模擬高原環(huán)境下實驗動物富氧系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用

崔錦秀，馬倩倩,2，翟明明，張晨旭，劉 娟，李遠(yuǎn)轍，羅二平，湯 池,3

(空軍軍醫(yī)大學(xué)：1軍事生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系軍事醫(yī)學(xué)裝備與計量學(xué)教研室，3陜西省生物電磁檢測與智能感知重點實驗室，陜西 西安 710032；2西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069)

青藏高原平均海拔高度4 500 m以上，隨著青藏鐵路的開通運行，越來越多的人由平原前往高海拔地區(qū)進行科研、商務(wù)和旅行等。由于高海拔地區(qū)大氣壓低于平原地區(qū)，導(dǎo)致氧分壓降低，眾多世居平原人群會因氧分壓降低而受到高原病的困擾，包括頭痛、惡心、疲勞和失眠等，甚至發(fā)生高原肺水腫、高原腦水腫等危及生命的情況[1-3]。

為了降低高原病的發(fā)生率，科研學(xué)者們研發(fā)了便攜式高壓艙和富氧室等眾多設(shè)備[4-6]。這些設(shè)備通過提高局部氧氣濃度進而改變氧分壓，最終使等效生理海拔高度降低。近年來，富氧室的構(gòu)建及應(yīng)用備受學(xué)者關(guān)注?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)已經(jīng)證明了富氧室可有效改善受試者動脈血氧飽和度、脈搏率、血壓等[7]。

雖然富氧供給已經(jīng)在理論上被普遍認(rèn)為是最有效的抗缺氧手段之一，并從睡眠結(jié)構(gòu)、腦體功效等宏觀方面得到了證實[8-9]。但富氧是否可有效改善低壓低氧所引起的心肺和腦組織等的器質(zhì)性損傷，亟需進行動物在體實驗進行驗證。在低壓低氧環(huán)境下進行富氧防護組織器官的效果研究，必要條件之一為構(gòu)建動物實驗用富氧系統(tǒng)?，F(xiàn)有富氧供給多采用分子篩制取高濃度氧或者氧氣瓶供給高純氧，然后與空氣混合稀釋，使氧濃度降低至50%以下后構(gòu)建富氧環(huán)境，這增加了富氧氧氣濃度調(diào)節(jié)與控制的復(fù)雜度[10]。本研究擬基于膜分離技術(shù)，直接從空氣制取約30%濃度的富氧空氣，與獨立通氣籠(individual ventilated cage，IVC)組合構(gòu)建動物實驗用富氧系統(tǒng)，并對其效果進行初步驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

15只7周齡健康雄性SPF級Sprague-Dawley大鼠，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。實驗獲得了空軍軍醫(yī)大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(許可證號：IACUC-20220405)。動物在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)：12 h/12 h明暗交替，溫度調(diào)節(jié)為(22±1)℃，自由攝食、飲水。

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將動物隨機分成正常(normal control，NC)組、低壓低氧(hypobaric hypoxia，HH)組和低壓富氧(hypobaric oxygen-enrichment，HO)組，每組5只。NC組置于當(dāng)?shù)丨h(huán)境下(海拔400 m)不進行任何干預(yù)；HH組置于模擬海拔5 000 m環(huán)境下；HO組同樣置于模擬海拔5 000 m環(huán)境下并進行局部富氧干預(yù)(8 h/d)。實驗進行7 d后，使用過量的20 g/L戊巴比妥鈉麻醉劑對大鼠進行腹腔注射，安樂死后取腦組織。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗富氧系統(tǒng)組建 富氧設(shè)備由直流風(fēng)扇、板式富氧膜元(上海穗杉實業(yè)股份有限公司)、真空泵(成都新為誠科技有限公司)和緩沖氣缸組成。富氧空氣通過氧氣分析儀(Oxymat 61，西門子，德國)對氧濃度進行檢測。在溫度為25 ℃、海拔400 m環(huán)境下，本研究對富氧膜在不同壓力比(壓差)下的氧濃度和富氧空氣流量進行了檢測。此外，富氧設(shè)備進行整機組裝后，置于低壓低氧艙內(nèi)，檢測富氧濃度和流量隨海拔升高變化情況。氧氣流量通過玻璃轉(zhuǎn)子流量計測得。

將富氧設(shè)備與大鼠IVC對接，將富氧空氣通入IVC，從而在低壓低氧艙內(nèi)建立小型富氧室，實現(xiàn)局部富氧，并對不同模擬海拔高度下，富氧籠內(nèi)外海拔高度以及籠內(nèi)富氧濃度進行檢測。富氧系統(tǒng)原理如圖1所示。

圖1 動物實驗富氧系統(tǒng)原理圖

1.2.2 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色 富氧系統(tǒng)組裝調(diào)試結(jié)束后，進行動物實驗以驗證其使用效果，選用HE染色觀察大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化。造模結(jié)束后，大鼠經(jīng)腹腔注射過量麻醉劑，處死后于冰上迅速分離全腦，浸泡于40 mL/L多聚甲醛溶液內(nèi)，完全固定后使用石蠟包埋并切片。將大腦石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水洗。切片置于蘇木精染液染3～5 min后蒸餾水洗，分色后流水沖洗并脫水，然后浸入伊紅染液中染色5 min，脫水后經(jīng)二甲苯透明、封片。染色完成后，在光鏡下觀察各組大鼠海馬區(qū)病理改變。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 富氧膜元特性

富氧濃度和富氧流量與單元膜壓力比的關(guān)系如圖2所示。富氧濃度與壓力比的對數(shù)擬合曲線為y1=3.193 1·ln(x1)+25.234(R12=0.949 3)。富氧流量與壓力比的多項式擬合曲線為y2=-0.116 3x22+1.180 9x2+0.348 6(R22=0.934 5)。即富氧濃度及富氧流量與單元膜壓力比均為非線性關(guān)系。根據(jù)兩曲線擬合結(jié)果，認(rèn)為單元膜壓力比為4時，富氧膜元特性較優(yōu)。

2.2 富氧設(shè)備特性

基于富氧膜元特性，組裝富氧設(shè)備并測試其性能。實驗結(jié)果顯示，隨著低壓低氧艙內(nèi)海拔高度的升高，富氧設(shè)備整機的富氧濃度逐漸降低，因此海拔高度與富氧濃度呈負(fù)相關(guān)性(圖3)，擬合曲線為y3=-0.076 8x32-0.396 8x3+32.017(R32=0.878 1)。富氧設(shè)備的流量與海拔高度也呈負(fù)相關(guān)性(圖3)，擬合曲線為y4=0.017 3x42-0.470 4x4+8.343 3(R42=0.956 3)。

2.3 富氧系統(tǒng)特性

將富氧設(shè)備與IVC對接，構(gòu)建彌散富氧系統(tǒng)并測試其性能。實驗結(jié)果顯示，富氧籠內(nèi)海拔高度與低壓低氧艙內(nèi)海拔高度基本保持一致；隨著海拔升高，籠內(nèi)富氧濃度逐漸降低(圖4)。

2.4 富氧系統(tǒng)應(yīng)用驗證

HE染色結(jié)果顯示，NC組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元形狀規(guī)則，排列整齊；HH組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元深染，排列散亂；而HO組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元深染狀況明顯減少?？梢?，低壓低氧條件下大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元變性數(shù)量增多，而富氧干預(yù)可以有效減輕錐體神經(jīng)元變性(圖5)。

A：NC組；B：HH組；C：HO組。標(biāo)尺為50 μm。黑色箭頭：海馬CA1區(qū)。

3 討論

急進高原人群飽受低壓低氧導(dǎo)致的急性高原反應(yīng)和其他高原病影響，目前最直接有效的防治手段即為吸氧。為了緩解、改善鼻導(dǎo)管或面罩給人鼻腔帶來的不適感，降低鼻導(dǎo)管或面罩對人體動作的限制，研究人員提出彌散富氧新方式[11-12]。并且，現(xiàn)有研究已經(jīng)證明了彌散富氧可有效緩解高原對人機體的影響[13]。但彌散富氧時間、彌散富氧防護機制等有待進一步研究。為了保證彌散富氧動物實驗的順利開展，本研究基于膜分離技術(shù)，構(gòu)建了一套彌散富氧系統(tǒng)，并通過動物實驗驗證了其在模擬高原低壓低氧環(huán)境中的應(yīng)用效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著跨膜壓力的增加，富氧濃度和富氧流量首先呈現(xiàn)線性增加趨勢，隨后逐漸放緩。因此，通過真空泵制造壓差，與膜元聯(lián)用可以用于制取富氧空氣。通過調(diào)節(jié)壓力及膜元的面積，實現(xiàn)制取富氧濃度和富氧流量的較優(yōu)配比。富氧設(shè)備組裝完畢后，通過低壓低氧艙實驗發(fā)現(xiàn)，隨著海拔高度上升富氧濃度和富氧流量均有所降低，這可能與低壓環(huán)境下真空泵的效能受到影響有關(guān)。真空泵性能下降，導(dǎo)致富氧膜元的內(nèi)外壓差產(chǎn)生變化，致使富氧濃度和富氧流量下降。將富氧設(shè)備與IVC進行組合后，在低壓低氧艙內(nèi)分別對艙內(nèi)和籠內(nèi)海拔進行實時監(jiān)測發(fā)現(xiàn)海拔高度基本保持一致，這就為后續(xù)動物實驗排除了壓力這一干擾因素。當(dāng)富氧籠內(nèi)進氣流量大于出氣流量時，會造成籠內(nèi)氣壓升高，使籠內(nèi)模擬海拔高度低于艙內(nèi)。這就無法解釋彌散富氧究竟是提升壓力，還是提升氧濃度起到了防護低壓低氧對機體影響的作用。隨著低壓低氧艙內(nèi)海拔升高，雖然富氧籠內(nèi)模擬海拔與艙內(nèi)基本保持一致，但是籠內(nèi)彌散富氧濃度卻呈下降趨勢，這與富氧設(shè)備性能下降直接相關(guān)。最終，富氧籠內(nèi)氧濃度維持在25%以上，為進行動物彌散富氧干預(yù)實驗提供了硬件支撐。

本研究為了驗證彌散富氧系統(tǒng)的應(yīng)用效果，選取大鼠進行實驗，發(fā)現(xiàn)HO組較HH組大鼠的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元受低壓低氧損傷的區(qū)域和數(shù)量明顯減少。ZHU等[14]研究發(fā)現(xiàn)，雖然5 000 m模擬海拔對大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的影響是微弱的，但是海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元分布散亂、變性、固縮，甚至壞死。本研究的結(jié)果與其課題組研究結(jié)果相一致，即5 000 m模擬海拔使大鼠產(chǎn)生形態(tài)學(xué)損傷，而富氧系統(tǒng)有效防護了這種影響[15]。

綜上所述，本研究構(gòu)建了一套動物實驗彌散富氧系統(tǒng)，可以實現(xiàn)模擬海拔5 000 m以下、富氧濃度≥25%的彌散富氧環(huán)境，初步驗證了富氧防護效果，為后續(xù)彌散富氧防護機制及應(yīng)用方案研究提供了硬件保障。