黃芩苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞THP-1的炎癥反應(yīng)的作用

王 平 楊 軍 王向東 張 羅,3*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100730； 2.北京市耳鼻咽喉科研究所，北京 100005； 3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院慢性鼻病診療策略研究創(chuàng)新單元，北京 100005)

慢性鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)是耳鼻咽喉科一種常見、復(fù)雜且易復(fù)發(fā)的慢性鼻黏膜炎癥性疾病，主要的癥狀有鼻塞、流涕、頭面部疼痛、嗅覺喪失或嗅覺受損等[1]。我國(guó)CRS的患病率約為2%～8%，對(duì)患者和社會(huì)均造成較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。研究[3-4]顯示，CRS的發(fā)病機(jī)制呈高度異質(zhì)性及顯著的地域性差別。目前大多數(shù)關(guān)于CRS的研究集中在以白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子為代表的Th2型免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，和以干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)為代表的Th1型和IL-17為代表的Th17型免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[5]。且有研究[6]顯示，Th2失調(diào)的炎癥環(huán)境下，CRS中的巨噬細(xì)胞功能受影響。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)即內(nèi)毒素，作為革蘭陰性厭氧菌細(xì)胞壁外膜中的脂多糖成分，是一類代表性的免疫應(yīng)激誘導(dǎo)劑，可以誘導(dǎo)不同類型的細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子。而人單核細(xì)胞THP-1是LPS在體內(nèi)的主要效應(yīng)細(xì)胞，LPS通過(guò)刺激人單核細(xì)胞THP-1產(chǎn)生多種炎癥因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等，參與機(jī)體的免疫調(diào)控機(jī)制。

黃芩苷(baicalin)是從植物黃芩(Scutellariabaicalensis)根部分離提取出的一種黃酮類化合物，已有研究[7-13]證實(shí)黃芩苷具有抗病毒、抗細(xì)菌、抗氧化等作用，在多種疾病中有潛在的藥用價(jià)值，如心血管疾病、腫瘤、纖維化和神經(jīng)中樞系統(tǒng)疾病等。本研究旨在觀察黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞THP-1的炎癥反應(yīng)的作用，為將黃芩苷應(yīng)用于炎癥反應(yīng)相關(guān)的疾病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人外周血單核細(xì)胞系THP-1購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心(北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；LPS(EscherichiacoliO11:B4)、細(xì)胞培養(yǎng)用雙抗和Trizol購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；黃芩苷購(gòu)自山東諸城市浩天藥業(yè)有限公司；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自日本Takara公司；SYBR Green熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)試劑購(gòu)自中國(guó)武漢Abclonal公司；引物合成于天津擎科生物技術(shù)有限公司(引物詳細(xì)信息如表1所示)。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

BB15型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、ST-16R、Sorvall Legeng Micro 17R 型低溫高速離心機(jī)、1374生物安全柜均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Nanodrop 2000購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Epoch2型酶標(biāo)儀購(gòu)自BioTek公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Niko公司，ABI 7500熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1細(xì)胞在含有10%(體積分?jǐn)?shù))FBS和1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)[(37 ℃)、5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2]，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，室溫1 000 r/min離心5 min，棄去上清，用1 mL完全培養(yǎng)基吹打均勻，調(diào)整THP-1細(xì)胞濃度至4×106個(gè)/mL均勻接種至12孔板中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，或者繼續(xù)在10 cm培養(yǎng)皿中傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞毒性檢測(cè)

THP-1細(xì)胞以4×106個(gè)/mL的密度均勻接種至12孔板中。分別加入終濃度為0、10、30、100、300、1 000 μmol/L的黃芩苷，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔。置37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h后，陽(yáng)性對(duì)照孔提前1 h加入用PBS稀釋乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)釋放試劑(PBS與LDH釋放試劑體積比為9∶1)。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5 min。分別取上清液120 μL，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定。各孔分別加入60 μL LDH檢測(cè)工作液；混勻，室溫避光置于水平搖床孵育30 min；然后在490 nm處測(cè)定吸光度。使用630 nm波長(zhǎng)作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。細(xì)胞毒性或死亡率%=(處理樣品吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)/(細(xì)胞最大酶活性的吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)×100。每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次 。

1.4 RNA提取

THP-1細(xì)胞經(jīng)過(guò)室溫1 000 r/min離心5 min，加入Trizol后，先置于冰上，室溫放置5 min，使其充分裂解(此時(shí)可以放入-80 ℃長(zhǎng)期保存)；4 ℃，12 000 r/min 離心5 min，棄沉淀；加入0.2倍體積的氯仿，充分混勻后室溫放置10 min；4 ℃，12 000 r/min離心15 min；吸取上層水相至新的EP管中，按0.6倍水相體積加入異丙醇，室溫靜置5 min；4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清，RNA沉于管底；加入1 mL 75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；4 ℃，12 000 r/min離心5 min，盡量棄上清；室溫晾干。

根據(jù)沉淀的量用DEPC處理過(guò)的H2O 溶解RNA樣品，用Nanodrop 2000測(cè)定RNA的濃度和純度(用Trizol提取的RNAA260/A280值在1.9～2.0之間)。

1.5 cDNA反轉(zhuǎn)錄

測(cè)量總RNA的濃度，并統(tǒng)一將濃度調(diào)為200 ng/μL；反轉(zhuǎn)體系：5×反轉(zhuǎn)錄試劑混合物4 μL, 總RNA 10 μL, 無(wú)RNase ddH2O 6 μL，輕柔混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件如下: 37 ℃15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85 ℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))，4 ℃短期保存。

1.6 實(shí)時(shí)熒光qPCR(real-time qPCR ,RT-qPCR)檢測(cè)

在每個(gè)反應(yīng)體系中加入的組分如下：2×SYBR Green Mix 5 μL, 10 μmol/L 引物各0.5 μL, cDNA 1 μL, ddH2O 3 μL，將反應(yīng)體系加入到384孔板中，并平整地貼好封膜，1 500 r/min離心2 min；將384孔板按照儀器的說(shuō)明放入到反應(yīng)托架上，并設(shè)置如下的反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，設(shè)置2～4程序循環(huán)反應(yīng)40次，溶解曲線反應(yīng)程序，冷卻反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)置好樣品順序和檢測(cè)的基因等信息，使用系統(tǒng)軟件分析數(shù)據(jù)，系統(tǒng)程序?qū)⒏鶕?jù)目的基因和內(nèi)參基因的Ct值自動(dòng)計(jì)算出該檢測(cè)基因的基因相對(duì)表達(dá)量；基因相對(duì)表達(dá)量的算法為：基因相對(duì)表達(dá)量值=2-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞THP-1炎癥反應(yīng)模型構(gòu)建

對(duì)照細(xì)胞組和不同濃度的LPS(0.1、0.3、1、3、10 μg/mL)刺激人單核細(xì)胞THP-1后24 h，提取細(xì)胞RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，RT-qPCR法檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-α的相對(duì)表達(dá)。結(jié)果如圖1所示，所有濃度的LPS均可顯著促進(jìn)人單核細(xì)胞THP-1的IL-1β、IL-8和TNF-α的表達(dá)增加，LPS各濃度組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LPS濃度大于0.3 μg/mL時(shí)，可顯著促進(jìn)人單核細(xì)胞THP-1的IL-6的表達(dá)增加，而LPS濃度大于1 μg/mL時(shí)，可顯著促進(jìn)人單核細(xì)胞THP-1的GM-CSF的表達(dá)增加(P<0.05)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇1 μg/mL的LPS為最佳刺激濃度。

2.2 黃芩苷對(duì)人單核細(xì)胞THP-1的毒性影響

對(duì)照細(xì)胞組和使用不同濃度的黃芩苷(10、30、100、300、1 000 μmol/L)分別處理人單核細(xì)胞THP-1 24 h和48 h，取細(xì)胞上清液使用LDH毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)黃芩苷的細(xì)胞毒性，將對(duì)照組(未加黃芩苷)的細(xì)胞毒性定義為1，若相對(duì)細(xì)胞毒性>1，且與對(duì)照比相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，則說(shuō)明此濃度下的黃芩苷對(duì)細(xì)胞有明顯的毒害作用。結(jié)果如圖2所示，10、30、100、300、1 000 μmol/L的黃芩苷在預(yù)處理人單核細(xì)胞THP-1 24 h后，均未對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生明顯的毒性作用，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但300 μmol/L和1 000 μmol/L的黃芩苷處理人單核細(xì)胞THP-1 48 h后，有明顯的細(xì)胞毒性作用，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇使用10、30、100 μmol/L的黃芩苷去驗(yàn)證其抗炎作用。

圖2 對(duì)照組和不同濃度的黃芩苷處理人單核細(xì)胞THP-1 24 h和48 h后的相對(duì)細(xì)胞毒性Fig.2 Relative effect of control and different concentrations of baicalin on the toxicity of human monocytes THP-1 after 24 h and 48 h treatment

2.3 黃芩苷可抑制LPS誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞THP-1的炎癥因子的表達(dá)

為了驗(yàn)證黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞THP-1的炎癥反應(yīng)的影響，單獨(dú)使用不同濃度的黃芩苷(10、30、100 μmol/L)對(duì)細(xì)胞預(yù)處理24 h，此外加入不同濃度的黃芩苷的同時(shí)加入1 μg/mL的LPS共處理細(xì)胞24 h。結(jié)果顯示單獨(dú)加入10、30、100 μmol/L的黃芩苷不會(huì)引起人單核細(xì)胞THP-1的炎癥反應(yīng)，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。黃芩苷可有效抑制LPS誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞THP-1的炎癥反應(yīng)，10 μmol/L的黃芩苷可有效抑制LPS誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞THP-1的IL-8的表達(dá)增加，30 μmol/L 和100 μmol/L的黃芩苷可有效抑制LPS誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞THP-1的IL-1β、IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-α的表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖3。

圖3 對(duì)照細(xì)胞組和不同濃度的黃芩苷單獨(dú)或與1 μg/mL LPS共同處理人單核細(xì)胞THP-1 24 h后IL-1β、IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-α的相對(duì)表達(dá)Fig.3 Relative expression of IL-1β , IL-6 , IL-8 , GM-CSF and TNF-α in the control cells and after 24 h treatment of human monocytes with different concentrations of baicalin alone or together with 1 μg/mL LPS

3 討論

近年來(lái)，黃芩苷因其具有良好的抗炎作用，越來(lái)越廣泛地被應(yīng)用于炎性相關(guān)疾病的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型的治療中。有研究[14-15]顯示黃芩提取物在卵清蛋白(ovalbumin, OVA)誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中，可顯著降低血清中總IgE和OVA特異性IgE濃度，降低Th2細(xì)胞因子IL-1β、IL-4、IL-5和TNF-α的升高濃度等，起到良好的抗炎效果。并且黃芩苷可以在OVA誘導(dǎo)的過(guò)敏性鼻炎小鼠模型中，減少鼻腔灌洗液和鼻黏膜上皮細(xì)胞中多種炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)程度，改善鼻黏膜厚度和黏液分泌狀況[16]。利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)解析以上機(jī)制，發(fā)現(xiàn)黃芩苷可能通過(guò)調(diào)節(jié)OVA誘導(dǎo)的小鼠的代謝紊亂起到抗炎作用[17]。此外，有研究[18-19]還顯示黃芩苷可影響叉頭框蛋白P3(forkhead box protein P3, FOXP3)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)或通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor kappa B, NF-κB)的表達(dá)來(lái)調(diào)控下游細(xì)胞因子的表達(dá)。本研究中黃芩苷的抗炎作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制人單核細(xì)胞THP-1的NF-κB的表達(dá)來(lái)調(diào)控下游IL-1β、IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-α等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，本課題組會(huì)在后續(xù)的研究中對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究中以人單核細(xì)胞THP-1為細(xì)胞模型，LPS誘導(dǎo)導(dǎo)致人單核細(xì)胞THP-1多種細(xì)胞因子釋放增加，如IL-1β、IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-α。使用不同濃度的黃芩苷預(yù)處理，觀察黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞THP-1的炎癥反應(yīng)的影響。本研究中對(duì)黃芩苷使用濃度范圍的選擇根據(jù)其對(duì)細(xì)胞毒性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示300 μmol/L和1 000 μmol/L的黃芩苷處理細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比有顯著的細(xì)胞毒性作用(P<0.05)，所以后續(xù)的功能研究選擇10、30和100 μmol/L的黃芩苷。此外根據(jù)研究結(jié)果顯示，10 μmol/L的黃芩苷除顯著抑制IL-8的表達(dá)外，對(duì)其他細(xì)胞因子表達(dá)的抑制差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此筆者未對(duì)濃度低于10 μmol/L的黃芩苷的抗炎作用進(jìn)行深入的研究。本研究顯示，黃芩苷對(duì)炎癥的抑制效果呈劑量依賴。本研究仍存在一定的局限性，本課題組將在后續(xù)黃芩苷的抗炎機(jī)制研究中增加細(xì)胞因子的蛋白水平變化的檢測(cè)和對(duì)巨噬細(xì)胞功能的研究，并深入解析黃芩苷潛在的抗炎機(jī)制。研究成果為后續(xù)黃芩苷應(yīng)用于炎癥相關(guān)疾病的臨床治療提供良好的理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明王平：提出研究思路，進(jìn)行全部實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和數(shù)據(jù)分析，撰寫論文；楊軍：重復(fù)部分實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；王向東：對(duì)研究思路和數(shù)據(jù)分析進(jìn)行把關(guān)；張羅：總體把關(guān)，審定論文。