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    雞腿菇菌種不同保藏方法比較試驗

    2022-11-28 11:50:58陽新春楊財容祁偉亮劉松青
    食用菌 2022年6期
    關鍵詞:石蠟油雞腿菇脫氫酶

    陽新春 楊財容 祁偉亮 陳 佳 劉松青

    (成都師范學院化學與生命科學學院,四川成都 611130)

    雞腿菇Coprinus comatus是一種食藥兩用菌,口感細嫩,風味獨特,具有增強機體免疫力、降血糖血壓、改善心率、抑制腫瘤、防癌及抗癌等功效[1?3]。近幾年來,栽培雞腿菇也是助力鞏固脫貧成果的主要舉措之一,雞腿菇生產(chǎn)發(fā)展較快。菌種是食用菌生產(chǎn)和研究的重要材料,而菌種在繁育過程中極易發(fā)生變異[4?6],科學、高效地保藏好菌種是高產(chǎn)的前提,所以菌種保藏越來越被重視[7?9]。雞腿菇菌種保藏方法眾多,各具優(yōu)缺點,但目前國內(nèi)外學者針對羊肚菌、香菇、草菇、真姬菇等菌種的最適保藏方法做了較多研究,而對于雞腿菇的菌種保藏方法研究相對缺少[10?12]。因此,筆者比較幾種常見的雞腿菇菌種保藏方法的保藏效果,以期找出相對便捷、價廉、高效的雞腿菇菌種保藏方法,為雞腿菇菌種保藏提供數(shù)據(jù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料及試劑

    供試菌株為雞腿菇特大9201,購于京山市成林菌業(yè)店。PDA 培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15~20 g,蒸餾水1 000 mL。主要試劑:液體石蠟油 、NaCl 溶 液 、瓊 脂 、PEG6000、PEG10000、PEG20000、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO),均為分析純。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 菌種活化

    將供試雞腿菇菌株接入PDA 斜面培養(yǎng)基中活化。當菌絲長滿試管后,將其轉(zhuǎn)移到含有PDA 直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中,于25 ℃培養(yǎng),菌落長至培養(yǎng)皿一半后,取部分菌絲作為原始菌種,檢測菌絲生長速度、脫氫酶活性,部分作為初始菌種,供保藏試驗。在無菌環(huán)境下,將菌種分成0.9 cm塊備用。

    1.2.2 保藏試驗

    1.2.2.1 斜面低溫保藏

    PDA 培養(yǎng)基滅菌(121 ℃,30 min)后,裝入試管擺斜面后放入25 ℃培養(yǎng)箱,24 h 檢查無菌后備用。將1.2.1 菌塊接于斜面試管內(nèi),并于25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),重復3 次。培養(yǎng)5 d 后,觀察菌落形態(tài)等基本特征,判斷是否被雜菌污染以及該培養(yǎng)物是否與原菌種一致。檢查確認無誤后,置于4 ℃冰箱中保藏60 d。

    1.2.2.2 液體石蠟油保藏

    液體石蠟油(石蠟油)滅菌(121 ℃,30 min)后取出放在60 ℃干燥箱中烘干水分,直至石蠟油澄清備用。取1.2.1 菌種塊3~4 塊于5 mL 滅菌凍存管(實驗室保存菌種專用)中,再加入3~4 mL 石蠟油后置于室溫保存60 d。重復3次。

    1.2.2.3 水溶液保藏

    水溶液保藏采用無菌水、NaCl 溶液、聚乙二醇溶液保藏。參考朱華玲等[13]保藏方法,設置NaCl 溶液的體積分數(shù)梯度為0.3%,0.6%,0.9%,1.2%;設置體積分數(shù)為0.1%的聚乙二醇溶液的分子量分別為PEG6000,PEG10000,PEG20000。取 1.2.1 菌種 3~4塊于5 mL 滅菌凍存管中,再分別加入3~4 mL 無菌水、NaCl 溶液和聚乙二醇溶液后放入4 ℃冰箱保藏60 d。每個處理重復3次。

    1.3 菌絲保藏效果考察

    1.3.1 菌絲生長速度測定

    斜面低溫保藏與水溶液保藏均需在保藏60 d后取出試管,于25 ℃下復活培養(yǎng)3 d;液體石蠟保藏60 d 后取出試管,轉(zhuǎn)接菌塊于PDA 平皿上培養(yǎng)3 d。之后各自取9 mm 菌塊于PDA 平皿上,培養(yǎng)7 d 后測量菌落直徑,并計算菌絲平均生長速度。

    式中,菌落直徑D1為0.9 cm。

    1.3.2 菌絲脫氫酶活性測定

    脫氫酶活性可以反映微生物對有機物的代謝能力,從而反映菌絲活力。雞腿菇菌絲脫氫酶活性的測定按照熊川等[14]方法,用分光光度計于490 nm波長處測量吸光值OD,二甲基亞砜(DMSO)作空白對照。OD 值越大,則酶活性越高,菌株保藏效果越好。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    用SPSS 25.0軟件對菌絲平均生長速度、脫氫酶活性進行多重比較及差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 三類保藏方法保藏效果

    由表1 和圖1 可知,不同保藏方法保藏后的雞腿菇菌絲的生長速度(平均生長速度,下同)、脫氫酶活性以及菌落形態(tài)有差異。與雞腿菇原始種相比,聚乙二醇溶液保藏的雞腿菇菌種菌絲生長速度加快,其他保藏方法的雞腿菇菌種菌絲生長速度均下降;采用0.6%、0.9%、1.2% NaCl 溶液及斜面保藏的雞腿菇菌種菌絲脫氫酶活性下降,其他保藏方法的脫氫酶活性均上升。

    圖1 試驗保藏方法的保藏效果菌種對比

    表1 各種保藏方法的保藏雞腿菇菌種效果

    考察保藏后的雞腿菇菌種菌絲生長各個指標參數(shù)發(fā)現(xiàn),大部分水溶液保藏的雞腿菇菌種菌絲生長各指標均較好。菌絲生長速度,大多數(shù)的水溶液保藏法>斜面低溫保藏法>石蠟油保藏法;斜面低溫保藏法的菌絲生長速度與無菌水、1.2%NaCl 保藏法無顯著差異,但顯著低于0.1% PEG10000、0.1%PEG20000、0.1% PEG6000、0.9% NaCl 保藏法;而石蠟油保藏法保藏后的菌種菌絲生長速度僅與0.6%NaCl 保藏法無顯著差異,顯著低于其他7 種水溶液保藏法保藏的菌種。

    雞腿菇菌種菌絲脫氫酶活性,大多數(shù)的水溶液保藏法>石蠟油保藏法>斜面低溫保藏法,斜面低溫保藏法的菌絲脫氫酶活性與0.6%NaCl、0.9%NaCl、1.2% NaCl 保藏法無顯著差異,但顯著低于0.1%PEG20000、0.1%PEG10000、無菌水、0.1%PEG6000、0.3% NaCl 水溶液保藏法;石蠟油保藏法僅與0.3%NaCl、0.1% PEG6000 水溶液保藏法無顯著差異,但顯著低于無菌水、0.1% PEG10000、0.1% PEG20000水溶液保藏法。斜面低溫保藏的菌種菌絲生長速度高于石蠟油保藏法,但石蠟油保藏的菌種菌絲脫氫酶活性卻高于斜面低溫保藏法,甚至高于原始種。

    雞腿菇菌種菌絲長勢,大多數(shù)的水溶液保藏法>斜面低溫保藏法>石蠟油保藏法。雞腿菇菌種綜合菌絲生長速度、脫氫酶活性、長勢,三大類保藏方法的保藏效果為大多數(shù)的水溶液保藏法優(yōu)于斜面低溫保藏法,石蠟油保藏法。

    2.2 水溶液保藏法保藏效果

    由圖2 可知,不同水溶液保藏方法對雞腿菇菌種的保藏效果不同。不同水溶液保藏后雞腿菇菌種菌絲生長速度次序:聚乙二醇溶液>0.9%NaCl 溶液>1.2% NaCl 溶液>無菌水>0.3%NaCl 溶液>0.6%NaCl溶液;菌絲脫氫酶活性次序:0.1%PEG20000溶液>0.1%PEG10000 溶液>無菌水>0.1%PEG6000 溶液>NaCl溶液。

    圖2 水溶液處理組對雞腿菇菌種保藏效果對比

    由表1可知,無菌水、NaCl溶液保藏的雞腿菇菌種菌絲生長速度均顯著慢于0.1%PEG10000、0.1%PEG20000 保藏法,但無菌水保藏的菌絲脫氫酶活性則與0.1%PEG10000、0.1%PEG20000 無顯著差異,因此無菌水保藏效果比NaCl溶液組保藏效果要好。

    綜上,聚乙二醇溶液的保藏效果最好,其次是無菌水,NaCl溶液保藏效果最差。

    NaCl 溶液處理組中,保藏效果最好的是0.9%NaCl 溶液;不同分子量的0.1%聚乙二醇溶液處理組,0.1% PEG20000 的保藏效果最好。比較無菌水、0.9% NaCl 溶液、0.1% PEG20000 溶液這三種保藏法的效果可知(圖3):保藏效果依次為0.1%PEG20000,無菌水,0.9%NaCl。

    圖3 不同水溶液中保藏效果最好對比

    2.3 水溶液最優(yōu)保藏法(0.1%PEG20000)與斜面低溫、石蠟油保藏法效果比較

    由圖4可知,0.1%PEG20000保藏的菌種菌絲生長速度、脫氫酶活性均高于原始種;石蠟油保藏的菌種菌絲生長速度與原始種相比明顯慢,但脫氫酶活性高;斜面低溫保藏的菌種菌絲生長速度和脫氫酶活性均較原始種低。由表1可知,0.1%PEG20000保藏的雞腿菇菌種菌絲長勢最旺盛,而石蠟油保藏兩個月之后的菌種接種到培養(yǎng)基后,培養(yǎng)過程中極易長出霉菌且菌絲生長緩慢,這是菌種退化的表現(xiàn)。由此可見,就短期保藏效果,0.1%PEG20000保藏法優(yōu)于斜面低溫保藏法、石蠟油保藏法。

    圖4 水溶液最優(yōu)保藏法(0.1%PEG20000)與其他兩大類保藏效果比較

    3 小結(jié)

    試驗結(jié)果表明,三大類保藏方法中保藏效果最好的是水溶液保藏法,其中保藏效果最佳的是0.1%PEG20000 水溶液,其次是斜面低溫保藏法,保藏效果最差的是石蠟油保藏法。聚乙二醇溶液保藏效果最好,這可能是因為聚乙二醇溶液對菌絲細胞具有保護作用[13]。石蠟油保藏效果差可能因菌絲上攜帶少量石蠟油抑制其生長,不適合短期保藏。

    研究篩選出最適雞腿菇菌種短期保藏的方法,可為雞腿菇菌種提供成本廉價、經(jīng)濟高效、操作簡便的短期保藏方法參考。

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