入侵害蟲(chóng)甘薯凹脛跳甲的鑒定及線粒體基因組分析

馬婷婷,林 菲,趙 楠,阮用穎,謝淑燕,鄒宏達(dá),陳景益,房伯平,黃立飛,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,廣州 510640;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510640;3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,廣州 510225;4:深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東深圳 518055)

甘薯凹脛跳甲Chaetocnemaconfinis屬鞘翅目(Coleoptera)葉甲科(Chrysomelidae)跳甲亞科(Alticinae)凹脛跳甲屬Chaetocnema(Biondi,2001;Ruanetal.,2019)，起源于美國(guó)和加拿大，在熱帶地區(qū)營(yíng)孤雌生殖，其體形小，善于跳躍和飛翔，傳播速度快(Abney and Kennedy,2011)。據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)與生物科學(xué)中心(Center for Agricultural and Bioscience International,CABI)統(tǒng)計(jì)，目前已擴(kuò)散至亞洲(印度、日本、越南和泰國(guó))，非洲(科摩羅、岡比亞、加納、馬達(dá)加斯加、馬拉維、毛里求斯、留尼旺島、塞內(nèi)加爾、塞舌爾和南非)，美洲(尼加拉瓜、巴西和加拉帕戈斯群島)，大洋洲(法屬波利尼西亞、關(guān)島、馬紹爾群島和帕勞)等國(guó)家和地區(qū)。據(jù)Ruan等(2019)報(bào)道在中國(guó)江蘇和臺(tái)灣也存在其分布，但在中國(guó)其他地方未見(jiàn)該蟲(chóng)為害甘薯相關(guān)報(bào)道。甘薯凹脛跳甲作為世界上重要的甘薯害蟲(chóng)之一，其成蟲(chóng)取食甘薯地上葉片，嚴(yán)重可導(dǎo)致葉片穿孔、殘缺、落葉、萎蔫或植株死亡；幼蟲(chóng)為害甘薯地下根部，影響薯塊的美觀和商品性(Cuthbert and Rei,1965)。

目前，分子生物學(xué)技術(shù)和形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合的方法常用于未知物種的精準(zhǔn)鑒定(肖金花等,2004)，其中最常用的分子鑒定方法是DNA條形碼技術(shù)，即利用一段標(biāo)準(zhǔn)基因的序列做標(biāo)記(Tautzetal.,2002)。線粒體基因組中的cox1(或COI)基因，因含有較多的系統(tǒng)發(fā)育信息，常作為物種快速鑒定的通用標(biāo)記(Hebertetal.,2003;Cameronetal.,2006;張蒙等,2021)。例如，劉翠霞等(2013)利用COI基因?qū)⑹枥蘸由嫌渭扒嗪?、湖?0個(gè)常見(jiàn)鞘翅目幼蟲(chóng)有效鑒定為5科9屬；Hebert 等(2016)使用cox1基因作為DNA條形碼對(duì)當(dāng)?shù)匚锓N進(jìn)行了多樣性研究。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，第二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物線粒體基因組(mtDNA)研究(Mardis,2008;Wangetal.,2021)。昆蟲(chóng)的線粒體基因組是典型的環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)，通常編碼37個(gè)基因，包括13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因(protein-coding genes,PCGs)、22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)基因以及2個(gè)核糖體RNA(rRNA)基因rrnL和rrnS。此外還存在一段較長(zhǎng)的非編碼區(qū)，又稱控制區(qū)(control region,CR)，該區(qū)因腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)核苷酸序列含量很高，因此也稱A+T富含區(qū)(A+T-rich region)(Shadel and Clayton,1993)。在昆蟲(chóng)的線粒體中，把多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄的一條鏈被稱為主要編碼鏈即J鏈，另一條則稱為次要編碼鏈即N鏈(Simonetal.,1994)。由于昆蟲(chóng)的線粒體基因組包含了從分子序列到基因結(jié)構(gòu)的全面信息，因此被廣泛應(yīng)用于不同昆蟲(chóng)類型起源、分子進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育、群體遺傳學(xué)、比較和進(jìn)化基因組學(xué)等相關(guān)研究(Gissietal.,2008;Jeongetal.,2021)。

甘薯凹脛跳甲作為甘薯的重要入侵害蟲(chóng)，國(guó)外對(duì)甘薯凹脛跳甲的研究主要集中在危害癥狀、發(fā)生特點(diǎn)以及防治技術(shù)等方面(Hayashikawaetal.,2013,2015;Hayashikawa and Fukuda,2016)，我國(guó)大陸至今尚無(wú)為害甘薯的相關(guān)研究報(bào)道。本研究于2018年初在廣東省廣州、湛江、云浮、河源和肇慶等地甘薯產(chǎn)區(qū)都發(fā)現(xiàn)了疑似甘薯凹脛跳甲的危害癥狀，通過(guò)對(duì)害蟲(chóng)形態(tài)特征觀察以及基于COX1基因的DNA條形碼技術(shù)確認(rèn)甘薯凹脛跳甲已入侵中國(guó)大陸，隨后對(duì)甘薯凹脛跳甲線粒體全基因組進(jìn)行測(cè)序，分析其基因組組成及排列順序，豐富了葉甲科線粒體基因組數(shù)據(jù)，為凹脛跳甲屬昆蟲(chóng)的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)和試劑

供試蟲(chóng)源：昆蟲(chóng)標(biāo)本于2021年采集于廣東省廣州市、肇慶市、云浮市、河源市等，采集蟲(chóng)態(tài)均為成蟲(chóng)，標(biāo)本采集后活體帶回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定；部分標(biāo)本置于無(wú)水酒精中浸泡保存，放置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：2×Taq PCR MasterMix，南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；AL2000 DNA Marker (2 000 bp)，南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司；通用型動(dòng)物總DNA抽提試劑盒，南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.2 甘薯凹脛跳甲種類鑒定

結(jié)合國(guó)內(nèi)外甘薯凹脛跳甲以及鞘翅目凹脛跳甲屬的相關(guān)文獻(xiàn)，利用顯微鏡觀察甘薯凹脛跳甲成蟲(chóng)標(biāo)本共約50頭的形態(tài)特征，以鑒別確定種類并且實(shí)地觀察甘薯跳甲的危害癥狀，調(diào)查甘薯跳甲在不同地區(qū)不同寄主的危害。

對(duì)中國(guó)大陸甘薯凹脛跳甲的cox1基因DNA進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的甘薯凹脛跳甲cox1 DNA序列進(jìn)行BLAST比較，確定親緣關(guān)系最近的種屬，下載其序列進(jìn)行相關(guān)分析。具體方法如下：甘薯凹脛跳甲利用通用型動(dòng)物總DNA抽提試劑盒提取甘薯凹脛跳甲成蟲(chóng)基因組DNA。使用正向引物L(fēng)CO1490和反向引物HCO2198(Folmeretal.,1994;Armstrong and Ball,2005)對(duì)線粒體cox1基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系:2×Taq PCR MasterMix 10 μL,正反向引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA模板1 μL,最后補(bǔ)足ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s,54℃ 30 s,72℃ 1 min，循環(huán)30次;72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化和測(cè)序。

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載凹脛跳甲屬甘薯凹脛跳甲C.confinis、麥凹脛跳甲C.hortensis、C.arida、C.pelagica、C.obesa、C.paganettii和扁緣凹脛跳甲C.depressa7個(gè)物種以及跳甲亞科黃曲條跳甲Phyllotretastriolata的cox1基因DNA序列，使用ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)(Kumaretal.,2018)，截取序列長(zhǎng)度為462 bp，以黃曲條跳甲cox1基因DNA序列為外群，用MEGA7.0軟件基于鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)發(fā)育樹(shù)，自展檢驗(yàn)1 000次。

1.3 線粒體基因組分析

提取甘薯凹脛跳甲基因組總DNA，并送至南京集思慧有限公司構(gòu)建小片段文庫(kù)和高通量測(cè)序。采用Illumina Novaseq平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序(paired-end,PE)，測(cè)序長(zhǎng)度為150 bp。后使用fastp(version 0.20.0,https:∥github.com/OpenGene/fastp)軟件對(duì)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量剪切、過(guò)濾，截除reads中的測(cè)序接頭以及引物序列，過(guò)濾掉測(cè)序質(zhì)量較低的讀長(zhǎng)(平均質(zhì)量值小于Q5)，并去除N含量大于5的reads，獲得clean data數(shù)據(jù)集(Pearson,1990;Chenetal.,2018)。

對(duì)clean data數(shù)據(jù)集使用SPAdes v3.10.1(http:∥cab.spbu.ru/software/spades/)軟件組裝mtDNA序列得到線粒體基因組的SEED序列(Bankevichetal.,2012)。在組裝過(guò)程中利用迭代的方法獲得contig序列。使用SSPACE v2.0(https:∥www.baseclear.com/servicesht/ bioinformatics/-basetools/sspace-standard/)軟件(Boetzeretal.,2011)，將得到的contig序列進(jìn)行連接得到scaffolds；使用Gapfiller v2.1.1(https:∥sourceforge.net/projects/gapfiller/)軟件(Nadalinetal.,2012)，對(duì)得到的scaffold序列進(jìn)行補(bǔ)GAP；將測(cè)序序列比對(duì)到pseudo genome，進(jìn)行基因組校正；根據(jù)線粒體的結(jié)構(gòu)，將校正后pseudo genome，進(jìn)行坐標(biāo)重排，得到完整的線粒體環(huán)狀基因組序列。利用線粒體在線注釋工具M(jìn)itos2 (http:∥mitos2.bioinf.uni-leipzig.de)對(duì)組裝好的序列進(jìn)行注釋(Donathetal.,2019)。

1.4 甘薯凹脛跳甲與近緣物種的比較分析

運(yùn)用Mauve軟件(默認(rèn)參數(shù))對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表凹脛跳甲屬的1個(gè)種C.pelagica以及跳甲亞科的2個(gè)物種黃曲條跳甲P.chlorophane和M.subplicata的線粒體全基因組進(jìn)行共線性分析，判斷甘薯凹脛跳甲線粒體基因排列及變異情況。

為了研究甘薯凹脛跳甲與近緣種的親緣關(guān)系，選擇與葉甲科親緣關(guān)系最近的葉甲總科天?？评跎教炫assicusraddei、中華裸角天牛Aegosomasinicum和星天牛Anoplophorachinensis線粒體基因組作為外群，選擇了葉甲科中的4個(gè)亞科20個(gè)物種線粒體基因組作為內(nèi)群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。23個(gè)物種的的線粒體基因組全序列從NCBI中獲取，利用ClustalW進(jìn)行線粒體基因組全序列比對(duì)，利用DAMBE軟件(Xia,2018)進(jìn)行堿基替代飽和度檢驗(yàn)(test of substitution saturation)，以確定序列是否適合建樹(shù)，若建樹(shù)所用的序列沒(méi)有達(dá)到飽和，則可以建樹(shù)并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，使用IQ-TREE進(jìn)行模型測(cè)試，選出最優(yōu)模型采用最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 為害癥狀

甘薯凹脛跳甲成蟲(chóng)為害甘薯葉片和幼嫩的植株，開(kāi)始以葉片的邊緣為食，逐漸向葉片內(nèi)部啃食，典型的癥狀是在葉片表面留下像是指甲掐痕狀的狹窄凹槽食痕，并且食痕處發(fā)生褐變(圖1:A)，危害嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致葉片穿孔、殘缺、落葉、萎蔫或植株死亡(圖1:B)。此外，成蟲(chóng)取食樹(shù)牽牛Ipomoeafistulosa葉片表面的葉肉，在其下表皮易造成白斑，嚴(yán)重為害葉片多穿孔(圖1:C)，取食五爪金龍I.cairica也會(huì)產(chǎn)生褐色凹槽食痕(圖1:D)。據(jù)報(bào)道甘薯凹脛跳甲幼蟲(chóng)亦可在薯塊表面取食形成細(xì)線狀食道。

圖1 甘薯凹脛跳甲成蟲(chóng)在不同植物上的危害癥狀Fig.1 Damage symptoms of Chaetocnema confinis adults on different plantsA:成蟲(chóng)為害甘薯葉片造成掐痕狀凹槽癥狀A(yù)dults damage sweetpotato leaves and cause pinch mark like groove symptoms;B:成蟲(chóng)為害甘薯葉片殘缺癥狀A(yù)dults cause mutilation of sweetpotato leaves;C:樹(shù)牽牛葉片白斑和穿孔癥狀White spot and hole symptoms of bush morning glory leaves;D:成蟲(chóng)危害五爪金龍?jiān)斐善蹱畎疾郯Y狀A(yù)dults damage Ipomoea cairica and cause pinch mark like groove symptoms.

2.2 形態(tài)學(xué)特征

檢視發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)的甘薯凹脛跳甲均為雌性，為便于對(duì)比觀察，將檢視的國(guó)外雄蟲(chóng)形態(tài)特征一并列出(圖2)。成蟲(chóng)：體長(zhǎng)1.50～1.70 mm，體寬0.80～1.00 mm。背面顏色青銅色，頭部表面具網(wǎng)狀紋理，觸角各節(jié)完全黃褐色，脛節(jié)、前足和中足腿節(jié)淺褐色，后足腿節(jié)暗褐色，跗節(jié)黃色(圖2:A,B)；頭下口式，額脊窄且隆起。額側(cè)溝明顯，額上溝不發(fā)達(dá)。眼眶上溝深。上唇前緣中部輕微膨突(圖2:C,D)；前胸背板基部?jī)蓚?cè)無(wú)縱條紋或凹陷，橫向深刻點(diǎn)行消失，均勻向后膨出。前胸背板側(cè)緣輕微膨大，向前收攏，側(cè)前角強(qiáng)壯，側(cè)后角不發(fā)達(dá)，刻點(diǎn)直徑小于刻點(diǎn)間距2～4倍；后足脛節(jié)端凹中等發(fā)達(dá)，凹前角較鋒利，后足脛節(jié)側(cè)緣細(xì)齒鈍；鞘翅側(cè)緣輕微向兩側(cè)凸出。鞘翅刻點(diǎn)大于前胸背板，排列成規(guī)律的刻點(diǎn)行，靠近小盾片處另具一短刻點(diǎn)行。鞘翅刻點(diǎn)間光滑、不明顯隆起。鞘翅肩胛發(fā)達(dá)；雄蟲(chóng)前足第1跗節(jié)稍大于第2跗節(jié)，后足脛節(jié)端凹中等發(fā)達(dá)，后足脛節(jié)端凹前角鈍，后足脛節(jié)側(cè)緣細(xì)齒消失或較弱。陽(yáng)莖端部漸細(xì)，不具中縱溝，端突缺失，無(wú)橫向的細(xì)紋(圖2:E)；雌性受精囊細(xì)頸瓶狀。受精囊泵的長(zhǎng)度遠(yuǎn)短于受精囊體。受精囊泵端部圓筒形。受精囊泵位于受精囊體頂部中央(圖2:G,I)。附器后部骨化區(qū)域?qū)挾却笥谇安抗腔瘏^(qū)域。

圖2 甘薯凹脛跳甲成蟲(chóng)形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of Chaetocnema confinis adultsA:雄成蟲(chóng)Male adult;B:雌成蟲(chóng)Female adult;C:雄蟲(chóng)頭部Head of male;D:雌蟲(chóng)頭部Head of female;E:陽(yáng)莖Aedeagus;F:雄蟲(chóng)陰道Vaginal palpi of male;G:雄蟲(chóng)受精囊Spermatheca of male;H:雌蟲(chóng)陰道Vaginal palpi of female;I:雌蟲(chóng)受精囊Spermatheca of female.

卵橢圓形，長(zhǎng)徑0.8 mm，短徑0.2 mm，以卵塊形式存在；老熟幼蟲(chóng)體長(zhǎng)6 mm，體淡黃色或黃色，頭部為棕色，呈蠕蟲(chóng)狀，有足，直線或圓柱形；蛹乳白色，長(zhǎng)約2 mm。

2.3 分子鑒定

待鑒定跳甲的cox1(GenBank登錄號(hào):OL872211)序列長(zhǎng)658 bp，甘薯凹脛跳甲保守位點(diǎn)438個(gè)，變異位點(diǎn)24個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)8個(gè)，單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)16個(gè)?；赾ox1 DNA序列采用鄰接法構(gòu)建的甘薯凹脛跳甲系統(tǒng)發(fā)育分析表明，該凹脛跳甲和加拿大的甘薯凹脛跳甲聚在一起，支持度達(dá)100%，其中5個(gè)加拿大的甘薯凹脛跳甲聚為一簇(圖3)。由此可知，甘薯凹脛跳甲已入侵中國(guó)大陸，且同一地區(qū)的不同樣本遺傳距離更小。

圖3 鄰接法構(gòu)建的基于入侵中國(guó)大陸甘薯凹脛跳甲和其他昆蟲(chóng)cox1基因DNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(1 000次重復(fù))Fig.3 Phylogenetic tree of cox1 genes of Chaetocnema confinis invading the Chinese mainland and other insects based on DNA sequence constructed by the neighbor-joining method (1 000 replicates)

2.4 線粒體基因組序列

甘薯凹脛跳甲線粒體基因組全長(zhǎng)15 685 bp(GenBank登錄號(hào):OL875083)，共編碼37個(gè)基因，其中13個(gè)PCGs、22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因(rrnL和rrnS)以及1個(gè)非編碼的控制區(qū)(control region,CR)?；蚺帕许樞蚺c模式昆蟲(chóng)Drosophilayakuba線粒體基因排列順序相同。甘薯凹脛跳甲控制區(qū)位于trnI和trnS之間，長(zhǎng)度僅有60 bp。甘薯凹脛跳甲線粒體基因組主要編碼鏈(J鏈)編碼23個(gè)基因，包括14個(gè)tRNA基因和9個(gè)PCGs，次要編碼鏈(N鏈)編碼基因有14個(gè)，分別是2個(gè)rRNA基因，8個(gè)tRNA基因和4個(gè)PCGs(圖1)。

圖4 甘薯凹脛跳甲線粒體基因組結(jié)構(gòu)Fig.4 Mitochondrial genome structure of Chaetocnema confinis正向編碼的基因位于圈外側(cè)，反向編碼的基因位于圈內(nèi)側(cè)；內(nèi)環(huán)表示GC含量。The encoded genes in forward direction located on the outside of the circle,and those in reverse direction located on the inside of the circle.Inner ring indicates GC content.

甘薯凹脛跳甲線粒體基因組的37個(gè)基因之間排列非常緊湊，間隔總長(zhǎng)度101 bp,除了控制區(qū)，甘薯凹脛跳甲線粒體基因組包括8個(gè)基因間隔序列，范圍從1～32 bp，最長(zhǎng)的間隔序列(32個(gè)核苷酸)位于rrnL和trnV基因之間(表1)。基因組中有13個(gè)重疊區(qū)域，范圍從1～23 bp。在甘薯凹脛跳甲線粒體基因組atp8/atp6(ATGATAA)和nad4L/nad4(ATGTTAA)的重疊核苷酸是保守的。甘薯凹脛跳甲線粒體基因組A，T，C和G含量分別為40.71%，36.59%，13.62%和9.08%，A+T含量為77.3%(表2)。PCGs、tRNA基因、rRNA基因和控制區(qū)A+T含量分別為74.9%,79.06%,82.96%和88.33%。整個(gè)線粒體基因組中總的AT-skew和GC-skew分別為0.053和-0.200，表明A的含量高于T，C的含量高于G(表2)。

甘薯凹脛跳甲的線粒體基因組PCGs共有13個(gè)，序列長(zhǎng)度為11 006 bp，占總基因組的70.17%。13個(gè)PCGs分別為atp6,atp8,cox1,cox2,cox3,cob,nad1,nad2,nad3,nad4,nad5,nad6和nad4L，其編碼蛋白包括了與線粒體內(nèi)膜相結(jié)合的酶復(fù)合體的亞單位：7個(gè)NADH還原酶復(fù)合體的亞單位、1個(gè)細(xì)胞色素b(cob)、3個(gè)細(xì)胞色素c氧化酶的亞單位(cox)、2個(gè)ATP酶的亞單位。

甘薯凹脛跳甲線粒體基因組13個(gè)PCGs起始密碼子均為昆蟲(chóng)典型的起始密碼子ATN，其中cox2和nad6以ATA作為起始密碼子，cox1,nad1,nad2,nad3和nad5以ATT作為起始密碼子，ATG分別是cob,cox3,nad,nad4L,atp6和atp8的起始密碼子。甘薯凹脛跳甲線粒體基因組的5個(gè)PCGs(cox2,nad6,nad4L,atp6和atp8)具有完全終止密碼子TAA，nad1以完全終止密碼子TAG終止(表1)，另外nad5是以不完全終止子TA作為終止密碼子，其余6個(gè)PCGs(cox1,cox3,nad2,nad3,nad4和cob)是以不完全終止子T作為終止密碼子。

甘薯凹脛跳甲線粒體基因組13個(gè)共編碼3 669個(gè)密碼子(含終止密碼子)，編碼最頻繁的氨基酸是絲氨酸(Ser)，其次是亮氨酸(Leu)。相對(duì)同義密碼子使用情況表明在編碼相同氨基酸時(shí)，各密碼子的相對(duì)同義密碼子使用頻率(relative synonymous codon usage,RSCU)值相差較大，甘薯凹脛跳甲線粒體基因組中密碼子使用頻率具有明顯的偏向性(圖5)。

表1 甘薯凹脛跳甲線粒體基因組注釋Table 1 Annotation of the mitochondrial genome of Chaetocnema confinis

表2 甘薯凹脛跳甲線粒體全基因組核苷酸組成Table 2 Nucleotide composition of the complete mitochondrial genme (mitogenome) of Chaetocnema confinis

圖5 甘薯凹脛跳甲線粒體基因組相對(duì)同義密碼子使用頻率(RSCU)Fig.5 Relative synonymous codon usage (RSCU) in the mitochondrial genome of Chaetocnema confinis

甘薯凹脛跳甲線粒體基因組tRNA基因的總長(zhǎng)度為1 418 bp，占甘薯凹脛跳甲線粒體總基因組的9.04%，單個(gè)tRNA基因序列長(zhǎng)度在62～69 bp之間。其中trnS1的DHU臂缺失，以及trnD,trnG,trnN和trnT的二級(jí)結(jié)構(gòu)中缺少TψC環(huán)，除這5個(gè)tRNA外，都能形成典型的三葉草式二級(jí)結(jié)構(gòu)。trnK的反密碼子突變?yōu)閁UU,trnS1的反密碼子突變?yōu)閁CU。甘薯凹脛跳甲常見(jiàn)典型的A-U和G-C配對(duì)存在于22個(gè)tRNA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，此外，非標(biāo)準(zhǔn)及其他錯(cuò)配共25處，包括17處G-U錯(cuò)配，3處U-U錯(cuò)配，1處A-G錯(cuò)配。G-U錯(cuò)配最多，主要發(fā)生在trnA,trnF,trnH和trnQ中。U-U錯(cuò)配發(fā)生在trnD,trnL1和trnL2A-G錯(cuò)配位于trnW上(圖6)。

2.5 甘薯凹脛跳甲與近緣物種的比較

如圖7所示，4個(gè)物種的線粒體全基因組序列整體上呈現(xiàn)共線性結(jié)構(gòu)。甘薯凹脛跳甲和跳甲亞科的其他屬種基因排列順序完全一致，整體上并無(wú)基因重排現(xiàn)象。

基于線粒體全基因組的最大似然樹(shù)結(jié)果顯示鞘翅目葉甲總科的23個(gè)物種明顯聚成5個(gè)分支(圖8)，作為外群的天?？频?個(gè)物種聚在了一起，分別為栗山天牛M.raddei、中華裸角天牛A.sinicum和星天牛A.chinensis；跳甲亞科是一個(gè)并系群，女貞瓢跳甲A.tsekooni、薊跳甲A.cirsicola、蛇莓跳甲A.fragariae、桔潛跳甲P.nigricollis、黃曲條跳甲P.striolata、水花生葉甲A.hygrophila、老鸛草跳甲A.viridicyanea以及甘薯凹脛跳甲C.confinis和凹脛跳甲屬C.pelagica的一個(gè)種9個(gè)物種全聚為一支；螢葉甲亞科是一個(gè)單系群，即雙斑螢葉甲M.hieroglyphica、玉米根螢葉甲D.virgifera、黃守瓜A.indica和長(zhǎng)跗螢葉甲M.occifluvis4個(gè)物種聚在了一起；葉甲亞科是一個(gè)并系群。由此可見(jiàn)甘薯凹脛跳甲和黃曲條跳甲的親緣關(guān)系最近，跳甲亞科與螢葉甲亞科具有較近的親緣關(guān)系，這與他人的研究報(bào)道相吻合(翟宗昭等,2005)。

圖6 甘薯凹脛跳甲線粒體基因組tRNA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Secondary structure of tRNA genes of the mitochondrial genome of Chaetocnema confinis

圖7 甘薯凹脛跳甲線粒體基因組共線性分析Fig.7 Collinear analysis of the mitochondrial genome of Chaetocnema confinis長(zhǎng)方塊代表基因組之間的相似性，長(zhǎng)方塊之間的連線代表一種共線性關(guān)系；短方塊代表每個(gè)基因組的基因位置，其中白色代表編碼序列(CDS),綠色代表tRNA,紅色代表rRNA。The cuboids represent similarities between genomes,and the lines between the cuboids represent a collinear relationship;the short squares represent the gene location of each genome,white represents coding sequence (CDS),green represents tRNA,and red represents rRNA.

圖8 基于線粒體基因組的甘薯凹脛跳甲和葉甲科其他物種的最大似然發(fā)育樹(shù)Fig.8 Maximum likelihood phylogenetic tree of mitochondrial genome sequences of Chaetocnema confinis and other species of Chrysomelidae標(biāo)尺遺傳距離。The scale bar indicates genetic distance.

3 討論

甘薯凹脛跳甲起源于美國(guó)和加拿大，近年其分布范圍逐漸擴(kuò)大，已成一些地方為害甘薯的主要害蟲(chóng)(Clarketal.,2013;Hayashikawa and Fukuda,2016)，國(guó)內(nèi)報(bào)道江蘇、廣西等地采到了標(biāo)本，但未觀察到為害甘薯(Ruanetal.,2019)。作者2018年以來(lái)在廣東省多個(gè)地市頻繁觀察到疑似甘薯凹脛跳甲為害甘薯葉片的典型癥狀，并且發(fā)現(xiàn)其為害逐漸呈擴(kuò)大趨勢(shì)。因此，本研究通過(guò)詳細(xì)的形態(tài)特征鑒定(圖2)和cox1基因DNA條形碼技術(shù)(圖3)相結(jié)合的方法對(duì)該蟲(chóng)進(jìn)行精確鑒定，明確了甘薯凹脛跳甲已入侵中國(guó)大陸并成為了我國(guó)甘薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的潛在威脅。

甘薯凹脛跳甲有昆蟲(chóng)鞘翅目線粒體基因組的所有相關(guān)特征，其長(zhǎng)度為15 685 bp，在鞘翅目昆蟲(chóng)的線粒體基因組所報(bào)道的長(zhǎng)度范圍之內(nèi)(Baeetal.,2004;Kimetal.,2015)。節(jié)肢動(dòng)物模式物種果蠅Drosophilayakuba的線粒體基因組的基因順序被作為昆蟲(chóng)的模式排列順序(陳志騰和杜予州,2016)。目前已知的鞘翅目線粒體基因組的基因組成，特別是PCGs的排列大多與D.yakuba一致，基因重排較少(Timmermans and Vogler,2012)。甘薯凹脛跳甲的線粒體基因組中基因的排列順序和果蠅的完全一致，并無(wú)發(fā)生重排現(xiàn)象。

甘薯跳甲線粒體基因組13個(gè)PCGs都是以典型的ATN作為起始密碼子，這與D.yakuba的起始密碼子一致。聶瑞娥和楊星科(2014)認(rèn)為鞘翅目昆蟲(chóng)cox1基因起始密碼子多數(shù)不是昆蟲(chóng)常規(guī)的起始密碼子，Sheffield等(2008)研究表明多食亞目cox1的起始密碼子為AAT或AAC。但是甘薯跳甲cox1基因的起始密碼子和D.yakuba的起始密碼子一樣為ATT。據(jù)報(bào)道葉甲總科負(fù)泥蟲(chóng)亞科Criocerisduodecimpunctata和鞘翅目棗食芽象甲cox1基因也為常規(guī)的起始密碼子ATT(Stewart and Beckenbach,2003)。一般tRNA基因的反密碼子都十分的穩(wěn)定，因?yàn)槠湓诰€粒體的代謝中有著非常重要的作用，但在鞘翅目的線粒體基因組中反密碼子trnS1和trnK會(huì)發(fā)生突變，其中多食亞目trnS1的反密碼子會(huì)由UCU替代GCU，諸如天門(mén)冬葉甲Criocerisasparagi和十二星負(fù)泥蟲(chóng)Criocerisduodecimpunctata(Friedrich and Muqim,2003;Stewart and Beckenbach,2003)，甘薯跳甲中也有相同的突變，這可能是多食亞目的共源性狀(Sheffieldetal.,2008)，鞘翅目其他3個(gè)亞目trnS1的反密碼子是GCU；另一個(gè)就是在鞘翅目葉甲總科中獨(dú)有突變，trnK的反密碼子會(huì)由UUU替代CUU(Ruietal.,2020)，這種突變?cè)诟适硖椎木€粒體基因中也有。

線粒體基因組控制區(qū)是線粒體基因組中最主要的非編碼區(qū)，通常是在trnI和trnS之間，在一些物種中位置也會(huì)發(fā)生改變(Saitoetal.,2005)，在甘薯跳甲線粒體基因組中其位置未發(fā)生改變。線粒體基因組控制區(qū)長(zhǎng)度變異很大，從幾十到數(shù)千堿基不等(Zhouetal.,2007;Mancinietal.,2008)，通常是線粒體基因組中最大的非編碼區(qū)，是復(fù)制和表達(dá)的主要調(diào)控區(qū)，因其不編碼基因，極易發(fā)生堿基變異。黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的線粒體基因組中控制區(qū)長(zhǎng)達(dá)4 601 bp(Claryetal.,1983)；Kim等(2012)報(bào)道了瓢蟲(chóng)科七星瓢蟲(chóng)Coccinellaseptempunctata線粒體全基因組的控制區(qū)長(zhǎng)4 469 bp，是鞘翅目昆蟲(chóng)最長(zhǎng)控制區(qū)；在直翅目中鉤額草螽Ruspoliadubia的線粒體基因組中控制區(qū)有70 bp(Zhouetal.,2007)。目前，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中凹脛跳甲屬線粒體全基因組數(shù)據(jù)只有一個(gè)物種，即Chaetocnemapelagica，發(fā)現(xiàn)其控制區(qū)長(zhǎng)度達(dá)到1 749 bp(Nieetal.,2018)。在本研究中發(fā)現(xiàn)甘薯跳甲的線粒體基因組的控制區(qū)長(zhǎng)度只有60 bp，是目前所報(bào)道的最短的鞘翅目線粒體基因組控制區(qū)。此外，本研究基于線粒體全基因組序列進(jìn)行了甘薯跳甲系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析，發(fā)現(xiàn)跳甲亞科的物種和螢葉甲科的物種具有較近的親緣關(guān)系，與傳統(tǒng)的形態(tài)分類結(jié)果是一致的(翟宗昭等,2005)。甘薯凹脛跳甲主要寄主為旋花科植物，還可為害玉米、甜菜、西紅柿等作物(Prathapan and Balan,2010).近年在廣東省廣州市、肇慶市、云浮市、河源市等市頻繁觀察到甘薯凹脛跳甲對(duì)甘薯葉片典型的危害癥狀，暫未觀察到對(duì)薯塊嚴(yán)重的為害，這種現(xiàn)象可能是國(guó)內(nèi)種群數(shù)量還不大。由于甘薯凹脛跳甲起源于加拿大和美國(guó)，能夠很好的適應(yīng)冷涼環(huán)境，如不加以防控，必將向我國(guó)其他甘薯產(chǎn)區(qū)蔓延為害。