利用GT1-7細(xì)胞系研究ghrelin對(duì)下丘腦刺鼠相關(guān)蛋白的表達(dá)效果

李培鑫 饒志堅(jiān) 黃 虎

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院醫(yī)療保健中心綜合外科，北京 100050；2.上海師范大學(xué)體育學(xué)院人體科學(xué)教研室，上海 200234； 3.東卡羅來納大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)系、生理系、人體機(jī)能研究所 東卡羅來納糖尿病與肥胖研究所，美國北卡來納州 27834)

過去的十幾年里，全球已有超6.5億成人患有肥胖癥，而肥胖是2型糖尿病的重要危險(xiǎn)因素，也是心血管疾病的決定因素，目前急需一種行之有效的治療方案[1-3]。袖狀胃切除術(shù)(sleeve gastrectomy，SG)操作簡便、減重效果明顯，并可緩解2型糖尿病，尤其腹腔鏡下SG，目前已成為應(yīng)用最廣泛的代謝手術(shù)之一[1, 4]。但SG對(duì)于機(jī)體代謝改變的機(jī)制仍未明確。目前普遍認(rèn)為SG通過降低ghrelin使機(jī)體代謝改變[4-6]。Ghrelin(胃促生長素，俗稱饑餓素)主要由胃底分泌，與下丘腦生長激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor，GHSR)結(jié)合，促進(jìn)神經(jīng)肽Y/刺鼠相關(guān)蛋白(neuropeptide Y/agouti-related protein，NPY/AgRP)神經(jīng)元分泌NPY/AgRP，從而促進(jìn)生長激素釋放、促進(jìn)進(jìn)食行為并導(dǎo)致肥胖[1, 7]。然而由于ghrelin作用的神經(jīng)元位于下丘腦，無法直接進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需通過電生理學(xué)進(jìn)行[8]，又很難達(dá)到普及。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相對(duì)容易操作，但目前缺乏適合操作的永生細(xì)胞系。本文旨在介紹一種可對(duì)ghrelin刺激產(chǎn)生反應(yīng)的細(xì)胞系，并揭示ghrelin對(duì)AgRPmRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)神經(jīng)元細(xì)胞系GT1-7細(xì)胞系，以及人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞系，均由美國東卡羅來納大學(xué)、東卡羅來納糖尿病與肥胖研究所惠贈(zèng)。本研究利用的研究信息不含有使受試者的身份被直接識(shí)別或通過與其相關(guān)的識(shí)別物識(shí)別的信息，免除倫理審查。

1.2 主要試劑

試劑：達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素/鏈霉素(penicillin/streptomycin，P/S)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸[trypsin-EDTA，0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))]，購于美國Thermo Fisher Scientific公司。Ghrelin ，購于美國Cayman Chemical 公司。

普通細(xì)胞培養(yǎng)液按DMEM 445 mL、FBS 50 mL、P/S 5 mL進(jìn)行混合[10%(體積分?jǐn)?shù))FBS、 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) P/S]配制；無血清細(xì)胞培養(yǎng)液(無FBS)按DMEM 495 mL、P/S 5 mL進(jìn)行混合[1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))P/S]配制。

細(xì)胞裂解液[cell lysis buffer(10×)]、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，購于美國Cell Signaling Technology 公司。BCA蛋白定量分析試劑盒、硝酸纖維膜(NC膜)(0.45 Micron，30 cm × 3.5 m/卷)，購于美國Thermo Fisher Scientific公司。蛋白質(zhì)電泳膠板(4%～20% CriterionTMTris-HCl Protein Gel，18孔，30 μL/孔)，美國Bio-Rad Laboratories公司。一抗GHSR[GHS-R1 (E-7)， sc-374515]、二抗牛單克隆抗小鼠二抗耦聯(lián)辣根過氧化物酶(bovine anti-mouse IgG-HRP，sc-2371)，購于美國Santa Cruz公司。

總RNA抽提試劑(trizol)，購于美國Invitrogen公司；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 預(yù)混液(power SYBR green PCR master mix)，購于美國Applied Biosystems公司；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑[prime script RT master mix(RR036A)]，購于日本TAKARA公司?；蛞镄蛄袇⒖家寻l(fā)表文獻(xiàn)[1, 9-10]，詳見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 RT-qPCR primer sequence

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的細(xì)胞在37 ℃水浴槽內(nèi)復(fù)蘇，加入 DMEM(10% FBS、 1% P/S)，1 000 r/min離心5 min，超凈臺(tái)內(nèi)棄除上清液，細(xì)胞沉淀加入新鮮普通細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打致懸，轉(zhuǎn)移至100 mm無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，放入37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))二氧化碳培養(yǎng)箱。待細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%左右，進(jìn)行傳代。棄除舊液，加入2 mL 0.05% trypsin-EDTA，待細(xì)胞消化適度，加入8 mL DMEM終止消化， 1 000 r/min離心5 min，棄除上清液，按1∶3傳代。傳代至第三代時(shí)進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 GT1-7細(xì)胞GHSR表達(dá)的檢測

從同期3個(gè)GT1-7細(xì)胞培養(yǎng)皿以及3個(gè)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)分別提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Western blotting。HepG2細(xì)胞為對(duì)照組。

1.3.3 血清饑餓對(duì)GT1-7細(xì)胞的影響

將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板，傳代方式同上，每100 mm培養(yǎng)皿加入12 mL DMEM制造細(xì)胞懸液，每孔2 mL細(xì)胞懸液。待細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%左右，棄除舊的DMEM。其中3孔加入含F(xiàn)BS培養(yǎng)液，為含F(xiàn)BS組；另外3孔加入無FBS培養(yǎng)液(僅1% P/S)，為不含F(xiàn)BS組。放入培養(yǎng)箱12 h后，提取cDNA，進(jìn)行RT-qPCR，檢驗(yàn)兩組間mRNA表達(dá)量差異。

1.3.4 不同時(shí)間ghrelin刺激對(duì)含F(xiàn)BS培養(yǎng)液的GT1-7細(xì)胞的影響

將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板，共2板，傳代方式同上。待細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%左右，棄除舊的DMEM。3孔加入含F(xiàn)BS培養(yǎng)液，為空白對(duì)照組；另取一板，3孔加入含100 nmol/L ghrelin的含F(xiàn)BS培養(yǎng)液，為3 h組，放入培養(yǎng)箱內(nèi)； 2 h后將上述培養(yǎng)板的另外3孔加入含100 nmol/L ghrelin的含F(xiàn)BS培養(yǎng)液，為1 h組，放入培養(yǎng)箱內(nèi)； 1 h后提取cDNA，進(jìn)行RT-qPCR，檢驗(yàn)3組間mRNA表達(dá)量差異。

1.3.5 不同濃度ghrelin刺激對(duì)含F(xiàn)BS培養(yǎng)液的GT1-7細(xì)胞的影響

將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板，共2板，傳代方式同上。待細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%左右，棄除舊的DMEM。3孔加入普通培養(yǎng)液，為空白對(duì)照組；3孔加入含100 nmol/L ghrelin的含F(xiàn)BS培養(yǎng)液，為100 nmol/L組；3孔加入含50 nmol/L ghrelin的含F(xiàn)BS培養(yǎng)液，為50 nmol/L組；3孔加入含10 nmol/L ghrelin的含F(xiàn)BS培養(yǎng)液，為10 nmol/L組。放入培養(yǎng)箱3 h后，提取cDNA，進(jìn)行RT-qPCR，檢驗(yàn)4組間mRNA表達(dá)量差異。

1.3.6 Western blotting操作步驟[1, 8]

棄除DMEM，細(xì)胞裂解液加入PMSF置入培養(yǎng)皿后刮取細(xì)胞，按標(biāo)準(zhǔn)步驟提取蛋白后，應(yīng)用BCA蛋白定量分析試劑盒測定蛋白濃度，隨后應(yīng)用4%～20% CriterionTMTris-HCl Protein Gel進(jìn)行電泳，后電轉(zhuǎn)至NC膜，三羥甲基氨基甲烷聚山梨醇酯20緩沖液(tris-buffered saline with Tween-20，TBS-T)配制的5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗(無抗體，或GHS-R1(E-7)1∶1 000，或GHS-R1(E-7) 1∶500)4 ℃過夜，二抗(bovine anti-mouse IgG-HRP，1∶2 000)室溫孵育2 h。以上各步之間應(yīng)用TBS-T洗膜。應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法顯影，Bio-Rad ChemiDoc Touch影像系統(tǒng)曝光、顯影、攝像。

1.3.7 RT-qPCR操作步驟[1, 8]

棄除DMEM，加入TRIzol后刮取細(xì)胞，提取總RNA后，應(yīng)用全功能酶標(biāo)儀Synergy H1測量RNA純度(260/280比值在1.8～2.0之間者采用)及濃度。應(yīng)用Prime Script RT Master Mix(RR036A)合成cDNA。應(yīng)用Power SYBR Green PCR Master Mix配制反應(yīng)液(3倍復(fù)孔)，應(yīng)用Applied Biosystems ViiA 7 system進(jìn)行RT-qPCR，并測量mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 GT1-7細(xì)胞可以表達(dá)GHSR

經(jīng)Western blotting檢測，GT1-7細(xì)胞可表達(dá)GHSR，而HepG2細(xì)胞不表達(dá)GHSR，詳見圖1。

圖1 GT1-7細(xì)胞表達(dá)GHSRFig.1 GT1-7 cells express GHSRGHSR: growth hormone secretagogue receptor.

2.2 血清饑餓對(duì)GT1-7細(xì)胞表達(dá)AgRP mRNA的影響

經(jīng)RT-qPCR多次檢測，GT1-7細(xì)胞無NPY mRNA的表達(dá)，但可表達(dá)AgRPmRNA。血清饑餓可以影響AgRPmRNA的表達(dá)量，含F(xiàn)BS組：1.00±0.14，不含F(xiàn)BS組：3.45±0.16，兩組間AgRPmRNA相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=- 11.649，P=0.000)，詳見圖2。血清饑餓使GT1-7細(xì)胞顯著增加了AgRPmRNA的表達(dá)。

圖2 血清饑餓對(duì)AgRP mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Influence of AgRP mRNA expression on GT1-7 cells by serum starvation

2.3 不同時(shí)間ghrelin刺激對(duì)含F(xiàn)BS培養(yǎng)液的GT1-7細(xì)胞表達(dá)AgRP mRNA的影響

在含F(xiàn)BS(飽食)狀態(tài)下，不同時(shí)間ghrelin刺激對(duì)AgRPmRNA的表達(dá)量不同，空白對(duì)照組：1.00±0.08， 1 h組：1.18±0.43，3 h組：1.75±0.16。3 h組分別與空白對(duì)照組及1 h組AgRPmRNA相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(與空白對(duì)照組比較：LSD-t=5.03，P=0.002，與1 h組比較：LSD-t=3.86，P=0.008)，而1 h組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=1.18，P=0.284)，詳見圖3。即使在含F(xiàn)BS(飽食)狀態(tài)下，ghrelin刺激3 h后可使GT1-7細(xì)胞顯著增加AgRPmRNA的表達(dá)。

2.4 不同濃度ghrelin刺激對(duì)含F(xiàn)BS培養(yǎng)液的GT1-7細(xì)胞表達(dá)AgRP mRNA的影響

在含F(xiàn)BS(飽食)狀態(tài)下， ghrelin刺激3 h后，不同濃度對(duì)AgRPmRNA的表達(dá)量影響不同，空白對(duì)照組：1.00±0.07，10 nmol/L組：1.32±0.11，50 nmol/L組：1.30±0.09，100 nmol/L組：1.66±0.04。應(yīng)用不同濃度ghrelin處理的各組與空白對(duì)照組中AgRPmRNA相對(duì)表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(與10 nmol/L組比較：LSD-t=2.71，P=0.027；與50 nmol/L組比較：LSD-t=2.54，P=0.035；與100 nmol/L組比較：LSD-t=5.57，P=0.001)，高濃度ghrelin組(100 nmol/L)與低濃度ghrelin組(10 nmol/L組及50 nmol/L組)AgRPmRNA相對(duì)表達(dá)量差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(與10 nmol/L組比較：LSD-t=2.86，P=0.021；與50 nmol/L組比較：LSD-t=3.03，P=0.016)，10 nmol/L組及50 nmol/L組之間AgRPmRNA相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t=0.17，P=0.868)，詳見圖4。即使在含F(xiàn)BS(飽食)狀態(tài)下，ghrelin刺激3 h后，AgRPmRNA的表達(dá)量仍顯著增加，但是低濃度ghrelin顯著低于高濃度ghrelin增加的AgRPmRNA表達(dá)量。

圖3 不同時(shí)間100 nmol/L ghrelin刺激對(duì)AgRP mRNA 表達(dá)的影響Fig.3 Influence of AgRP mRNA expression on GT1-7 cells in non-serum-starvation medium by ghrelin (100 nmol/L) stimulation at different time duration

圖4 不同濃度ghrelin刺激3 h對(duì)AgRP mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Influence of AgRP mRNA expression on GT1-7 cells in non-serum-starvation medium by ghrelin stimulation at different concentration

3 討論

Ghrelin是由28個(gè)氨基酸組成的肽類激素，主要由胃底分泌[11]，又稱胃促生長素，可以與GHSR結(jié)合，控制生長激素的釋放，促進(jìn)食欲并維持能量守恒。在人類的進(jìn)化過程中，其最重要的生理功能是保護(hù)機(jī)體避免因饑餓導(dǎo)致低血糖[7, 11-12]。在饑餓和能量不足時(shí)，下丘腦弓狀核(arcuate nucleus，ARC)的神經(jīng)元在ghrelin等激素的刺激下，通過AgRP/NPY、γ-氨基丁酸等作用于室旁核從而促進(jìn)攝食[13]。GHSR主要分布于ARC內(nèi)的促進(jìn)食欲的表達(dá)AgRP/NPY的神經(jīng)元內(nèi)，AgRP/NPY主要產(chǎn)生促進(jìn)進(jìn)食、減少能量消耗的作用，而且AgRP/NPY負(fù)責(zé)了ghrelin絕大部分在攝食和代謝方面的作用[14]。肥胖、糖尿病、高血壓、不孕癥等均與表達(dá)AgRP/NPY的神經(jīng)元的過度活躍有關(guān)[3, 15]。除了機(jī)械性限制食物攝入之外，目前比較公認(rèn)的SG改善代謝的機(jī)制就是通過切除胃底，減少ghrelin分泌，進(jìn)而限制ARC分泌AgRP/NPY，從而減少食欲、增加能量消耗。為了全面了解肥胖癥等代謝疾病以及代謝手術(shù)的作用機(jī)制，充分研究下丘腦神經(jīng)元的細(xì)胞及分子機(jī)制是非常有必要的[16]。但是挑選合適的研究對(duì)象則是一個(gè)困難的選擇。

Ghrelin作用的靶點(diǎn)神經(jīng)元位于下丘腦，臨床研究很難取得人體下丘腦標(biāo)本，故無法進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)雖有進(jìn)行，但要么為間接實(shí)驗(yàn)，要么需相關(guān)專業(yè)設(shè)備或操作極其困難。Kawasaki等[17]對(duì)大鼠行SG，應(yīng)用RT-qPCR測量下丘腦中NPYmRNA表達(dá)量，間接說明下丘腦神經(jīng)元變化；Li等[1]對(duì)NPY-綠色熒光蛋白(neuropeptide Y-green fluorescent protein，NPY-GFP)小鼠行SG，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)直接觀察下丘腦神經(jīng)元變化。以上兩項(xiàng)研究通過測量循環(huán)ghrelin，與其他結(jié)果一起分析，證實(shí)SG術(shù)后ghrelin減少，并影響下丘腦神經(jīng)元活動(dòng)，但均為間接實(shí)驗(yàn)。Laing等[8]處死小鼠后，立即切取下丘腦冰凍切片，應(yīng)用LSCM直接觀察下丘腦神經(jīng)元，給予包括ghrelin在內(nèi)的各種刺激，進(jìn)行電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)為直接實(shí)驗(yàn)，但要求小鼠年齡為6周內(nèi)，故無法研究SG機(jī)制，僅可用來研究ghrelin對(duì)下丘腦神經(jīng)元的影響；而Perez-Tilve等[18]通過側(cè)腦室注射ghrelin，直接觀察ghrelin對(duì)下丘腦神經(jīng)元的影響。以上兩項(xiàng)研究，對(duì)研究者的技術(shù)要求極高，很難達(dá)到普及。

而細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相對(duì)容易操作，近年來各種基因組編輯工具，如常間回文重復(fù)序列叢集(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)技術(shù)，使細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)行更多的研究。有關(guān)ghrelin與神經(jīng)元細(xì)胞之間的機(jī)制研究就可應(yīng)用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)完成。雖然通過神經(jīng)元原代培養(yǎng)可以進(jìn)行研究，但由于下丘腦神經(jīng)元眾多，難以實(shí)際操作。本文采用的下丘腦永生細(xì)胞系GT1-7細(xì)胞，培養(yǎng)簡單，是由小鼠下丘腦分離獲得的，具有高度分化的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞典型特征，目前廣泛應(yīng)用于生殖調(diào)控的研究中[19-20]。筆者首先通過Western blotting證明GT1-7細(xì)胞具有GHSR ，可對(duì)ghrelin產(chǎn)生反應(yīng)。進(jìn)而通過RT-qPCR證實(shí)該細(xì)胞可以表達(dá)AgRPmRNA，故GT1-7細(xì)胞可應(yīng)用于ghrelin對(duì)下丘腦NPY/AgRP神經(jīng)元影響的相關(guān)研究。

筆者發(fā)現(xiàn)，如果去除培養(yǎng)液中的血清，也就是模擬饑餓狀態(tài)下，細(xì)胞就會(huì)增加AgRPmRNA的表達(dá)量，這與其他動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或人體實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[17]，提示機(jī)體在饑餓狀態(tài)下增加AgRP而避免低血糖。另外，筆者發(fā)現(xiàn)，即使在含F(xiàn)BS培養(yǎng)液中，也就是模擬飽食的狀態(tài)下，ghrelin依然可以刺激AgRPmRNA的表達(dá)，但是ghrelin在飽食狀態(tài)下需要3 h的刺激才可以引起AgRPmRNA的表達(dá)升高，為時(shí)間依賴。同時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)隨著ghrelin濃度的升高，AgRPmRNA的表達(dá)量亦隨之升高，也就是說AgRPmRNA的表達(dá)是受ghrelin濃度影響的，ghrelin濃度越高，AgRPmRNA的表達(dá)量越高，反之，如果減少ghrelin的分泌，AgRPmRNA的表達(dá)量也會(huì)減少，進(jìn)而AgRP的促進(jìn)進(jìn)食、減少能量消耗的作用就會(huì)減少，以至于出現(xiàn)食欲下降，能量消耗增加。許多研究觀察到SG術(shù)后患者的血清ghrelin水平下降[4-5, 21]，結(jié)合筆者的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SG切除了患者包括胃底在內(nèi)的80%的胃組織，從而減少了ghrelin的分泌，隨著血清ghrelin濃度的降低，下丘腦表達(dá)AgRP/NPY的神經(jīng)元的活性隨之減弱，分泌的AgRP/NPY減少，最終導(dǎo)致患者食欲下降、能量消耗增加。而食欲下降、能量消耗增加，則可以導(dǎo)致包括體質(zhì)量下降、血糖穩(wěn)定等在內(nèi)的代謝改善。

ARC內(nèi)控制進(jìn)食、調(diào)節(jié)平衡代謝的神經(jīng)元還有很多，如表達(dá)阿片-促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原(proopiomelanocortin，POMC)的神經(jīng)元以及表達(dá)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)的多巴胺能神經(jīng)元。Li等[1]發(fā)現(xiàn)，SG術(shù)后可導(dǎo)致下丘腦弓狀核區(qū)表達(dá)TH的神經(jīng)元數(shù)量減少、表達(dá)POMC的神經(jīng)元數(shù)量增加，所以未來可應(yīng)用GT1-7細(xì)胞進(jìn)行關(guān)于TH及POMC相關(guān)的研究。Ge等[7]發(fā)現(xiàn)由小腸或肝臟分泌的肝表達(dá)抑菌肽2(liver-expressed antimicrobial peptide 2，LEAP2)可以非競爭性拮抗GHSR與ghrelin結(jié)合，從而使機(jī)體減少進(jìn)食。除此之外， LEAP2還具有抑制ghrelin分泌的功能，從而進(jìn)一步減少機(jī)體的食物攝取。正常情況下，LEAP2幾乎不在正常的胃組織內(nèi)分泌，但是SG術(shù)后殘胃中的LEAP2的分泌量卻顯著增加。Li等[1]發(fā)現(xiàn)SG術(shù)后，小鼠肝臟中LEAP2 mRNA的表達(dá)量升高。綜上所述，LEAP2的分泌增加，也有可能是SG產(chǎn)生其相應(yīng)的代謝效應(yīng)的原因之一。在將來的研究中，可以利用GT1-7細(xì)胞進(jìn)一步研究LEAP2，ghrelin與下丘腦調(diào)節(jié)代謝平衡的神經(jīng)元之間的關(guān)系。

Klotho蛋白因其抗衰老的作用最早被學(xué)者認(rèn)識(shí)。Klotho與成纖維生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)23共同作用，并與FGF受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR)形成受體復(fù)合物產(chǎn)生抗衰老作用。隨著對(duì)其研究深入，尤其是α-Klotho亞型，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激和調(diào)控離子通道等多種生物學(xué)功能，目前在腎損害[22]、腎移植[23]、心臟損害[24]、阿爾茨海默病[25]等方面廣泛研究，而筆者所在團(tuán)隊(duì)則將Klotho引入肥胖及2型糖尿病等代謝疾病的研究。通過側(cè)腦室注射α-Klotho發(fā)現(xiàn)α-Klotho通過FGFR增加了POMC神經(jīng)元活性、抑制 NPY/AgRP神經(jīng)元活性，并減少了AgRPmRNA表達(dá)。但側(cè)腦室導(dǎo)管的置入手術(shù)、側(cè)腦室注射、甚至小鼠在置入側(cè)腦室導(dǎo)管后的活動(dòng)均可能造成部分小鼠的死亡，最終導(dǎo)致將α-Klotho的長期效果研究改為短期效果研究[26]。而筆者的另一項(xiàng)研究[27]則通過應(yīng)用GT1-7細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)α-Klotho通過磷酸化蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-related kinases，ERK)下調(diào)了AgRPmRNA的表達(dá)，而FGFR1的抑制劑則可抑制該過程。所以，未來可應(yīng)用GT1-7細(xì)胞系進(jìn)行更多的下丘腦相關(guān)神經(jīng)元通過α-Klotho調(diào)節(jié)代謝的研究，尤其是信號(hào)通路研究。

基于以上研究，本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)血清饑餓使GT1-7細(xì)胞增加AgRPmRNA表達(dá)，ghrelin即使在飽食狀態(tài)下也可以刺激GT1-7細(xì)胞增加AgRPmRNA表達(dá)，并且為時(shí)間及濃度依賴。因此，GT1-7細(xì)胞可作為研究下丘腦神經(jīng)元對(duì)AgRP調(diào)控，以及下丘腦神經(jīng)元對(duì)其他代謝功能的調(diào)節(jié)，尤其是其背后分子機(jī)制研究的體外模型。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明李培鑫：提出研究思路，設(shè)計(jì)研究方案，操作實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，撰寫論文；饒志堅(jiān)：把關(guān)實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性，復(fù)審統(tǒng)計(jì)結(jié)果；黃虎：總體把關(guān)，確保研究方案可行性，審定論文。