多巴胺D4受體對酒精依賴大鼠海馬區(qū)cAMP/PKA通路的影響

劉洪鳳，安子宜，董澤嵩，霍楠楠，韓智學(xué)，榮勝忠，楊 勇，李 齊，關(guān)利新

酒精依賴是一種慢性多因素腦疾病，具有無法控制飲酒的特征，是世界性公共衛(wèi)生問題之一[1]。酒精依賴可以導(dǎo)致多種軀體和精神疾病，不僅損害了個人的健康，更是家庭暴力以及犯罪的重要因素，加重了個體及社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理負(fù)擔(dān)。酒精依賴主要表現(xiàn)為長期飲酒及自我調(diào)節(jié)失控，進(jìn)而導(dǎo)致病人的生理、心理和社會適應(yīng)能力下降[2]，可能會帶來許多不利的健康后果，可能會通過許多機(jī)制損害神經(jīng)系統(tǒng)[3]，因此，酒精依賴導(dǎo)致的大腦結(jié)構(gòu)和功能改變的各項研究逐漸成為科研熱點。

DRD4是多巴胺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵組成部分，由于酒精影響多巴胺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式而被選擇作為酒精依賴的候選因子[4-5]。DRD4廣泛分布于海馬，在調(diào)節(jié)海馬區(qū)神經(jīng)傳遞中起關(guān)鍵作用，其與配體結(jié)合后可調(diào)節(jié)cAMP的水平，cAMP/PKA的改變影響酒精依賴有關(guān)的行為反應(yīng)[6]，因此，DRD4介導(dǎo)的cAMP/PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異?？赡苁钱a(chǎn)生酒精依賴的原因。本研究旨在研究DRD4對酒精依賴大鼠海馬區(qū)cAMP/PKA通路的影響，進(jìn)一步揭示酒精依賴相關(guān)的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制，為酒精依賴的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級6周齡雄性SD大鼠42只，體質(zhì)量170～200 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司[SCXK(遼)2015-0001]。于SPF級鼠類實驗室牡丹江醫(yī)學(xué)院實驗動物中心[SYXK(黑)2019-006]進(jìn)行動物模型的構(gòu)建。本次動物實驗經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，符合實驗動物倫理要求。

1.2 主要試劑 Marker(美國Thermo公司)；ECL顯色液(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；DRD4、AC、DKA、CREB、β-actin、一抗(兔抗大鼠)、二抗(山羊抗兔)(北京Bioss 公司)；總RNA提取試劑盒(北京Solarbio公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連Takara公司)；引物(上海生物工程股份有限公司)；轉(zhuǎn)染試劑(北京Engreen公司)；siRNA序列(武漢金拓思生物科技有限公司)。

1.3 主要儀器 Step One Real-Time PCR System(美國Applied Biosystems公司)；轉(zhuǎn)膜儀(美國BIO-RAD公司)；腦立體定位儀(上海玉妍科學(xué)儀器有限公司)；Amersham Imager 600(美國GE 公司)。

1.4 方法

1.4.1 模型的構(gòu)建 將SPF級雄性SD大鼠42只隨機(jī)分為正常對照組(n=8)和10%酒精依賴模型組(n=34)，大鼠適應(yīng)1周后制備模型。對照組為2瓶100 mL蒸餾水，模型組為1瓶10%乙醇100 mL和1瓶蒸餾水100 mL，每天記錄大鼠的飲水量、飲酒量，每天更換水瓶和酒精瓶的位置、更新溶液，連續(xù)造模4周。每周檢測大鼠體質(zhì)量。飲酒組大鼠的酒精攝入量(>3.15 g·kg-1·24 h-1)和酒精偏好(=飲酒量占總液體攝入量的百分比)逐漸穩(wěn)定時，即成功制備SD大鼠酒精依賴模型[7]。在34只SD大鼠中，共有32只SD大鼠建模成功(1只由于飲酒量低未成癮而剔除，1只由于體質(zhì)量顯著下降、未成癮而剔除)，隨機(jī)取8只作為酒精依賴模型對照組，取24只構(gòu)建DRD4 siRNA低表達(dá)組模型。

1.4.2 體內(nèi)轉(zhuǎn)染 將酒精依賴模型制備成功大鼠，進(jìn)行DRD4 siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染。 配制體內(nèi)轉(zhuǎn)染復(fù)合物：按照轉(zhuǎn)染試劑說明書要求，將siRNA(NC序列：5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′；DRD4 siRNA序列：5′-CCG CUC AUGC UAC UGC UUU TT-3′)5 μL(1 g/L)、2.5 μL轉(zhuǎn)染試劑以及12.5 μL稀釋溶液混勻，配成20 μL siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染體系，室溫靜置15 min后備用。

DRD4 siRNA低表達(dá)組模型的構(gòu)建：將24只酒精依賴模型組大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只，分別為空白對照組(SD-No siRNA)、陰性對照組(SD-Ctr siRNA)和DRD4 siRNA低表達(dá)組(SD-DRD4 siRNA)。將大鼠麻醉后置于腦立體定位儀中，將20 μL 0.9%氯化鈉溶液/NC siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物/DRD4 siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物分別緩慢注入SD-No siRNA組、SD-Ctr siRNA組和SD-DRD4 siRNA組右側(cè)腦室。在24 h后，檢測DRD4的表達(dá)情況，與SD-Ctr siRNA組比較，SD-DRD4 siRNA組大鼠DRD4的表達(dá)下降50%～60%，即成功構(gòu)建DRD4 siRNA低表達(dá)組大鼠模型[8]。

1.4.3 大鼠海馬區(qū)相關(guān)基因mRNA表達(dá)的qPCR檢測 將大鼠吸入七氟烷麻醉后行安樂死，取出腦組織中的海馬區(qū)備用，根據(jù)總RNA提取試劑盒說明書提取SD大鼠海馬區(qū)的總RNA；根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄樣品配制，通過S1000 Thermal Cycler PCR進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；采用Step One Real-Time PCR System qPCR檢測DRD4、AC、PKA、CREB的mRNA表達(dá)水平。

引物序列：β-actin(上游序列：5′-AGG CCA ACC GTG AAA AGA TG-3′，下游序列：5′-ACC AGA GGC ATA CAG GGA CAA-3′)；DRD4(上游序列：5′-TGA TGT GTT GGA CGC CTT TCT TCG-3′，下游序列：5′-ACA TAG CCC AGC CAG GTG ACA -3′)；AC(上游序列：5′-AGG GCA AGG GAG AGA TGC TA-3′，下游序列：5′-AGA GAG CCC CGG TTT GAT TG-3′)；PKA(上游序列：5′-ACT TCC CGT TCC TGG TCA AAC TTG-3′，下游序列：5′-GGC TCG CTG AAC CTT CCA ATC C-3′)；CREB(上游序列:5′-AAC TGA TTC CCA AAA ACG AAG G-3′，下游序列：5′-CAC TGC TAG TTT GGT AAA TGG G-3′)。

反應(yīng)體系：根據(jù)TB Green?Premix Ex TaqTM說明書配制20 μL反應(yīng)液，包括TB GREEN 10 μL，上、下游引物(10 mmol/L)各0.4 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，cDNA 2 μL，滅菌水6.8 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性(95 ℃ 30 s)；PCR反應(yīng)(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次)；Melt Curve(95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s)。mRNA的表達(dá)水平以2-△△Ct表示，在Excel中計算出△Ct，△Ct=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)，再計算出2-△Ct，算出2-△Ct的平均值后，將每個2-△Ct除以2-△Ct的平均值，得出2-△△Ct。

1.4.4 大鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白表達(dá)的Western blotting檢測 取100 mg海馬組織加150 μL裂解緩沖液，充分裂解后，冰上搖床30 min，4 ℃ 13 000 r/min離心10 min，提取上清總蛋白；用移液槍吸取2 μL總蛋白，在NanoDrop2000中測定蛋白濃度，重復(fù)3次，取平均值；將各組蛋白濃度定量為40 μg/15 μL，煮蛋白10 min；在上樣孔上樣后，采用80 V電壓電泳；電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗(兔抗大鼠)、二抗(山羊抗兔)孵育后，用Amersham Imager 600顯色并進(jìn)行灰度值分析，蛋白的相對表達(dá)水平以目的抗體條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗、方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 酒精依賴動物模型的建立 經(jīng)過連續(xù)飲酒28次循環(huán)，模型組乙醇攝入量在最后7 d穩(wěn)定在(6.58±0.41)g·kg-1·24 h-1，在最后7次飲酒之間的乙醇攝入量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；乙醇偏好穩(wěn)定在(63.61±2.16)%，在最后7次飲酒的乙醇偏好差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 DRD4/cAMP/PKA通路在酒精依賴大鼠海馬區(qū)的mRNA表達(dá)情況 與正常對照組比較，模型對照組DRD4 mRNA明顯升高(P<0.01)，AC、PKA、CREB mRNA明顯下降(P<0.01)(見表1)。

2.3 DRD4/cAMP/PKA通路在酒精依賴大鼠海馬區(qū)的蛋白表達(dá)情況 與正常對照組比較，模型對照組DRD4蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，AC、PKA、CREB蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)(見圖1、表2)。

2.4 體內(nèi)轉(zhuǎn)染24 h后大鼠海馬區(qū)DRD4、AC、PKA、CREB mRNA的表達(dá)情況 在體內(nèi)轉(zhuǎn)染24 h后，SD-DRD4 siRNA組DRD4、CREB mRNA表達(dá)水平均低于SD-No siRNA組和SD-Ctr siRNA組(P<0.01)，AC、PKA mRNA表達(dá)水平均高于siRNA組和SD-Ctr siRNA組(P<0.01)(見表3)。

表1 酒精依賴大鼠海馬區(qū)相關(guān)基因的mRNA相對表達(dá)情況

表2 酒精依賴大鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白表達(dá)的灰度值分析

表3 體內(nèi)轉(zhuǎn)染24 h后海馬區(qū)相關(guān)基因mRNA的相對表達(dá)情況

2.5 DRD4/cAMP/PKA途徑在體內(nèi)轉(zhuǎn)染24 h后大鼠海馬區(qū)蛋白的表達(dá)情況 在體內(nèi)轉(zhuǎn)染24 h后，SD-DRD4 siRNA組DRD4和CREB蛋白表達(dá)水平均低于SD-No siRNA組和SD-Ctr siRNA組(P<0.01)，AC、PKA蛋白表達(dá)水平均高于siRNA組和SD-Ctr siRNA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見圖2、表4)。

表4 酒精依賴大鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白表達(dá)的灰度值分析

3 討論

目前，有學(xué)者[9]研究發(fā)現(xiàn)多巴胺獎賞途徑參與酒精依賴的形成，CLAY等[10]研究表明，長期飲酒會導(dǎo)致多巴胺獎賞途徑的神經(jīng)適應(yīng)和神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)性的增加。乙醇的獎勵作用是由中腦多巴胺能獎賞系統(tǒng)的改變導(dǎo)致伏隔核、海馬和杏仁核等多巴胺水平的增加所介導(dǎo)的，即當(dāng)乙醇在藥理學(xué)劑量下，激活中腦多巴胺能獎賞回路，增加伏隔核、海馬和杏仁核中多巴胺的含量，引發(fā)對乙醇厭惡反應(yīng)的減少和獎賞反應(yīng)的相對增加[11-12]。中腦邊緣多巴胺是一種具有5種受體亞型的神經(jīng)遞質(zhì)，通過結(jié)合5個不同的受體參與獎賞反應(yīng)，故多巴胺受體成為研究物質(zhì)成癮的重要靶標(biāo)[13]。cAMP/PKA信號通路參與各種神經(jīng)遞質(zhì)(5-羥色胺、乙酰膽堿、谷氨酸和多巴胺)的傳遞，并在認(rèn)知功能中發(fā)揮重要作用[14]。據(jù)報道[15]，cAMP/PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)與物質(zhì)(乙醇、嗎啡、尼古丁等)成癮有關(guān)的行為反應(yīng)。

本實驗結(jié)果顯示，在酒精依賴大鼠海馬區(qū)，DRD4 mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高，這與TARASKINA等[16]的報道一致；AC、PKA、CREB mRNA及蛋白表達(dá)明顯下降，這與MUNTEAN等[17]的報道一致。通過體內(nèi)轉(zhuǎn)染進(jìn)行DRD4敲減，驗證酒精依賴時DRD4與cAMP/PKA通路的調(diào)控關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，在酒精依賴大鼠海馬區(qū)，DRD4 mRNA及蛋白水平明顯下降，AC、PKA、的mRNA及蛋白水平明顯升高，CREB mRNA及蛋白仍然保持下降水平，這可能是由于磷酸化的CREB增加，例如，KONAR等[18]通過體內(nèi)激肽釋放酶8 siRNA轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)在改善認(rèn)知障礙時，海馬區(qū)的PKA和磷酸化CREB增高。

綜上所述，酒精依賴時，大鼠海馬區(qū)DRD4高表達(dá)，AC、PKA、CREB低表達(dá)，敲減DRD4后，AC、PKA高表達(dá)。本研究結(jié)果表明酒精依賴中DRD4與cAMP/PKA通路具有調(diào)控關(guān)系，DRD4介導(dǎo)的cAMP/PKA通路可能在酒精依賴產(chǎn)生的神經(jīng)適應(yīng)性改變中發(fā)揮重要作用，可以為酒精依賴相關(guān)的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究提供新思路。