siRNA干擾MafA對小鼠胰島β細胞的生長以及胰島素相關(guān)基因的表達分析

孫志兵，楊 娟

糖尿病是臨床上較為常見的疾病之一，發(fā)病后多為長期帶病生存，目前臨床共識認為糖尿病發(fā)病機制為胰島素抵抗或胰島素分泌不足[1-2]。隨著基因技術(shù)的不斷發(fā)展，糖尿病相關(guān)的基因表達調(diào)控通路不斷被發(fā)現(xiàn)[3]。肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue A，MafA)被多個研究證實是胰島細胞增殖和分泌胰島素的重要調(diào)控因子，下調(diào)MafA的表達水平將會導(dǎo)致胰島β細胞功能障礙，引起胰島素分泌不足，上調(diào)MafA的表達水平則會增加胰島素的分泌[4-6]。基于此，本研究采用siRNA干擾胰島細胞MafA基因的表達，觀察胰島素相關(guān)基因和蛋白表達水平及胰島素的濃度變化情況。

1 材料與方法

1.1 細胞 小鼠胰島β細胞株Min6購自上海晶抗生物工程有限公司。

1.2 儀器與試劑 Trizol RNA iso試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)、胎牛血清均購買自美國Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒、PCR引物、siRNA購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；GAPDH抗體、兔抗鼠MafA多克隆抗體購自美國Novus Biologicals公司；Western blotting檢測試劑盒、ELISA試劑盒購買自蘇州宇恒生物科技有限公司。酶聯(lián)免疫吸附儀購自北京普天新橋技術(shù)有限公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀購自深圳市瑞安康醫(yī)療器械有限公司，凝膠電泳分析系統(tǒng)購自英國CLEAVER公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠胰島β細胞的培養(yǎng) 將冷凍保存的Min6細胞在37 ℃水浴中融化，復(fù)蘇后將細胞株接種在加入10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3.2 MafA基因的siRNA序列 搜索數(shù)據(jù)庫MafA基因序列，設(shè)計MafA基因的siRNA序列正義鏈為：5′ UGA UGA AGU UCG AGG UGA AdTdT 3′，反義鏈為：5′ UUC ACC UCG AAC UUC AUC AdTdT 3′，由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。

1.3.3 實驗分組與處理 取對數(shù)生長期Min6細胞，以胰蛋白酶消化處理后，以合適的密度(40%～50%)接種于6孔板或96孔板中進行培養(yǎng)，實驗分為MafA干擾A組、MafA干擾B組、MafA干擾C組、對照D組、對照E組、對照F組，其中MafA干擾A組、MafA干擾B組、MafA干擾C組應(yīng)用MafA siRNA進行轉(zhuǎn)染，對照D組、對照E組、對照F組未采取siRNA干擾，培養(yǎng)液葡萄糖濃度依次為MafA干擾A組和對照D組5.6 mmol/L、MafA干擾B組和對照E組10 mmol/L、MafA干擾C組和對照F組25 mmol/L。

1.3.4 實時熒光定量PCR 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h的Min6細胞，用胰蛋白酶消化，采用TRIzol法提取細胞中總RNA。取20 μg總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄操作參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書。引物由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。進行熒光定量PCR檢測，PCR擴增條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。采用2-△△CT法計算各基因的相對表達量。

表1 相關(guān)基因的引物序列

1.3.5 Western blotting 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的Min6細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后接種于96孔板，每孔1×108個細胞，加入適量RIPA細胞裂解液，冰上裂解30 min，收集裂解液于離心管中，在預(yù)冷4 ℃的離心機中5 000 r/min離心5 min，取上清液，經(jīng)95 ℃水浴后，應(yīng)用二喹啉甲酸法檢測總蛋白濃度。取40 μg總蛋白，用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，采用電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，在室溫條件下封閉2 h。然后加入稀釋的兔抗鼠MafA蛋白抗體(1∶800)、GAPDH抗體(1∶8 000)在4 ℃孵育過夜。第2天用PBST洗滌，重復(fù)3次，然后加二抗孵育2 h，用PBST洗滌3次，再用二氨基聯(lián)苯胺顯影液進行顯影。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3.6 MTT法測定細胞增殖 取Min6細胞懸液接種于96孔板中，每孔6 000個細胞、培養(yǎng)基100 μL，設(shè)置8個復(fù)孔。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)染siRNA培養(yǎng)48 h，再以不同葡萄糖濃度培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTT溶液，反應(yīng)4 h。棄掉孔內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，測定吸光度值(OD)。

1.3.7 ELISA法測定胰島素濃度 將Min6細胞懸液接種在48孔培養(yǎng)板中，每孔8 000個細胞，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)染siRNA培養(yǎng)48 h，然后加入無糖KRBB進行平衡，靜置1 h，再以含有不同葡萄糖濃度KRBB培養(yǎng)24 h，測定上清液中胰島素的濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 MafA siRNA轉(zhuǎn)染后各組MaFA mRNA及蛋白相對表達水平比較 在MaFA mRNA表達水平，MafA干擾B組和對照E組、MafA干擾C組、對照F組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；MafA干擾A組、MafA干擾B組、MafA干擾C組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在MaFA蛋白表達水平，MafA干擾B組和對照E組、MafA干擾C組和對照F組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；MafA干擾A組、MafA干擾B組、MafA干擾C組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

表2MafA siRNA轉(zhuǎn)染后各組MaFA mRNA及蛋白相對表達水平比較

2.2 MafA siRNA轉(zhuǎn)染對Min6細胞增殖的影響 在25 mmol/L葡萄糖濃度的MafA干擾C組Min6細胞OD值低于對照F組(P<0.05)；在葡萄糖濃度為5.6 mmol/L、10 mmol/L的MafA干擾A組和對照D組、MafA干擾B組和對照E組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

表3 各組Min6細胞OD值比較

2.3 各組胰島素相關(guān)基因Insulin-1、Insulin-2 mRNA相對表達量比較 MafA干擾A組Insulin-1、Insulin-2 mRNA相對表達量和對照D組、MafA干擾B組、對照E組，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；MafA干擾C組Insulin-1、Insulin-2 mRNA相對表達量低于對照F組(P<0.05)(見表4)。

表4 各組Insulin-1、Insulin-2 mRNA相對表達量比較

2.4 各組胰島素濃度比較 MafA干擾A組胰島素濃度和對照D組、MafA干擾B組和對照E組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；MafA干擾C組胰島素濃度低于對照F組(P<0.05)(見表5)。

表5 各組胰島素濃度比較

3 討論

MafA基因位于第8對染色體上，全長3 123 bp，目前認為MafA基因可能參與了糖尿病發(fā)生的過程[7]。有研究[8-9]顯示在小鼠胰腺發(fā)育的胚胎期，未檢測到MafA基因，而在胰腺發(fā)育的后期，則可以檢測到MafA基因，并且隨著時間的增長MafA基因的表達水平逐漸增多，說明MafA基因可能參與了胰腺組織的發(fā)育。MATSUOKA等[10]在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染Mafa基因和Pdx1基因后，觀察胰島胚胎細胞以及胰島α細胞發(fā)生和轉(zhuǎn)化情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的小鼠能將Ngn3陽性胰島細胞和胰島α細胞轉(zhuǎn)化為胰島β細胞，從而為胰島細胞的可塑性提供了新的證據(jù)。而在對人胰腺組織的研究[11]中，研究者對手術(shù)后取得的2型糖尿病胰島組織進行分析，測定該胰島組織細胞內(nèi)的MafA基因，結(jié)果顯示胰腺組織中的MafA基因水平明顯降低，進一步證明MafA基因與2型糖尿病的發(fā)生有密切關(guān)系。有學(xué)者[12-13]提出，不同葡萄糖濃度下，MafA基因的表達水平可能不同，在低糖條件下時MafA基因的表達水平受到抑制，推測具體機制可能為MafA基因的相關(guān)序列發(fā)生了磷酸化，導(dǎo)致了MafA基因表達的降低，進一步影響細胞的生長。本研究采用siRNA干擾MafA基因的表達，觀察不同葡萄糖濃度下胰島細胞增殖以及胰島素相關(guān)基因及蛋白的表達。

本研究對MafA siRNA轉(zhuǎn)染后的效果進行觀察，發(fā)現(xiàn)MafA siRNA能有效干擾MaFA mRNA及蛋白的表達，而在不同葡萄糖濃度時干擾的效果也不一致，在10、25 mmol/L時，MaFA基因和蛋白的表達較與未轉(zhuǎn)染組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示在10、25 mmol/L葡萄糖濃度下siRNA抑制MaFA表達的效果好，而在5.6 mmol/L條件下，轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能由于低糖抑制正常胰腺細胞MaFA的表達，從而降低了MaFA基因表達的水平。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)MafA siRNA轉(zhuǎn)染后的胰島細胞增殖會受到MaFA表達的影響，相同葡萄糖濃度下，下調(diào)MaFA基因表達，其胰島細胞增殖數(shù)量減少。當(dāng)葡萄糖濃度不同時，胰島細胞內(nèi)MaFA基因的表達量不同，也會導(dǎo)致胰島細胞增殖的差異性。王鴻武等[14]對間充質(zhì)干細胞進行研究發(fā)現(xiàn)，增加MaFA基因表達，能夠上調(diào)glucagon、Nkx2.2、Pdx1基因水平，但對于間充質(zhì)細胞的形態(tài)和數(shù)量未見明顯變化，本研究與其結(jié)論不一致，分析原因可能為研究對象不同，采取的轉(zhuǎn)染方式不一致，觀察的指標(biāo)不相同，最終導(dǎo)致了結(jié)論的差異性。

本研究觀察胰島素相關(guān)基因和胰島素水平，發(fā)現(xiàn)下調(diào)MaFA基因表達水平，會導(dǎo)致相應(yīng)的胰島素基因表達受抑制，但胰島素濃度的變化與MaFA基因的表達無線性相關(guān)性，分析原因可能為MaFA基因介導(dǎo)了Insulin-1、Insulin-2兩種基因的表達通路，并通過兩種基因?qū)σ葝u素的表達進行調(diào)節(jié)；并發(fā)現(xiàn)胰島素濃度與胰島素基因的表達有一定關(guān)聯(lián)，但胰島素濃度的變化未呈現(xiàn)明確的線性關(guān)系，分析原因可能為胰島素分泌可能為多條信號通路介導(dǎo)，與楊梅等[15]研究結(jié)果相近。

綜上所述，MafA基因的表達在胰島細胞增殖和胰島素分泌中發(fā)揮一定的作用，下調(diào)MafA基因能抑制小鼠胰島細胞的增殖，并且降低Insulin-1、Insulin-2 mRNA的表達，但對胰島素分泌的影響還有待進一步研究。