人體內(nèi)耳冰凍切片免疫組織化學(xué)染色技術(shù)探討

李 穎 陳 彪 王乃利 郝欣平 *

[1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100730；2.北京市耳鼻咽喉科研究所，耳鼻咽喉頭頸科學(xué)教育部重點實驗室(首都醫(yī)科大學(xué))，鼻病研究北京市重點實驗室，北京 100005；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所教學(xué)中心形態(tài)實驗室，北京 100005]

在對人內(nèi)耳免疫機制的研究中，為盡可能保留組織抗原的完整性，需采用冰凍切片技術(shù)。但由于內(nèi)耳為骨性結(jié)構(gòu)，因此必須經(jīng)過固定和脫鈣處理后，才能進行后續(xù)的切片步驟。由于甲醛固定液中的醛基與蛋白質(zhì)中的氨基發(fā)生廣泛的交聯(lián)，而使抗原決定簇受到不同程度的掩蓋，影響抗體與相應(yīng)抗原決定簇的特異性結(jié)合，采用適當?shù)目乖迯?fù)方法，可有效地破壞醛基交聯(lián)，充分暴露抗原決定簇，提高抗原抗體結(jié)合的敏感性。又由于內(nèi)耳的特殊骨性結(jié)構(gòu)特點，且經(jīng)過抗原修復(fù)等一系列免疫組織化學(xué)步驟，使得其冰凍切片較其他組織切片更容易出現(xiàn)脫片現(xiàn)象。為此，有效的防脫片處理和適當?shù)目乖迯?fù)方法成為獲得最佳內(nèi)耳冰凍切片免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的關(guān)鍵。

1 材料與方法

1.1 材料

1)研究對象：2019年4月至2019年9月期間，收集6例因病去世患者捐獻的尸檢顳骨標本，除了與年齡相關(guān)的變化外，沒有已知的耳科疾病，患者年齡57～90歲，平均年齡76.2歲。

2)主要試劑及儀器：兔多克隆抗WARP抗體(Abcam公司，美國)；鼠單克隆抗Neurofilament 200(NF200)抗體(Sigma公司，美國)；兔多克隆抗IBA1抗體(Invitrogen公司，美國)；鼠單克隆抗CD68抗體(Origene公司，美國)；FITC標記羊抗鼠IgG、羅丹明標記羊抗兔IgG(Abcam公司，美國)；含DAPI熒光封片劑(Abcam公司，美國)。IX81激光共聚焦顯微鏡(Olympus公司，日本)；CM1850冰凍切片機(Leica公司，德國)。

1.2 實驗方法

1)組織處理及冰凍切片：在患者死亡6～23 h后對尸體進行顳骨標本取材，并用中性甲醛溶液進行灌注固定，灌注后繼續(xù)在甲醛溶液中浸泡3 d，固定結(jié)束后取出，自來水流水沖洗24 h。標本入10%(質(zhì)量分數(shù))乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，約1周后，電鉆磨小至只剩耳蝸及半規(guī)管，繼續(xù)脫鈣，并隔天換液，約40 d左右，針刺無阻力感，即脫鈣完成。標本入蔗糖液梯度脫水，最后入OCT膠4 ℃浸膠16～24 h。耳蝸用OCT膠平行于蝸軸方向包埋，液氮速凍，待OCT膠完全凝固取出，冰凍切片機切片，片厚8 μm，-20 ℃冷凍保存。

2)防脫片處理：取出切片，恢復(fù)室溫后，分為3組。Ⅰ組(后固定組)：入預(yù)冷的冷丙酮液中10 min，再入冷甲醇液中10 min進行后固定，取出風(fēng)干15 min。Ⅱ組(烤片組)：放46 ℃烤片箱中，烤片1～2 h。Ⅲ組(后固定+烤片組)：入預(yù)冷的冷丙酮液中10 min后，取出風(fēng)干15 min，再放46 ℃烤片箱中，烤片1～2 h。

3)抗原修復(fù)：將進行了防脫片處理的3組切片，每一組再分為A、B、C 3組(ⅠA、ⅠB、ⅠC、ⅡA、ⅡB、ⅡC、ⅢA、ⅢB、ⅢC共計9組)進行抗原修復(fù)。A組(熱修復(fù)組)：將切片放入已預(yù)熱的PH 8.0 EDTA抗原修復(fù)液中，58 ℃ 5 min。B組(酶消化組)：滴加0.1%(質(zhì)量分數(shù))胰蛋白酶，37 ℃20 min。C組(Triton組)：滴加0.2%(體積分數(shù))Triton X-100，室溫10 min。

4)間接熒光免疫組織化學(xué)染色：將上述9組切片，每一組再分別用4種不同的抗體進行染色。切片入PBS浸洗3遍，入3%(體積分數(shù))H2O2，室溫10 min，PBS洗3遍，用0.2%(質(zhì)量分數(shù))BSA[內(nèi)含0.02%(體積分數(shù))Triton X-100]封閉30 min，分別滴加一抗WARP 1∶30、NF200 1∶400、CD68 工作液、IBA1 1∶500，4 ℃孵育過夜，PBS洗3遍，分別滴加FITC標記羊抗鼠IgG 1∶100，或羅丹明標記羊抗兔IgG 1∶100相應(yīng)熒光二抗，室溫避光孵育1.5 h，PBS洗3遍，含DAPI封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、照相。

1.3 間接熒光免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定

激光共聚焦顯微鏡下觀察4種標記蛋白中，所有未脫落切片在3種抗原修復(fù)方法下的表達情況。同一標記蛋白在掃描參數(shù)相同的情況下，將圖像調(diào)至相對最清晰時進行40倍掃描獲取圖像。結(jié)合圖像的熒光強度及抗體結(jié)合的特異程度，對結(jié)果進行判定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對脫片程度進行統(tǒng)計分析，行χ2檢驗比較組間差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脫片情況比較

防脫片處理的3組間比較，脫片數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Ⅰ組(后固定組)和Ⅱ組(烤片組)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Ⅰ組和Ⅱ組分別與Ⅲ組(后固定聯(lián)合烤片組)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。Ⅲ組的防脫片效果最佳，詳見表1、圖1。

抗原修復(fù)的3組間比較， 脫片數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.05)。B組(酶消化組)除在Ⅲ組防脫片處理方法時只有少數(shù)切片出現(xiàn)局部脫片，在其余兩組防脫片處理方法時則大部分切片出現(xiàn)脫片現(xiàn)象。詳見表2、圖1。

表1 不同防脫片處理方法脫片數(shù)的比較Tab.1 Comparison of the number of slices falling off with different anti-slice escaping treatments

圖1 不同防脫片處理及抗原修復(fù)方法脫片數(shù)的比較Fig.1 Comparison of the number of slices falling off with different anti-slice escaping treatments and antigen retrieval methods

表2 不同抗原修復(fù)方法脫片數(shù)的比較Tab.2 Comparison of the number of slices falling off with different antigen retrieval methods

2.2 不同抗原修復(fù)方法的染色結(jié)果比較

1)WARP染色結(jié)果：A組(熱修復(fù)組)和C組(Triton組)在耳蝸血管及微血管上皮呈特異陽性表達，且A組較C組表達更特異、更清晰。B組(酶消化組)無陽性表達，且細胞核已變形(圖2)。

2)NF200染色結(jié)果：A組(熱修復(fù)組)和C組(Triton組)在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞體及突起均呈陽性表達，且特異、清晰。B組(酶消化組)無陽性表達，且細胞核已變形(圖3)。

3)CD68染色結(jié)果：A組(熱修復(fù)組)和C組(Triton組)在耳蝸呈現(xiàn)細胞體和細胞突起中溶酶體成分的點狀染色，這些細胞的形態(tài)和位置與抗 IBA1 抗體的相似，陽性表達特異、清晰，但由于陽性細胞數(shù)較少，且不能完全染色細胞質(zhì)，故較難判讀。B組(酶消化組)呈極少數(shù)陽性表達，且細胞核已變形(圖4)。

4)IBA1染色結(jié)果：A組(熱修復(fù)組)和C組(Triton組)在耳蝸呈現(xiàn)大量分枝或變形蟲(球體)樣陽性表達，且特異、清晰。B組(酶消化組)無陽性表達，且細胞核已變形(圖5)。

圖2 免疫熒光染色3種不同抗原修復(fù)方法的WARP染色結(jié)果Fig.2 Immunofluorescence staining images of WARP with three different antigen retrieval methods(40×)A： group A (heat repair group) ；B：group B (enzymatic digestion group)；C：group C (Triton group).

圖3 免疫熒光染色3種不同抗原修復(fù)方法的NF200染色結(jié)果Fig.3 Immunofluorescence staining images of NF200 with three different antigen retrieval methods(40×)A： group A (heat repair group) ；B：group B (enzymatic digestion group)；C：group C (Triton group).

圖4 免疫熒光染色3種不同抗原修復(fù)方法的CD68染色結(jié)果Fig.4 Immunofluorescence staining images of CD68 with three different antigen retrieval methods(40×)A： group A (heat repair group) ；B：group B (enzymatic digestion group)；C：group C (Triton group).

圖5 免疫熒光染色3種不同抗原修復(fù)方法的IBA1染色結(jié)果Fig.5 Immunofluorescence staining images of IBA1 with three different antigen retrieval methods(40×)A： group A (heat repair group) ；B：group B (enzymatic digestion group)；C：group C (Triton group).

3 討論

冰凍切片不經(jīng)過乙醇脫水和二甲苯透明等過程，可使許多組織成分不受或少受影響。因此，冰凍切片不但省時簡便，而且特別適合于組織化學(xué)觀察。同時由于冰凍切片術(shù)可以獲取較大的組織切片，所以很適用于對整個顳骨的內(nèi)耳形態(tài)學(xué)研究[1]。由于人顳骨標本較難獲得，所以之前的大部分相關(guān)研究都是基于動物顳骨標本。筆者結(jié)合既往的相關(guān)實驗經(jīng)驗，并結(jié)合人顳骨標本的具體特點，對從標本的取材、固定、脫鈣到切片、染色等過程進行了試驗性研究，并對免疫熒光染色過程中，防脫片處理和抗原修復(fù)方法兩個關(guān)鍵步驟進行了探討。

在免疫熒光染色中，遇到的首要問題就是組織脫片問題。雖然切片時已應(yīng)用黏附載玻片，但染色過程中還是會有較多切片出現(xiàn)脫片現(xiàn)象。怎樣才能減少已切好冰凍切片的脫片現(xiàn)象？筆者分別采取了應(yīng)用冷丙酮及甲醇進行后固定和加熱烤片兩種防脫片處理方法，雖然脫片現(xiàn)象有所改善，但還是不太理想。于是，將兩種方法有機地結(jié)合起來，采用后固定聯(lián)合烤片法，取得了良好的效果，脫片現(xiàn)象明顯減少，并對不同防脫片處理和抗原修復(fù)方法的脫片數(shù)進行統(tǒng)計分析。不同防脫片處理方法間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，Ⅲ組防脫片效果明顯優(yōu)于Ⅰ組和Ⅱ組。不同抗原修復(fù)方法間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明不同抗原修復(fù)方法對脫片情況無明顯影響。

丙酮和甲醇作為有機固定劑，其作用是沉淀蛋白質(zhì)和糖，對組織穿透性很強，保存抗原的免疫活性較好。同時，丙酮和甲醇具有強大的脫水力,常用于冰凍切片及細胞印片和細胞涂片的后固定[2]，可將細胞固定在一定形態(tài)并保持細胞的活性，甲醇還可以增加細胞結(jié)構(gòu)的表面積,提高細胞對染料的吸收，同時由于甲醇吸附染色液中的水,使染色液升溫,加速染色反應(yīng)，所以常用在細胞染色前處理。加熱烤片的作用主要是迅速烤干切片上的水分，防止組織皺縮，以及在染色過程中不易掉片。在石蠟切片中如此，在冰凍切片中亦起到相同作用，只是需要將溫度適當調(diào)低，以減少對抗原的破壞。同時，切片質(zhì)量的好壞也對脫片有至關(guān)重要的影響，切片要平整無皺褶，厚薄均勻才能減少脫片現(xiàn)象的產(chǎn)生。

由于標本已經(jīng)過固定和脫鈣，為更好地暴露抗原決定簇，提高抗原抗體結(jié)合的敏感性，適當?shù)目乖迯?fù)必不可少?？乖迯?fù)技術(shù)的發(fā)明主要歸功于生物化學(xué)家對蛋白質(zhì)與甲醛化學(xué)反應(yīng)的深入研究[3]。因為蛋白質(zhì)分子與甲醛反應(yīng)的復(fù)雜性，故難以找到一種適合所有組織抗原修復(fù)的方法 ，而抗原修復(fù)的主要機制是打開甲醛與蛋白質(zhì)分子形成的交聯(lián)物。Yam-ashita 等[4]將抗原修復(fù)技術(shù)應(yīng)用于甲醛固定的新鮮組織的冰凍切片，獲得了良好的免疫組織化學(xué)染色效果；Hasui等[5]用熱修復(fù)抗原法對成人外周血單核細胞的p53蛋白進行免疫組織化學(xué)染色 ，染色效果亦較好。筆者將免疫組化實驗中常用的3種抗原修復(fù)方法應(yīng)用到本實驗中，并根據(jù)冰凍切片的特點，將熱修復(fù)的修復(fù)溫度調(diào)整為58 ℃，修復(fù)時間為5 min。觀察3種抗原修復(fù)方法的修復(fù)效果。

血管性血友病A結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(von willebrand a domain-related protein, WARP)是一種細胞外基質(zhì)分子，在軟骨中表達受限，是周圍神經(jīng)、肌肉和中樞神經(jīng)系統(tǒng)脈管系統(tǒng)中基底膜的一個子集；在人和小鼠的內(nèi)耳中，WARP免疫反應(yīng)描繪了位于血管紋、螺旋韌帶、基底下區(qū)、間質(zhì)組織以及螺旋和前庭神經(jīng)節(jié)的血管；此外，WARP 能夠描繪內(nèi)耳中的微血管，從而可應(yīng)用于研究耳科疾病發(fā)展中的血管病理學(xué)[6]。在生理情況下，耳蝸的螺旋韌帶、螺旋板、螺旋神經(jīng)節(jié)和血管紋周圍血管存在免疫細胞[7-9]。Shi[10]發(fā)現(xiàn)內(nèi)耳存在血管周圍常駐巨噬細胞，它具有免疫防御、組織修復(fù)及免疫監(jiān)視功能，產(chǎn)生超氧化物陰離子和炎性因子，并清除入侵的病原體和衰老壞死的細胞。內(nèi)耳的巨噬細胞包括駐留巨噬細胞和浸潤巨噬細胞(標記CD163+、IBA1+和CD68+)，其主要分布于耳蝸外側(cè)壁、骨螺旋板、螺旋神經(jīng)元和感覺上皮等部位[9,11-13]。目前認為這些細胞屬于先天性免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[14]。CD68 是溶酶體標志物和小鼠大唾液酸蛋白的人類同源物，是小鼠巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞中的氧化低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotoin-cholosterol, LDL-C)結(jié)合蛋白。 大唾液酸和CD68包含在(溶酶體相關(guān)膜蛋白)糖蛋白家族中， CD68作為膜蛋白是氧化 LDL-C的清道夫或作為抗原呈遞系統(tǒng)的組成部分[12]。IBA1被稱為離子化鈣結(jié)合銜接分子1，據(jù)報道[12]是一種專門針對小膠質(zhì)細胞的特異性鈣結(jié)合蛋白，它是與巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞吞噬作用相關(guān)的膜褶皺的關(guān)鍵參與者。具有不同形狀的巨噬細胞密集存在于成人耳蝸、聽覺神經(jīng)和所有其他耳蝸組織中，在人類耳蝸的所有部分都有大量 IBA1表達細胞[15]。神經(jīng)絲蛋白200(Neurofilament 200, NF200)是相對分子質(zhì)量為200 000的神經(jīng)纖維絲蛋白，在神經(jīng)軸突中高表達，可用以標記神經(jīng)元。NF200主要在神經(jīng)細胞內(nèi)合成、儲存，參與神經(jīng)細胞胞體及軸突的構(gòu)成，在維持神經(jīng)細胞形態(tài)特征、軸漿運輸、神經(jīng)再生等方面起著重要作用[16-18]。將上述分別標記血管、巨噬細胞和神經(jīng)的4種抗原標志物應(yīng)用到本研究中，A組(熱修復(fù)組)和C組(Triton組)均取得較好的抗原修復(fù)效果，陽性結(jié)果特異、清晰。而B組(酶消化組)均修復(fù)效果不佳，且細胞核形態(tài)異常，組織結(jié)構(gòu)受損，易脫片。筆者嘗試將消化時間縮短，結(jié)果亦如此，推斷可能與脫鈣時間較長有關(guān)，據(jù)此，酶消化法不適用于此類實驗中。

綜上所述，本研究在人體內(nèi)耳冰凍切片間接熒光免疫組化染色中，應(yīng)用后固定聯(lián)合烤片法防止染色過程中脫片現(xiàn)象的產(chǎn)生，聯(lián)合應(yīng)用熱修復(fù)法或Triton打孔法進行抗原修復(fù)，取得了良好的染色結(jié)果。但此兩種抗原修復(fù)方法只適用于本研究中的4種抗原標志物，對于一些較難染色的抗原標志物還可應(yīng)用熱修復(fù)聯(lián)合Triton打孔法進行抗原修復(fù)，或?qū)π迯?fù)條件進行適當調(diào)整。應(yīng)用適當?shù)姆烂撈幚砗涂乖迯?fù)方法對提高內(nèi)耳冰凍切片免疫組化染色的敏感性和制片質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用，可為內(nèi)耳研究奠定實驗基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明李穎：提出研究思路，設(shè)計研究方案，實驗過程操作，撰寫論文；陳彪：標本取材；王乃利：標本提供；郝欣平：標本取材，冰凍切片，審定論文。