PDB/GCT[9]。其在意大利和英國(guó)的白人中報(bào)道較多，惡性程度較高，發(fā)病高峰在40歲以后，男性繼發(fā)率高于女性，5年生存率低于50%，好發(fā)于骨盆、脊柱和頜面部不規(guī)則骨，具有家族聚集效應(yīng)[10-11]。若PDB/GCT患者出現(xiàn)多發(fā)性骨巨細(xì)胞瘤病灶，則以中軸骨上的病灶數(shù)量居多[10]。

1.2 臨床轉(zhuǎn)歸特點(diǎn)

GCTB作為交界性腫瘤，死亡率低，總體惡性率為5%～10%[12]，但存在發(fā)病隱匿、局部復(fù)發(fā)、惡性轉(zhuǎn)化和肺轉(zhuǎn)移等不良后果，給患者帶來(lái)不必要的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

GCTB發(fā)病速度快且臨床癥狀隱匿，常表現(xiàn)為局部疼痛和偶發(fā)的關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，易被忽視，5%～30%的患者患病后可無(wú)任何癥狀，常因在外傷或骨骼肌牽拉后出現(xiàn)病理性骨折而就診[13-15]。少部分GCTB原發(fā)于脊柱、骶骨等部位，由于局部壓迫或壓縮性骨折，可出現(xiàn)下腰痛、下肢放射痛、大小便功能障礙或性功能障礙等神經(jīng)壓迫癥狀[15]。而PDB/GCT患者發(fā)病則以頭面部、脊柱和骨盆為主[16-17]。出現(xiàn)在頭面部蝶骨或顳骨的病灶往往更具侵襲性，可致毗鄰的神經(jīng)受壓而出現(xiàn)頭痛、吞咽困難、外展神經(jīng)麻痹和復(fù)視等癥狀[18]。

GCTB局部復(fù)發(fā)率高，常采用的病灶刮除手術(shù)治療后2年的復(fù)發(fā)率可達(dá)25%～65%[19-20]。一些小樣本研究報(bào)道在手術(shù)中輔以液氮的冷凍消融、高速磨鉆、雙氧水、苯酚或氯化鋅浸漬等方法，中位復(fù)發(fā)率最低能降至11%[21]。地諾單抗和雙磷酸鹽類藥物可作為手術(shù)前后的輔助治療預(yù)防復(fù)發(fā)，但目前最佳用藥方案尚缺乏高質(zhì)量的臨床研究數(shù)據(jù)支持[20，22]。GCTB刮除手術(shù)雖然可通過(guò)在骨皮質(zhì)開(kāi)窗刮除病灶清除大量腫瘤細(xì)胞，但也會(huì)造成髓腔內(nèi)微血管破裂和周圍軟組織破壞，從而導(dǎo)致醫(yī)源性腫瘤播散，在邊界處形成新的腫瘤微小病灶，使GCTB在復(fù)發(fā)時(shí)病灶增殖侵襲速度更快，可能需要二次擴(kuò)大刮除或骨骼切除重建手術(shù)，給患者帶來(lái)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和機(jī)體功能障礙[23]。

GCTB存在惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)且預(yù)后差。1.6%的GCTB為原發(fā)惡性，而3%～8%的GCTB在放療、手術(shù)、靶向治療等情況下繼發(fā)惡性轉(zhuǎn)化[4]。惡性轉(zhuǎn)化的GCTB組織中可觀察到低分化的多形性單核細(xì)胞結(jié)節(jié)，具有高級(jí)別肉瘤表現(xiàn)[24-26]?；蛟诘湫偷腉CTB細(xì)胞背景中，出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化的骨肉瘤、低分化多形性肉瘤或纖維肉瘤病灶[27-28]。Mayo診所的數(shù)據(jù)表明接受過(guò)放射治療的GCTB患者中，76%的人群隨訪10年后出現(xiàn)了繼發(fā)性的骨巨細(xì)胞瘤惡性轉(zhuǎn)化，其中67%～80%惡性轉(zhuǎn)化的GCTB曾接受過(guò)放射治療，且發(fā)病年齡偏高[29-30]。GCTB出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化的人群中，68歲以上、39～68歲和39歲以下人群的5年生存率分別為1%、33%和70%[24]。惡性轉(zhuǎn)化機(jī)制可能與單核梭形基質(zhì)細(xì)胞RUNX2轉(zhuǎn)錄因子(runt related transcription factor 2)高表達(dá)、mTOR/PI3K/AKT(mechanistic target of rapamycin kinase/phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B)通路活化和分泌過(guò)量的趨化因子CCL20(C-C motif chemokine ligand 20，CCL20)等因素有關(guān)[31-33]。

GCTB存在肺轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，原發(fā)性和復(fù)發(fā)性GCTB轉(zhuǎn)移率分別為3.2%和9.8%[34]。GCTB肺轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與GCTB細(xì)胞通過(guò)局部侵襲血管或在病理性骨折的影響下形成腫瘤內(nèi)血栓，進(jìn)而血性轉(zhuǎn)移至肺部有關(guān)[15，35]。但GCTB的肺轉(zhuǎn)移灶生長(zhǎng)緩慢，轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)小于5 mm的患者中5年無(wú)進(jìn)展生存率達(dá)到60%，而大于5 mm者中則為25%[36]。Rizzoli研究中心回顧649例GCTB患者，提示出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移的平均時(shí)間為35.2個(gè)月[37]。Ebeid等[34]回顧15名肺轉(zhuǎn)移的GCTB患者，有1例死于多發(fā)肺轉(zhuǎn)移的并發(fā)癥。Jidveian等[38]認(rèn)為GCTB復(fù)發(fā)和肺轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)將給患者帶來(lái)心理壓力，可能導(dǎo)致焦慮或抑郁情緒。

1.3 發(fā)病機(jī)制

多核巨細(xì)胞過(guò)度激活是GCTB骨質(zhì)破壞的直接原因。光鏡下可觀察到GCTB大量的反應(yīng)性多核巨細(xì)胞，夾雜著少量單核巨噬細(xì)胞和單核梭形基質(zhì)細(xì)胞[39]。其中多核巨細(xì)胞核數(shù)目通常達(dá)40～50個(gè)，胞內(nèi)富含嗜酸性的細(xì)胞質(zhì)和液泡[40]。這些多核巨細(xì)胞占據(jù)骨巨細(xì)胞瘤瘤體50%以上體積，通過(guò)抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2，MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)和組織蛋白酶(cathepsin K，CTSK)途徑介導(dǎo)GCTB溶骨性骨質(zhì)破壞、假囊性變和腫瘤中心變性壞死[35，41]。

單核梭形基質(zhì)細(xì)胞惡性增殖是GCTB持續(xù)進(jìn)展的根本原因。首先，瘤體中的單核梭形基質(zhì)細(xì)胞作為成骨細(xì)胞的前體本身增殖潛能強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)的基因突變和染色體端粒不穩(wěn)改變了表觀遺傳調(diào)控穩(wěn)態(tài)，最終帶來(lái)基質(zhì)細(xì)胞增殖堆積、成骨分化障礙和骨代謝細(xì)胞因子RANKL/OPG平衡失調(diào)，誘發(fā)GCTB惡性轉(zhuǎn)化[42-44]。其次，研究發(fā)現(xiàn)異種移植模型中的單核梭形基質(zhì)細(xì)胞，可在體外獨(dú)立培養(yǎng)增殖，表達(dá)增殖標(biāo)記鼠雙微體2同源體MDM2(mouse double minute 2 homolog)和Ki67(marker of proliferation Ki-67)，并在動(dòng)物模型內(nèi)獨(dú)立生長(zhǎng)成瘤，通過(guò)旁分泌CCL20誘導(dǎo)骨髓單核細(xì)胞發(fā)展為多核巨細(xì)胞[31，45-46]。最后，單核梭形基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)分泌SDF-1趨化因子(stromal cell-derived factor 1)和SRGN糖蛋白(serglycin)，以血管內(nèi)皮遷移的方式募集血液中單核細(xì)胞至GCTB病灶并誘導(dǎo)其分化為多核巨細(xì)胞[47-48]。所以，單核梭形基質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是GCTB的“罪魁禍?zhǔn)住?，其惡性增殖與GCTB的侵襲、惡性轉(zhuǎn)化和復(fù)發(fā)緊密相關(guān)[49]。類似的，繼發(fā)的PDB/GCT同樣存在ZNF687基因始祖突變所帶來(lái)的轉(zhuǎn)錄穩(wěn)態(tài)失調(diào)，單核梭形基質(zhì)細(xì)胞惡性增殖的影響被放大，出現(xiàn)更為嚴(yán)重的骨小梁結(jié)構(gòu)異常、骨質(zhì)破壞和紊亂的反應(yīng)性成骨。同時(shí)有研究報(bào)道85%的PDB/GCT病灶組織內(nèi)可觀察到病毒樣包涵體，提示病毒可能參與到PDB/GCT的進(jìn)展[10，50-52]。

RANKL/OPG平衡失調(diào)是GCTB病變的核心環(huán)節(jié)。生理?xiàng)l件下，骨骼微環(huán)境中來(lái)自成骨細(xì)胞系的單核梭形基質(zhì)細(xì)胞在細(xì)胞膜表達(dá)適量的RANKL，與骨髓造血系的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜上的RANK(receptor activator of nuclear factor kappa B)相互作用，通過(guò)胞內(nèi)PI3K/Akt途徑、IKKs/NF-κB(I-kappa B kinases/nuclear factor kappa B)途徑和JNK/MAPK/c-Jun(c-Jun N-terminal kinase/mitogen-activated protein kinase/cellular Jun)途徑促進(jìn)破骨細(xì)胞存活并融合形成多核巨細(xì)胞發(fā)揮溶骨功能，而成骨細(xì)胞及其前體分泌的誘餌受體OPG通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL阻斷這一效應(yīng)，從而避免過(guò)度的骨質(zhì)溶解[53-54]。GCTB條件下，異常的驅(qū)動(dòng)因素導(dǎo)致骨骼微環(huán)境RANKL/OPG原有平衡被打破。單核梭形基質(zhì)細(xì)胞不僅高表達(dá)RANKL促進(jìn)多核巨細(xì)胞侵襲性溶骨，而且通過(guò)RANKL-RANK系統(tǒng)大量分泌白介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-11、IL-17、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(parathyroid hormone-releasing protein，PTHrP)和前列腺素E(prostaglandin E)，擾亂成骨細(xì)胞分泌降低了的OPG水平，進(jìn)一步加劇RANKL/OPG比例升高[53，55-56]。GCTB病灶內(nèi)破骨細(xì)胞和多核巨細(xì)胞數(shù)量逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)，通過(guò)侵襲溶骨“擠壓”成骨細(xì)胞生存空間，最終增加骨破壞和惡性轉(zhuǎn)化，加速GCTB進(jìn)展[53，55，57-58]。針對(duì)RANKL開(kāi)發(fā)的單克隆抗體如地諾單抗，在臨床展現(xiàn)出良好療效，已成為GCTB輔助治療的一線藥物[20]。然而，既往研究關(guān)注點(diǎn)集中于RANKL/RANK/OPG下游效應(yīng)，近年來(lái)RANKL/OPG平衡失調(diào)的異常驅(qū)動(dòng)因素逐漸被報(bào)道，明確驅(qū)動(dòng)因素及其互作分子將有助于深入理解GCTB發(fā)病機(jī)制，為藥物研制提供新的靶點(diǎn)。

2 骨巨細(xì)胞瘤RANKL/OPG平衡失調(diào)驅(qū)動(dòng)因素分析

2.1 H3F3A基因突變經(jīng)由表觀遺傳學(xué)調(diào)控驅(qū)動(dòng)RANKL/OPG平衡失調(diào)

H3F3A基因位于1號(hào)染色體q42.12區(qū)，與17號(hào)染色體的H3F3B基因一同編碼H3組蛋白的變體——H3.3組蛋白[4，59]。不同于H3.1和H3.2組蛋白，H3.3組蛋白以不依賴DNA復(fù)制的方式，在伴侶分子HIRA(histone cell cycle regulator)的協(xié)助下沉積至核小體高頻更替區(qū)域的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)[60]。此外，H3.3組蛋白游離的N端存在許多翻譯后修飾位點(diǎn)(post-translational modifications，PTMs)，如H3.3K9me1、H3.3K27me3、H3.3K36me3和H3.3K14ac等，異常的PTMs將顯著改變H3.3組蛋白生理功能，激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄，演變?yōu)轵?qū)動(dòng)GCTB的“癌組蛋白”[61-62](圖1)。

GCTB組織活檢發(fā)現(xiàn)94.3%～100%的患者存在H3F3A基因突變，導(dǎo)致H3.3組蛋白上34位甘氨酸(G34)變?yōu)樯彼?G34W)，或更為罕見(jiàn)的亮氨酸(G34L)、纈氨酸(G34R)和甲硫氨酸(G34R)等[63-66]。G34作為甲基轉(zhuǎn)移酶SETD2(SET domain containing 2)和PRC2(polycomb repressive complex 2)結(jié)合H3.3組蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)，突變后的氨基酸由于空間位阻的變化顯著地改變了SETD2和PRC2酶活性，進(jìn)而通過(guò)順式作用改變G34兩側(cè)的K36和K27的甲基化穩(wěn)態(tài)[67-68]。H3.3K36在增強(qiáng)子區(qū)域甲基化水平較高，被視為轉(zhuǎn)錄抑制標(biāo)記；而H3.3K27可成為轉(zhuǎn)錄延伸階段的甲基化標(biāo)記位點(diǎn)，進(jìn)而募集其他轉(zhuǎn)錄因子廣泛地影響轉(zhuǎn)錄[62，69]。一方面，SETD2介導(dǎo)的K36甲基化降低通過(guò)抑制成骨相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄使得GCTB單核梭形基質(zhì)細(xì)胞成骨能力下降，維持在低度分化的增殖狀態(tài)[70]。另一方面，PRC2介導(dǎo)的部分增強(qiáng)子區(qū)域K27甲基化水平升高導(dǎo)致部分轉(zhuǎn)錄因子(如OPG基因轉(zhuǎn)錄因子E2F)失活，下游分泌破骨細(xì)胞生成抑制因子OPG減少，RANKL/OPG比例升高，GCTB單核梭形基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和激活的能力增強(qiáng)，最終導(dǎo)致溶骨性破壞[71]。

2.2 ZNF687基因突變經(jīng)由轉(zhuǎn)錄樞紐調(diào)控驅(qū)動(dòng)RANKL/OPG平衡失調(diào)

ZNF687基因編碼具有C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄樞紐蛋白，在肝癌、白血病和肺腺癌中具有促癌功能[72-74]。PDB/GCT家族隊(duì)列和PDB/GCT散發(fā)人群中，ZNF687基因2810位C突變?yōu)镚(c.2810C>G)的發(fā)生率為67%～86%，進(jìn)而導(dǎo)致ZNF687蛋白P937R的錯(cuò)義突變[52]。在美國(guó)黑人PDB/GCT患者中同樣發(fā)現(xiàn)ZNF687蛋白相同的P937R突變，證實(shí)不同基因背景下ZNF687基因突變與PDB/GCT存在普遍性關(guān)聯(lián)[75]。

圖1 骨巨細(xì)胞瘤發(fā)病的驅(qū)動(dòng)因素Fig.1 Driving factors in giant cell tumor of bone

ZNF687蛋白突變后，同ZNF592蛋白(zinc finger protein 592)和ZNF532蛋白(zinc finger protein 532)構(gòu)成的異源三聚體Z3復(fù)合物活性異常升高，通過(guò)復(fù)合物NuRD(nucleosome remodeling and histone deacetylase)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子ZMYND8(zinc finger MYND-type containing 8)或轉(zhuǎn)錄因子HIF1A(hypoxia inducible factor 1 subunit alpha)等促進(jìn)PDB/GCT進(jìn)展[76-77]。首先是破骨細(xì)胞活性受到影響，攜帶ZNF687突變的PDB/GCT患者破骨細(xì)胞內(nèi)RANK表達(dá)升高，可耗竭OPG的負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng)，破骨細(xì)胞前體進(jìn)入到破骨細(xì)胞之間的融合階段啟動(dòng)溶骨，融合后的破骨細(xì)胞核數(shù)目可達(dá)153個(gè)，大量骨質(zhì)破壞釋放的細(xì)胞因子給予了PDB伴發(fā)GCT的土壤[75，78]。另一方面，突變后的Z3復(fù)合物失去經(jīng)由ZMYND8因子特異性標(biāo)記組蛋白乙?；l(fā)揮修復(fù)DNA的功能，DNA損傷后ZMYND8因子不再形成NuRD-GATA2A復(fù)合物(nucleosome remodeling and histone deacetylase-GATA binding protein 2)維持DNA損傷端的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致單核梭形基質(zhì)細(xì)胞加速DNA修復(fù)和異常增殖，表達(dá)大量RANKL進(jìn)一步刺激破骨細(xì)胞溶解骨質(zhì)[79-80]。ZNF687基因突變引起破骨細(xì)胞與單核梭形基質(zhì)細(xì)胞形成“溶骨-增殖-再溶骨”的惡性循環(huán)，成為PDB/GCT發(fā)病的重要機(jī)制。

2.3 端粒聯(lián)合通過(guò)染色體末端調(diào)控驅(qū)動(dòng)RANKL/OPG平衡失調(diào)

正常體細(xì)胞端粒長(zhǎng)度隨著細(xì)胞復(fù)制而不斷縮短，較長(zhǎng)的端粒通過(guò)端粒位置效應(yīng)(telomere position effect，TPE)或長(zhǎng)距離端粒位置效應(yīng)(telomere position effect-over long distances，TPE-OLD)抑制亞端粒區(qū)基因表達(dá)，一旦端粒隨細(xì)胞復(fù)制縮短將啟動(dòng)細(xì)胞凋亡以防止癌變[81]。70%～85%的GCTB患者中存在端?？s短后通過(guò)異源染色體兩端端?；ハ嘟Y(jié)合抵抗細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，稱為端粒聯(lián)合(telomeric associations，TAs)[82-83]。

TAs一方面通過(guò)破壞基因組完整性，抑制端粒形成保護(hù)性“D”環(huán)或“T”環(huán)結(jié)構(gòu)，釋放DNA損傷信號(hào)加速單核梭形基質(zhì)細(xì)胞DNA異常修復(fù)；另一方面影響端粒通過(guò)組蛋白調(diào)控的染色體末端基因表達(dá)，改變亞端粒區(qū)基因表達(dá)模式抵抗凋亡[83-84]。與正常細(xì)胞相比，攜帶H3.3-G34W突變的GCTB患者染色質(zhì)甲基化整體水平下降20%，兩種伴侶蛋白ATRX(alpha thalassemia/mental retardation syndrome x-linked)和DAXX(death domain associated protein)協(xié)助H3.3組蛋白沉積在端粒區(qū)使之甲基化水平下降，端粒結(jié)合蛋白TRF1(telomeric repeat binding factor 1)對(duì)端粒親和力升高，TAs發(fā)生率顯著升高[85-86]。端粒區(qū)域由于TAs帶來(lái)的基因組不穩(wěn)、TPE和TPE-OLD的調(diào)控失衡，使得單核梭形基質(zhì)細(xì)胞的錯(cuò)譯突變通過(guò)組蛋白不斷地被“放大”，導(dǎo)致亞端粒區(qū)的基因表達(dá)受到影響[87]。SAMD14(sterile alpha motif domain containing 14)、ZMYND11(zinc finger MYND-type containing 11)、CDK10(cyclin dependent kinase 10)和OPG等調(diào)控基質(zhì)細(xì)胞增殖分化和誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的基因均位于亞端粒區(qū)，可能受到TAs的影響從而降低其表達(dá)水平，驅(qū)動(dòng)RANKL/OPG升高，加速單核梭形基質(zhì)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成，演變?yōu)镚CTB[86]。

3 展望

通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，研究者在過(guò)去10年間發(fā)現(xiàn)原發(fā)和繼發(fā)的GCTB中廣泛存在的基因突變，在機(jī)制層面向我們展示了GCTB內(nèi)RANKL/OPG失衡的驅(qū)動(dòng)因素。本文綜述了GCTB發(fā)病的分子機(jī)制特點(diǎn)和基因突變驅(qū)動(dòng)GCTB的重要研究進(jìn)展，總結(jié)了突變所帶來(lái)的下游關(guān)鍵分子的變化趨勢(shì)，為GCTB診斷治療提供新的思路。目前RANKL/OPG作為臨床治療GCTB的重要靶點(diǎn)效果良好，繼續(xù)在發(fā)病機(jī)制層面深入研究將為精確診斷骨巨細(xì)胞瘤、開(kāi)發(fā)單克隆抗體藥物和開(kāi)展GCTB遺傳學(xué)診斷提供新的思路。針對(duì)基因突變所驅(qū)動(dòng)的GCTB帶來(lái)的下游效應(yīng)仍需更多的探索，這將是有效治療骨巨細(xì)胞瘤的基礎(chǔ)。