角倍蚜癭內(nèi)干雌蜜露的排泄和糖分組成

邵淑霞,楊子祥,何 釗,陳 航,陸 沁,許 鑫,魏洪媛,陳曉鳴

(中國林業(yè)科學(xué)研究院高原林業(yè)研究所,國家林業(yè)和草原局資源昆蟲培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650224)

角倍蚜Schlechtendaliachinensis是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，隸屬于半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae)五節(jié)根蚜亞科(Fordinae)倍蚜族(Melaphidini)，可在鹽膚木Rhuschinensis葉片上取食形成富含單寧的蟲癭，稱為角倍(張廣學(xué)和陳小琳,1999)。每年4月中旬角倍蚜干母在鹽膚木復(fù)葉葉軸翅或小葉上取食，刺激葉片組織增生膨大，形成蟲癭，干母在封閉的蟲癭內(nèi)繼續(xù)取食，繁殖3代，其中前2代為無翅干雌，第3代為有翅干雌，癭內(nèi)蚜蟲個體數(shù)量可達(dá)數(shù)千頭至上萬頭(Shaoetal.,2013);這些蚜蟲在癭內(nèi)持續(xù)取食和繁殖，至10月中上旬，蟲癭成熟破裂，有翅干雌從裂口處遷飛至側(cè)枝匐燈蘚等蘚類寄主上，在蘚枝上繁殖、取食和越冬。

蚜蟲是刺吸式口器昆蟲，利用口針刺破植物表皮，取食植物韌皮部的汁液。植物韌皮部汁液富含糖，但氮和氨基酸的含量較低，蚜蟲為了獲得足夠的含氮營養(yǎng)物質(zhì)，需要不停地取食植物韌皮部汁液，多余的糖分以蜜露的形式被排出體外。蚜蟲蜜露是一類含有大量簡單和復(fù)雜碳水化合物，以及少量氨基酸、礦物質(zhì)和維生素的混合物(Mittler,1958)。

蜜露富含多種糖類物質(zhì)(Auclair,1963)，具有一定的粘稠性，常覆蓋于植物的葉片與植株表面，影響植物的正常生理作用，并誘發(fā)煙煤病，影響蚜蟲的生境。對于自由生活的蚜蟲，其蜜露通常被螞蟻(Way,1963;Banks and Macaulay,1967;Tilles and Wood,1982;Bristow,1984;Stechmannetal.,1996;Yaoetal.,2000;Fischeretal.,2001)以及一些寄生蜂類(W?ckersetal.,2008;Tenaetal.,2016;Benellietal.,2017;Monticellietal.,2020;Rand and Waters,2020)取食；對于生活在蟲癭內(nèi)的蚜蟲，有些蟲癭有孔道，蚜蟲排泄的蜜露可以通過蟲癭孔道排出癭外(Benton and Foster,1992)。但對于角倍蚜來說，封閉的蟲癭內(nèi)既沒有螞蟻取食蜜露，也沒有孔道供蚜蟲排出蜜露，成千上萬頭蚜蟲不停地在蟲癭內(nèi)取食，蟲癭內(nèi)應(yīng)該會積累大量的蜜露，然而通過對角倍蚜蟲癭的連續(xù)解剖觀察，發(fā)現(xiàn)蟲癭內(nèi)干凈、有序，并未發(fā)現(xiàn)大量堆積的蜜露。角倍蚜癭內(nèi)干雌是否排泄蜜露，如果排泄的話蜜露去了哪里，目前未見相關(guān)報道。本研究從角倍蚜癭內(nèi)干雌蜜露排泄行為觀察以及食物對蚜蟲蜜露排泄的影響兩方面入手，旨在弄清角倍蚜癭內(nèi)干雌各蚜型蜜露排泄的情況，分析影響蜜露排泄的食物因素，為角倍蚜與其第一寄主植物鹽膚木的協(xié)同進(jìn)化研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

角倍蚜初始種群采自中國林業(yè)科學(xué)研究院高原林業(yè)研究所實(shí)驗(yàn)大棚，人工掛袋接種后，干母自然上樹，取其在鹽膚木葉片上取食形成的蟲癭供試。

1.2 試劑與儀器

1.2.1試劑：乙腈(色譜純)(美國TEDIA公司)；去離子水(Millipore Purification System)；果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、半乳糖、鼠李糖、甘露醇、麥芽糖、纖維糖、松三糖、蜜三糖、三聚糖等標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)；葡萄糖[生物工程(上海)有限公司]；木糖(美國Acros公司)；瓊脂糖培養(yǎng)基；淀粉。

1.2.2儀器與設(shè)備：倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS 1X71)；Agilent 1100 LC高效液相色譜儀；Hypersil BDS C18反相不銹鋼柱(dp 5 μm,4.66 mm×250 mm)；5 mL一次性注射器；0.4 μm針式水性過濾頭；超聲波清洗器；TGL-16G高速離心機(jī)。

1.3 癭內(nèi)干雌排泄蜜露的觀察

從鹽膚木上采集健康的角倍蚜蟲癭，劃開一個小口，置于倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS 1X71)的載物臺上，連續(xù)觀察，拍攝記錄癭內(nèi)角倍蚜干雌排泄蜜露的全過程。

1.4 蜜露糖分分析

1.4.1色譜條件：色譜柱為Hypersil BDS C18反相不銹鋼柱(dp 5 μm,4.66 mm×250 mm)；流動相為乙腈-水(75∶25,v/v)；柱溫35℃；檢測溫度：35℃；流速1 mL/min，進(jìn)樣10 μL。

1.4.2糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：用二次蒸餾水配制糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使各自的濃度均為50 mg/mL，備用。

1.4.3蜜露收集：從鹽膚木上采集接近成熟的蟲癭，劃開，取癭內(nèi)干雌，用毛筆輕輕拍打蚜蟲腹部末端促其排泄蜜露，用毛細(xì)管收集蜜露，用于蜜露糖分分析。

1.4.4蜜露處理：將收集到的蚜蟲蜜露，加入30 mL水，水浴超聲波提取10 min，經(jīng)12 000 r/min高速離心后，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，待進(jìn)樣分析。

1.4.5糖分分析：將處理后的蜜露樣品溶液進(jìn)行液相色譜分析，進(jìn)樣量為10 μL，測定樣品中糖分的相對含量，設(shè)3次重復(fù)。

1.5 蔗糖和淀粉濃度對角倍蚜蜜露排泄的影響測定

利用瓊脂糖培養(yǎng)基、蔗糖、淀粉，分別配制蔗糖濃度為0,1%,2%,3%,5%和7.5%的培養(yǎng)基，以及淀粉濃度為0,2%,3%,5%,7.5%和10%的培養(yǎng)基，備用。

采集健康的蟲癭，劃開，挑選健康、體型完好的無翅干雌及有翅干雌若蚜，轉(zhuǎn)移到不同濃度蔗糖或淀粉培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，200頭/皿，置于24℃的黑暗的環(huán)境中保育4 d后，觀察記錄蚜蟲存活數(shù)和蜜露數(shù)量，計算蚜蟲的泌露率。每個處理5個重復(fù)。

泌露率=(蜜露數(shù)/蚜蟲總數(shù))×100%。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別采用SPSS 11.5和Excel 2016進(jìn)行分析和制圖，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和S-N-K(Student-Newman-Keuls Test)法進(jìn)行差異顯著性分析；利用標(biāo)準(zhǔn)品滯留時間對蜜露糖分進(jìn)行定性分析，采用峰面積歸一化法對蜜露糖分進(jìn)行相對定量和比較。

2 結(jié)果

2.1 角倍蚜癭內(nèi)干雌的蜜露排泄行為

在角倍的整個生長期，通過對角倍內(nèi)蜜露排泄情況的連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)角倍內(nèi)蚜型為無翅干雌時，角倍內(nèi)干凈、整潔，幾乎未見蜜露分布，也很少能觀察到無翅干雌排泄蜜露的情況(圖1)；當(dāng)角倍內(nèi)蚜型以有翅干雌為主時，角倍內(nèi)可見被蠟粉包裹的蜜露，35.40%±2.41%的有翅干雌可被觀測到排泄蜜露(圖1和2)。

圖1 角倍蚜癭內(nèi)干雌排泄蜜露的比較Fig.1 Comparison of honeydew excretion of Schlechtendalia chinensis fundatrigeniae living in gallnutsG1,G2:癭內(nèi)無翅干雌Apterous fundatrigeniae in gallnuts;G3:癭內(nèi)有翅干雌Alate fundatrigeniae in gallnuts.

圖2 角倍蚜有翅干雌在角倍內(nèi)排泄蜜露Fig.2 Honeydews excreted by alate fundatrigeniae of Schlechtendalia chinensis in gallnuts紅色箭頭指示有翅干雌排泄的蜜露。Red arrows indicate the honeydew excreted by alate fundatrigeniae.

角倍蚜排泄蜜露時，首先在肛門處形成球狀液珠，當(dāng)球狀液珠即將排出肛門時，蚜蟲身體則向上傾斜，頭和胸部幾乎不動，腹部則上下來回運(yùn)動，同時，兩只后足也會有節(jié)奏地做上下垂直運(yùn)動，當(dāng)后足位于腹部末端時，角倍蚜便會利用其后足脛節(jié)端部將球狀液珠踢掉。由于角倍內(nèi)含有大量的蠟粉，因此，蚜蟲排泄的蜜露常被有一層蠟粉，蚜蟲有時可在有蠟粉包被的蜜露表面行走。角倍蚜排泄的蜜露，可在癭內(nèi)聚集成團(tuán)，形成直徑可達(dá)0.3～0.6 cm的大液珠，但數(shù)量較少。此外，少部分蜜露在癭內(nèi)還可變?yōu)楹稚囊褐椤?/p>

2.2 角倍蚜癭內(nèi)干雌蜜露糖分

角倍內(nèi)蜜露樣品層析譜被分成了7個點(diǎn)，其保留時間分別為8.53,9.73,11.78,13.23,13.86,15.34和16.07 min，與標(biāo)準(zhǔn)糖層析譜比較，確定該蜜露含有7種糖，分別為果糖、葡萄糖、蔗糖和4種未知組分(圖3和表1)。蜜露所含的7種糖分中，果糖和葡萄糖的含量占絕對優(yōu)勢，分別為51.07%和31.68%;蔗糖的含量較低，僅為1.59%;4種未知組分的總含量為15.66%(表1)。

圖3 角倍蚜癭內(nèi)干雌蜜露糖分HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of sugars in the honeydew excreted by Schlechtendalia chinensis fundatrigeniae living in gallnuts1:果糖Fructose;2:葡萄糖Glucose;4:蔗糖Sucrose;3,5,6,7:未知組分Unknown components.

2.3 蔗糖和淀粉濃度對角倍蚜癭內(nèi)干雌蜜露排泄的影響

2.3.1對無翅干雌蜜露排泄的影響：將無翅干雌置于不含蔗糖的瓊脂糖培養(yǎng)基上，可以明顯看到蚜蟲排泄蜜露(圖4)，泌露率為23.89%±5.58%，顯著高于其他5種蔗糖濃度的培養(yǎng)基上的(P<0.05)；當(dāng)在瓊脂糖培養(yǎng)基中添加蔗糖時，蚜蟲蜜露排泄量顯著降低(P<0.05)，且隨蔗糖濃度的增加，蜜露排泄量減少，當(dāng)蔗糖濃度增至5%時，蜜露排泄量稍有增加，泌露率為1.66%±1.32%，而后隨蔗糖濃度的增加，泌露率又降低，當(dāng)蔗糖濃度增至7.5%時，泌露率僅為1.36%±0.69%(圖5:A)。

表1 角倍蚜癭內(nèi)干雌蜜露糖分的相對含量Table 1 Relative contents of sugars in the honeydew excreted by Schlechtendalia chinensis fundatrigeniae living in gallnuts

圖4 角倍蚜無翅干雌在瓊脂糖培養(yǎng)基上排泄蜜露Fig.4 Honeydews excreted by apterous fundatrigeniae of Schlechtendalia chinensis on agarose media紅色箭頭指示無翅干雌在瓊脂糖培養(yǎng)基上排泄的蜜露。Red arrows indicate the honeydew excreted by apterous fundatrigeniae on agarose media.

由圖5(B)可見，淀粉對無翅干雌蜜露排泄的影響與蔗糖類似，隨著淀粉濃度的提高，蜜露排泄量逐漸降低，但降低幅度不如添加蔗糖時明顯。在培養(yǎng)基中添加2%的淀粉時，無翅干雌的蜜露排泄量稍有降低，但仍高達(dá)17.31%±9.60%；當(dāng)?shù)矸蹪舛雀哌_(dá)10%時，無翅干雌泌露率僅為5.60%±2.20%。

2.3.2對有翅干雌蜜露排泄的影響：把有翅干雌飼喂在淀粉和蔗糖含量為零的瓊脂糖培養(yǎng)基上時，有翅干雌蜜露排泄量很高，泌露率高達(dá)173.96%±28.61%；當(dāng)在瓊脂糖培養(yǎng)基中添加1%的蔗糖時，有翅干雌蜜露排泄量顯著降低(P<0.05)，泌露率降至21.15 %±10.32%；而后隨著蔗糖濃度的升高，有翅干雌蜜露排泄量均有不同程度的降低，但各濃度間的差異并不顯著(P>0.05)；當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到5%時，有翅干雌泌露率稍有增加，泌露率為7.31%±7.81%；當(dāng)蔗糖濃度升至7.5%時，有翅干雌幾乎不排泄蜜露，泌露率僅為0.79%±0.60%(圖6:A)。

由圖6(B)可見，當(dāng)在培養(yǎng)基中添加2%的淀粉時，有翅干雌蜜露排泄量顯著升高(P<0.05)，泌露率由173.96%±28.61%升高至236.81%±55.67%，而后隨著淀粉濃度的升高，有翅干雌蜜露排泄量逐漸降低，但降低幅度不大，各濃度間的差異并不顯著(P>0.05)；當(dāng)?shù)矸蹪舛雀哌_(dá)7.5%時，有翅干雌的蜜露排泄量顯著減少(P<0.05)，當(dāng)?shù)矸蹪舛冗_(dá)到10%時，泌露率降為55.92%±7.22%。

圖5 蔗糖(A)和淀粉(B)濃度對角倍蚜無翅干雌蜜露排泄的影響Fig.5 Effects of sucrose (A) and starch (B) concentrations on the honeydew excretion of apterous fundatrigeniae of Schlechtendalia chinensis圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05,單因素方差分析和S-N-K法)；圖6同。Data in the figure are mean±SD.Different letters above bars indicate significant difference at the 0.05 level by one-way ANOVA and S-N-K.The same for Fig.6.

圖6 蔗糖(A)和淀粉(B)濃度對角倍蚜有翅干雌蜜露排泄的影響Fig.6 Effects of sucrose (A) and starch (B) concentrations on the honeydew excretion of alate fundatrigeniae of Schlechtendalia chinensis

2.4 蔗糖和淀粉濃度對角倍蚜癭內(nèi)干雌死亡率的影響

在培養(yǎng)基中添加不同濃度蔗糖或淀粉飼喂癭內(nèi)干雌時，并不會造成干雌的大量死亡。其中，無翅干雌在未添加蔗糖和淀粉的培養(yǎng)基上的死亡率均為3.64%±1.34%，當(dāng)添加不同濃度的蔗糖時，死亡率最高為5.06%±0.42%(蔗糖濃度為1%時)，最低為2.70%±0.67%(蔗糖濃度為2%時)，且各蔗糖濃度間無翅干雌死亡率的差異并不顯著(P>0.05)(表2)；當(dāng)在培養(yǎng)基中添加不同濃度的淀粉時，無翅干雌死亡率的變化幅度較小[(2.99%±0.69%)～(3.98%±1.06%)]，各濃度間差異亦不顯著(P>0.05)(表2)。

有翅干雌在不同蔗糖濃度的瓊脂糖培養(yǎng)基上生存均較好，幾乎無死亡，僅是在蔗糖濃度為2%的瓊脂糖培養(yǎng)基上稍有死亡，但死亡率很低，僅為0.45%±0.52%(表2)。淀粉濃度對有翅干雌死亡率的影響也很低，僅在淀粉含量為3%和10%時，有翅干雌稍有死亡，死亡率分別為0.17%±0.03%和0.23%±0.05%，其余處理有翅干雌均無死亡(表2)。

表2 蔗糖和淀粉濃度對角倍蚜癭內(nèi)干雌死亡率(%)的影響Table 2 Effects of sucrose and starch concentrations on the mortality (%) of fundatrigeniae of Schlechtendalia chinensis living in gallnuts

3 討論

蟲癭是致癭昆蟲與寄主植物在長期協(xié)同進(jìn)化過程中形成的產(chǎn)物，其形成機(jī)制、結(jié)構(gòu)和功能一直是昆蟲學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。蟲癭內(nèi)排泄物和廢棄物的清潔對于維持種群的生存至關(guān)重要。半封閉的蟲癭通常在蟲癭上形成孔道，癭內(nèi)昆蟲可以將蜜露等廢棄物通過孔道排出癭外。例如，一種堅角蚜Ceratoglyphinastyracicola，可以在栓葉安息香葉片形成上部有孔的半封閉蟲癭，另有一種綿蚜Hormaphiscornu可以在金縷梅葉片上形成下部有孔的蟲癭(Korgaonkaretal.,2021)；癭內(nèi)蚜蟲的排泄物和廢棄物可以通過孔道排除癭外(Kurosu and Aoki,1991)。角倍蚜蟲癭是完全封閉型蟲癭，癭內(nèi)成千上萬的蚜蟲，其排泄物蜜露、廢棄物蛻和蠟粉等是如何處理，以保持癭內(nèi)的干凈和有序的呢？

自然界中，大多數(shù)蚜蟲排泄的蜜露中含有高濃度的松三糖(Kiss,1981;V?lkletal.,1999；Fischeretal.,2002)，這種三糖是由2個單位的葡萄糖和1個單位的果糖在蚜蟲的腸道中合成的(Bacon and Dickinson 1957;Ashfordetal.,2000)。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，角倍蚜癭內(nèi)干雌蜜露的主要成分為果糖和葡萄糖，含量分別為51.07%和31.68%，蔗糖的含量很低，僅為1.59%(圖3)。果糖和葡萄糖為單糖，分子量小，可以直接被植物吸收和利用。陸沁等(2018)的研究結(jié)果表明，角倍蚜蟲癭內(nèi)壁分布有大量的縫隙和孔，這些縫隙和孔有可能吸收了以單糖為主的癭內(nèi)干雌排泄的蜜露；Chen等(2020)的研究也表明，癭內(nèi)干雌排泄的蜜露有可能被蟲癭內(nèi)壁吸收和再利用，角倍蚜蟲癭類似于“代謝和營養(yǎng)交換中心”(metabolic and nutrient exchange hub)，不僅可以實(shí)現(xiàn)角倍蚜與寄主植物的營養(yǎng)交換，又避免了蜜露對癭內(nèi)環(huán)境造成的污染；同時，干雌分泌的蠟粉，通過干雌的活動和蟲癭的搖動，將蜜露和蛻等聚集成團(tuán)，保持了癭內(nèi)的清潔(魏洪媛等,2021)。

角倍蚜癭內(nèi)無翅干雌和有翅干雌均以角倍內(nèi)壁的汁液為生，然而無翅干雌幾乎不易被觀測到排泄蜜露(圖1)，35.40%±2.41%的有翅干雌可被觀測到排泄蜜露。蚜蟲蜜露的組成以及泌露量受多種因素的影響，包括寄主植物、大氣中CO2濃度(Sunetal.,2009;Fu etal.,2010;Boullisetal.,2018)、蚜蟲種類(V?lkletal.,1999)、蚜蟲基因型(Vantauxetal.,2011;Katayamaetal.,2013)、蟲齡(Fischeretal.,2002)以及蚜蟲內(nèi)共生菌(Schillewaertetal.,2017)等。其中寄主植物是最主要的影響因素，寄主植物韌皮部汁液組分的變化會對蜜露的成分以及數(shù)量產(chǎn)生影響(Fischeretal.,2005;Leroyetal.,2011;Pringleetal.,2014)。Schillewaert等(2017)發(fā)現(xiàn)，以甜菜、罌粟、蠶豆飼喂同一種蚜蟲，取食蠶豆的蚜蟲蜜露中總碳水化合物的濃度最高。本研究采用瓊脂糖培養(yǎng)基來分別飼喂角倍蚜無翅干雌和有翅干雌，通過在瓊脂糖培養(yǎng)基中添加不同濃度蔗糖或淀粉來驗(yàn)證食物對蚜蟲蜜露排泄的影響。角倍蚜無翅干雌和有翅干雌在試驗(yàn)所用幾種處理培養(yǎng)基上死亡率非常低，保證了實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。研究發(fā)現(xiàn)，在瓊脂糖培養(yǎng)基上可以輕易地觀察到無翅干雌排泄蜜露的行為，而此行為在角倍內(nèi)很難觀測到；此外，在瓊脂糖培養(yǎng)基中添加不同濃度蔗糖或淀粉時，無翅干雌和有翅干雌的蜜露排泄量均受很大程度的影響。本研究結(jié)果說明角倍蚜的蜜露排泄量與其攝取食物的種類有關(guān)。

在角倍的整個生長發(fā)育過程中，癭內(nèi)蚜蟲的數(shù)量由1頭增加至上萬頭，這些蚜蟲在角倍內(nèi)不停的取食，勢必會排泄大量的廢棄物。在與寄主植物長期的協(xié)同進(jìn)化歷程中，癭內(nèi)角倍蚜是如何處理這些排泄物，從而防止污染其所生活的密閉生境的？這是一個值得深入研究的問題。本研究僅是從蜜露成分及食物因素兩方面對蜜露去向問題進(jìn)行了初步推測，為了弄清角倍蚜處理蜜露的方式，還需要進(jìn)行大量生態(tài)學(xué)和生理學(xué)方面的工作。