超聲波協(xié)同半仿生法提取靈芝三萜工藝優(yōu)化

馬婧嘉 李雅茹 張文雋 郝 哲 屈文英 吳亞召 雷 萍*

（1陜西省微生物研究所，陜西西安 710043；2榆林市農(nóng)墾服務中心，陜西榆林 719000；3洛川縣農(nóng)業(yè)機械技術服務中心，陜西延安 727400）

靈芝Ganoderma lucidum，又名神芝、萬年蕈，現(xiàn)指隸屬于真菌界、擔子菌門、傘菌綱、多孔菌目、靈芝科的一類傳統(tǒng)藥用真菌的統(tǒng)稱[1]。現(xiàn)有研究表明靈芝三萜在抗腫瘤[2]、肝臟保護[3]、免疫促進[4]等方面都發(fā)揮著顯著作用，在食品和醫(yī)藥領域有廣泛的應用。

目前，靈芝三萜的提取方法有超臨界CO2提取、亞臨界水提取、超聲輔助提取、溶劑浸提、微波輔助提取法等[5]，這些傳統(tǒng)提取法存在提取效率低、時間長、耗能高等缺點。半仿生提取法（semi?bionicex‐traction，SBE）是以控制論“灰思維方式”為基礎的提取技術，可以提高藥物生物利用度，從生物藥劑學角度建立的一種新型提取技術[6?7]。超聲波輔助提取法廣泛應用于提取天然成分，其原理是利用超聲波產(chǎn)生的空化、振動、粉碎、攪拌等綜合效應，提高提取的效率[8]。目前，未見采用超聲波協(xié)同半仿生法從靈芝中提取三萜類化合物的研究報道。因此，筆者以靈芝為原料，采取超聲波協(xié)同半仿生法結合單因素與正交試驗，探究三萜類化合物提取工藝，以期為靈芝三萜的提取提供一種新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝：靈芝?LG，由陜西省微生物研究所提供；熊果酸，河南標準物質研發(fā)中心；鹽酸、無水乙醇、冰醋酸、氫氧化鈉、香草醛、高氯酸、乙酸乙酯，天津市天力化學試劑有限公司（均為分析純）。

1.2 儀器與設備

酸度計：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；TU?1901 雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；JP?120ST 超聲波清洗儀，深圳市結盟設備有限公司；TD5離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 靈芝粉的制備

新鮮靈芝子實體→洗凈曬干→60 ℃烘箱干燥（至恒重）→粉碎→過40目篩→靈芝粉。

1.3.2 超聲波協(xié)同半仿生法提取靈芝三萜

準確稱取按照1.3.1 制備靈芝粉樣品1 g，采用超聲波協(xié)同半仿生法，固定料液比、乙醇質量分數(shù)、超聲時間、提取溫度4 個因素，在模擬人體胃、腸道環(huán)境pH 值為1、4、7.5、8.3的溶液中依次分別提取靈芝三萜，在 4 000 r/min 條件下離心 10 min，合并 3 次上清液，定容至100 mL，作為待用供試品溶液。

1.3.3 靈芝三萜的測定

采用香草醛?高氯酸比色法測定靈芝三萜[9]。

1.3.4 靈芝三萜提取率的計算

靈芝三萜提取率計算：靈芝三萜提取率（質量比）=C×V/m%

式中：C（mg/mL）表示提取液中靈芝三萜的質量濃度；V（mL）表示提取液定容體積；m（mg）表示所用靈芝干粉質量。

1.3.5 單因素試驗設計

精確稱取1 g靈芝粉5份，按1.3.2的方法進行超聲波協(xié)同半仿生法提取靈芝三萜，分別設固定條件乙醇質量分數(shù)75%，料（g）液（mL）比為1∶25、提取溫度60 ℃，超聲時間20 min，分別設定5水平：料（g）液（mL）比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35；乙醇質量分數(shù)為75%、80%、85%、90%、95%；提取溫度40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃；超聲時間 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，考察不同因素對靈芝三萜的提取率影響。

1.3.6 正交試驗

以上述單因素試驗為基礎，選取表1 中4 因素3水平，采取L9（34）正交試驗對靈芝三萜的提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化。

李林，任校長19年來，他把“引導學生走向幸?！弊鳛閷W校的辦學宗旨，積極探索教育規(guī)律，努力實施“以德立校，依法治校，科研興校，文化強?！钡霓k學策略，著力培養(yǎng)學生適應終身發(fā)展和社會發(fā)展需要的必備品格和關鍵能力。

表1 正交試驗因素水平

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Office 軟件處理數(shù)據(jù)，運用GraphPad Prism 7.00作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對靈芝三萜提取率的影響

由圖1可知，隨著料液比上升，靈芝三萜的提取率逐步提高，料液比為1∶30，靈芝三萜的提取率最高（2.71%）?？赡芗哟笕軇┑牧亢?，增加了固相和液相之間三萜的含量差，加快三萜的溶出速率，從而提取率上升，當料液比達1∶30已充分溶出靈芝三萜，故料液比1∶30提取率最高。

圖1 不同料液比下靈芝三萜提取率

2.1.2 乙醇質量分數(shù)對靈芝三萜提取率的影響

由圖2 可知，乙醇質量分數(shù)為70%、80%、85%時，隨著乙醇質量分數(shù)上升，靈芝三萜提取率逐漸升高，乙醇質量分數(shù)為85%時三萜提取率最高（2.85%），再繼續(xù)提高乙醇質量分數(shù)，三萜的提取率反而降低。原因可能是過高的乙醇質量分數(shù)，導致其他醇溶性物質析出量增加，影響三萜類物質的溶出，因而三萜提取率不升反降。

圖2 不同乙醇質量分數(shù)下靈芝三萜提取率

2.1.3 提取溫度對靈芝三萜提取率的影響

由圖3 可知，靈芝三萜提取率隨著提取溫度的升高逐漸上升，在提取溫度60 ℃時靈芝三萜提取率最高（2.78%），再繼續(xù)升高溫度，提取率反而降低?？赡苓^高提取溫度使三萜發(fā)生了分解，破壞了三萜結構[10]，導致提取率降低。

圖3 不同提取溫度下靈芝三萜提取率

提取靈芝三萜需要一定的時間溶出有效成分并達到傳質平衡。由圖4可知，超聲時間的延長，溶出的三萜增多，超聲時間30 min，三萜的提取率最高（2.82%），隨后三萜的提取率開始降低。這可能是因為溶出的無效成分和雜質增多，影響三萜類物質的溶出，因此超聲時間30 min 為靈芝三萜類物質提取的最佳時長。

圖4 不同超聲時間下靈芝三萜提取率

2.2 超聲波協(xié)同半仿生法提取靈芝三萜的工藝正交優(yōu)化結果

正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 正交試驗結果

表3 方差分析

由表2 和表3 可知，4 個試驗因素對靈芝三萜的提取率均有不同程度的影響，其影響的主次順序為：B（乙醇質量分數(shù)）>D（提取時間）>A（料液比）>C（超聲溫度）。乙醇質量分數(shù)對提取率的影響極為顯著，提取時間對提取率影響顯著，其余兩個因素不顯著。從R值得出的最佳工藝參數(shù)為A2B2C2D2，所對應的條件：料（g）液（mL）比為1∶30，乙醇質量分數(shù)為85%，提取溫度60 ℃，超聲時間30 min。與表2中的較優(yōu)組合A2B2C3D1不一致。因此需要進一步驗證試驗（重復3次后取其平均值），結果見表4。

由表4 可知，超聲波協(xié)同半仿生法提取靈芝三萜的最佳工藝參數(shù)為A2B2C2D2，經(jīng)過3 次驗證試驗，靈芝三萜的平均提取率為2.99%，高于正交試驗中的較優(yōu)組合。

表4 正交試驗驗證結果

3 結論

試驗首次采取超聲波協(xié)同半仿生法提取靈芝三萜，考察了不同料液比、乙醇質量分數(shù)、超聲時間、提取溫度條件下靈芝三萜的提取率。單因素試驗及正交試驗結果表明，提取靈芝三萜的最佳工藝條件為料（g）液（mL）1∶30，乙醇質量分數(shù)85%，提取溫度60 ℃，超聲時間30 min。經(jīng)過三次平行重復試驗，靈芝三萜的提取率為2.99%，試驗為靈芝三萜的提取提供了新的提取方法。