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    蓮藕腐敗病致病菌的鑒定與防治

    2022-11-28 03:01:18唐光美楊馨語張小樂李弘星李蕾郭嘉航官會(huì)林黃晶心
    關(guān)鍵詞:禾谷百菌蓮藕

    唐光美,楊馨語,張小樂,李弘星,李蕾,郭嘉航,官會(huì)林,黃晶心**

    (1.云南師范大學(xué) 高原特色中藥材種植土壤質(zhì)量演變退化與修復(fù)云南省野外科學(xué)觀測(cè)研究站,云南 昆明 650500;2.云南師范大學(xué) 云南省農(nóng)村能源工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650500;3.云南開放大學(xué) 公共基礎(chǔ)教學(xué)部,云南 昆明 650500)

    蓮藕是中國的傳統(tǒng)農(nóng)作物,分布極廣,南北各地均有種植,以長江流域、珠江三角洲、洞庭湖、太湖等地為主產(chǎn)區(qū).除水田外,低洼田、池塘和湖蕩也可種植.云南種植蓮藕歷史悠久,主要分布在安寧、呈貢、澄江、玉溪、江川、文山、丘北等地[1-2].蓮藕腐敗病又稱蓮藕枯萎病、蓮瘟,是蓮藕種植區(qū)發(fā)病普遍、危害嚴(yán)重的病害之一.腐敗病發(fā)生時(shí)可導(dǎo)致蓮藕減產(chǎn)20%~60%,甚至絕收,嚴(yán)重影響蓮藕的產(chǎn)量和品質(zhì)[3].據(jù)報(bào)道蓮藕腐敗病由多種真菌引起,主要有尖鐮孢菌蓮?;停‵usarium oxysporumSchl.f.sp.nelumbicola)[4]、喙腐霉(Pythium rostratum)、刺腐霉(Pythium spinosum)[5]、旋柄腐霉(Phytopythium helicoides)[6]、串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)、腐皮鐮刀(Fusarium poae)和接骨木鐮刀菌(Fusarium sambucinum)[7]等.目前,蓮藕腐敗病的防治方法主要為化學(xué)防治.陰筱等[6]研究發(fā)現(xiàn)代森錳鋅對(duì)蓮藕腐敗病致病菌旋柄腐霉具有較好的抑制作用.梁志懷等[8]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)硫磺多菌靈和惡霉靈對(duì)蓮藕腐敗病致病菌尖孢鐮刀菌防治效果較好.雖然李文峰等[9]開發(fā)了蓮藕病蟲害智能診治系統(tǒng),但不同區(qū)域蓮藕腐敗病防治效果存在差異,限制了當(dāng)前研究成果的推廣與應(yīng)用.

    本研究的發(fā)病蓮藕取自云南省安寧市,該地蓮藕栽培歷史悠久,蓮藕及其產(chǎn)品的售賣為當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶的主要經(jīng)濟(jì)來源.據(jù)當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶反映,蓮藕發(fā)病于每年的6—10月,3~7 d 中便會(huì)使水田30%~50%的蓮藕發(fā)病,嚴(yán)重影響了蓮藕的品質(zhì)和產(chǎn)量.據(jù)觀察,發(fā)病蓮藕表面有黑色斑點(diǎn),斑點(diǎn)及周圍有黑水流出,切開蓮藕后發(fā)現(xiàn)通氣組織中有明顯白色菌絲.當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶通過換種、藕田翻耕、晾曬土壤、隨機(jī)噴灑藥劑等方式防治,但效果并不理想.為了解決當(dāng)?shù)厣徟焊瘮栴},減輕病害對(duì)當(dāng)?shù)厣徟寒a(chǎn)業(yè)的影響,本研究采集了云南省安寧市的腐敗蓮藕,通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定蓮藕腐敗病病原微生物,并用6 種農(nóng)藥進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),篩選防治效果較好的藥劑,確定藥劑的最佳施用濃度,為當(dāng)?shù)厣徟翰『Φ姆乐翁峁┛茖W(xué)指引.

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料于2018 年10月,采集云南省安寧市的發(fā)病蓮藕,洗凈后存放于自封袋,立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離、純化.

    1.2 方法

    1.2.1 病原菌的分離、純化 用組織分離法和直接挑取法分離、純化發(fā)病蓮藕的病原菌.使用滅菌手術(shù)刀切取蓮藕發(fā)病組織與健康組織交界處的樣品,為1~2 cm,用70%乙醇浸泡20~30 s后,使用無菌水漂洗3次,然后將漂洗后的樣品轉(zhuǎn)接于PDA 培養(yǎng)基中,置于28 ℃恒溫中培養(yǎng)7 d,待長出菌落后挑取、純化3~5 次.將純化好的菌株轉(zhuǎn)接于PDA 斜面培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)3 d,于4 ℃保藏備用.

    1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 將分離得到的真菌接種于PDA 培養(yǎng)基平板上,28 ℃培養(yǎng)7 d.使用接種針挑取菌落邊緣的菌絲于載玻片上,滴上1~2 滴無菌水,蓋上蓋玻片后使用顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照.參照《真菌鑒定手冊(cè)》[10],根據(jù)菌落特征、菌絲形狀、孢子特征等對(duì)分離得到的真菌進(jìn)行初步鑒定.

    1.2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 通過分析真菌ITS 序列對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定.將純化后的真菌接種于PDA 培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)5 d,使用SK8255 kit (Sagan Corporation,Shanghai)試劑盒提取DNA 用于PCR 序列擴(kuò)增.擴(kuò)增ITS 序列所用引物 為ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和 ITS5(5 ′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3),具體PCR 擴(kuò)增程序和方法按照參考文獻(xiàn)[11]所述.擴(kuò)增所得片段使用SanPrep 柱式DNA 凝膠回收試劑盒(上海生工,SK8131)進(jìn)行回收,回收后的片段使用pMD?18-T Vector 試劑盒(Takara,D101A)構(gòu)建克隆文庫,送交上海生工進(jìn)行測(cè)序.

    使用Bio Edit (7.0.5.3)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行整理.使用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列搜索,并下載相關(guān)序列.通過Mega 軟件(V7.0.26)進(jìn)行比對(duì),采用N-J 方法構(gòu)建基于真菌ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹,采用Bootstrap 方法對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行評(píng)估.通過系統(tǒng)發(fā)育樹確定真菌種屬信息.

    1.2.4 致病性測(cè)定 采用柯赫氏法則確定蓮藕腐敗病致病菌.具體步驟分3 步.①消毒,取健康蓮藕,用自來水將其表面的泥土沖洗干凈,75%酒精浸泡2 min,無菌水清洗3次,2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min,無菌水清洗3 次.②接種,用滅菌后的接種針等量挑取6 種真菌刺入蓮藕,深度約0.5 mm,每塊蓮藕刺8 次.③培養(yǎng)及觀察,將接上真菌的蓮藕在室溫下培養(yǎng)15 d,觀察蓮藕的發(fā)病情況,選擇與田間腐敗蓮藕相似癥狀的蓮藕組織,并從該組織上分離對(duì)應(yīng)真菌,確認(rèn)該菌為蓮藕腐敗病的致病菌.

    1.2.5 化學(xué)防治藥劑的篩選 通過查閱蓮藕腐敗病防治的相關(guān)文獻(xiàn),對(duì)比分析多菌靈、百菌清、腐霉·福美雙、代森錳鋅、唑醚·甲菌靈和噁霉靈6種藥物的抑菌效果.具體方法為:致病菌培養(yǎng)5 d后,采用5 mm 打孔器,取菌落邊緣新生菌絲于PDA 培養(yǎng)基平板中央,在平板垂直方向分別打4個(gè)孔放入無菌濾膜過濾后的農(nóng)藥,置于28 ℃培養(yǎng)5 d,觀察菌落的生長情況,每種農(nóng)藥3 次重復(fù).6 種農(nóng)藥的有效成分、劑型及生產(chǎn)廠家如表1 所示,農(nóng)藥的使用濃度按照廠家說明.根據(jù)公式:

    表1 6 種農(nóng)藥的劑型和廠商建議的使用稀釋倍數(shù)Tab.1 The dosage forms and manufacturer’s recommended dilution ratio of 6 pesticides

    抑菌率(%)=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對(duì)照組菌落直徑×100%[12]計(jì)算抑菌率,并用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差作圖.

    1.2.6 蓮藕腐敗病化學(xué)防治藥劑最佳施用濃度 為驗(yàn)證1.2.5 中篩選出的百菌清對(duì)蓮藕致病菌的抑制效果,確定百菌清的最佳施用濃度.本研究在200 mL PDA 液體培養(yǎng)中添加無菌濾膜過濾后的百菌清.共設(shè)置5 個(gè)濃度處理,分別為稀釋600、1 200、2 400、4 800、9 600倍,以不添加百菌清為對(duì)照(CK),每個(gè)處理重復(fù)3次,每重復(fù)接種等量的致病菌菌餅,在28 ℃,180 r/min 下培養(yǎng)84、96、108、120、132、144 h 取樣,使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)培養(yǎng)液中致病菌的孢子.

    2 結(jié)果

    2.1 真菌的形態(tài)學(xué)鑒定本研究共分離、純化得到6 種真菌,分別記錄為L1、L2、L3、L4、L5、L6(圖1).對(duì)培養(yǎng)了7 d 的菌落進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)L1 老化菌絲周圍培養(yǎng)基呈紅色,邊緣及氣生菌絲為白色,初步鑒定為鐮刀菌屬(Fusarium).L2 菌絲呈灰白色,菌絲呈棉絮狀,初步鑒定為毛霉屬(Mucor).L3菌絲生長緩慢,生長7 d 后菌落大小在4.5~7.0 cm,菌落中間為草綠色,周圍呈墨綠色,初步鑒定為青霉屬(Penicillium).L4 菌放射狀生長,菌絲為純白色,致密、平鋪于PDA 培養(yǎng)基上,初步鑒定為地霉屬(Galactomyces).L5 菌落呈斑塊狀生長,每個(gè)斑塊規(guī)則不一,菌落呈灰色,初步鑒定為漢遜酵母屬(Ogataea).L6 氣生菌絲為白色,中間老化菌絲為紅色、金黃色,初步鑒定為鐮刀菌屬(Fusarium).

    圖1 6 種真菌在PDA 培養(yǎng)基上的形態(tài)Fig.1 Morphology of six pathogenic fungi on PDA medium plate

    顯微鏡下(圖2),L1 菌株產(chǎn)生大量的大型孢子,孢子呈鐮刀形或棒球狀,有隔膜2~7個(gè),頂端鈍圓或略微收縮,菌絲中存在孢子座,上部附著生多個(gè)大型孢子.L2 菌株孢子呈球形,黑色或褐色,破裂的孢子囊釋放出大量的短卵形胞囊孢子.L3 真菌分生孢子梗上有大量分生孢子,菌絲多分支,每個(gè)菌絲上均有明顯的隔膜.L4 真菌菌絲末端存在明顯的橢圓形孢子,成熟的孢子與菌絲斷裂,菌絲上有隔膜,多數(shù)菌絲分枝二叉.L5 菌株在顯微鏡下未見明顯的孢子,菌絲有分叉.L6 產(chǎn)生大量的大型分生孢子,孢子多有3 個(gè)橫隔,菌絲中存在隔膜,孢子的大小存在明顯差異.

    圖2 6 種真菌分生孢子的形態(tài)Fig.2 The conidial morphologies of six pathogenic fungi

    2.2 致病菌的分子鑒定對(duì)6 種真菌的ITS 片段進(jìn)行比對(duì)、分析,采用鄰位相連法(Neighbor-Joining法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3).鑒定結(jié)果顯示L1 菌株為禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum),L2 菌株為卷枝毛霉(Mucor circinelloides),L3 菌株為團(tuán)青霉(Penicillium commune),L4 菌株為白地霉(Galactomyces candidum),L5 菌株為漢遜酵母(Ogataea polymorpha),L6 菌株為三線鐮刀菌(Fusarium tricinctum).

    圖3 基于ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on the ITS sequences

    2.3 致病菌的致病性測(cè)定回接蓮藕7 d后,6 種真菌僅有L1 菌株能使蓮藕染病(圖4).L1 回接3 d 后蓮藕表皮產(chǎn)生明顯黑斑,5 d 后蓮藕變黑、腐敗,切開蓮藕后通氣組織孔道中有許多白色菌絲.上述癥狀與在安寧采集的發(fā)病蓮藕癥狀完全相同,菌絲經(jīng)分離純化和L1 完全相同.由此,根據(jù)柯赫氏法則可認(rèn)定L1 菌株為引發(fā)蓮藕腐敗病的致病菌.

    圖4 田間發(fā)病蓮藕(a)和試驗(yàn)室回接發(fā)病蓮藕(b)組織圖片F(xiàn)ig.4 The tissue pictures of the diseased lotus root in the field(a) and the laboratory (b)

    2.4 化學(xué)農(nóng)藥防治的篩選由圖5 可知,6 種農(nóng)藥均能抑制禾谷鐮刀菌生長,且不同農(nóng)藥抑制效果存在顯著差異(P<0.05).百菌清的抑菌效果最好,抑菌率為56.49%,分別是代森錳鋅、噁霉靈、唑醚·甲菌靈的1.88、2.1、2.22 倍.

    2.5 百菌清的最佳施用濃度由圖6 可知,不同濃度百菌清對(duì)禾谷鐮刀菌的產(chǎn)孢抑制程度不同.稀釋600 倍可完全抑制禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢,稀釋1 200、2 400、4 800、9 600 倍分別在120、96、96、84 h 內(nèi)抑制禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢.這說明百菌清對(duì)禾谷鐮刀菌的產(chǎn)孢抑制效果隨著稀釋倍數(shù)的增加而降低,為完全抑制禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢,百菌清的施用濃度需達(dá)到600 倍稀釋液濃度.

    3 討論

    蓮藕腐敗病可由多種真菌引起,但發(fā)病癥狀大致相同,主要為蓮藕地下莖逐漸變褐,通氣組織中充滿白色、絮狀菌絲,地下莖后期呈褐色至紫黑色腐敗[3-4,6],例如串珠鐮孢菌、旋柄腐霉和尖孢鐮刀菌均能引發(fā)蓮藕腐敗病.本研究發(fā)現(xiàn)引發(fā)云南省安寧市蓮藕腐敗病的病原微生物為禾谷鐮刀菌.禾谷鐮刀菌為叢梗孢目,瘤痤孢科,鐮刀菌屬微生物,可引發(fā)禾本科作物發(fā)病,例如玉米穗腐病[13]、小麥莖腐病[14]等.有研究表明禾谷鐮刀菌還能引發(fā)十字花科植物擬南芥病變[15]、茄科植物煙草枯萎[16],豆科植物大豆腐敗[17-18],是一種多宿主致病真菌.禾谷鐮刀菌菌絲能在植物的輸導(dǎo)組織、通氣組織及植物表面快速繁殖、擴(kuò)散,短時(shí)間內(nèi)造成植物枯萎、腐敗等[19-20].禾谷鐮刀菌的分生孢子可通過土壤、空氣、水等傳播,短時(shí)間內(nèi)造成作物大面積染病[21-22],目前關(guān)于禾谷鐮刀菌引發(fā)蓮藕腐敗病的研究尚未見報(bào)道.本研究結(jié)果顯示禾谷鐮刀菌能夠在短期內(nèi)侵染蓮藕,可能是因?yàn)樵摼z侵入蓮藕的通氣組織和輸導(dǎo)組織,該菌分生孢子經(jīng)水傳播至其他區(qū)域,進(jìn)而引發(fā)蓮藕腐敗,造成大面積的損失.

    目前蓮藕腐敗病的防治方法主要為化學(xué)藥劑防治和生物防治.大多數(shù)研究主要報(bào)道了浙江、湖北等地蓮藕腐敗病的防治[4,23-24],關(guān)于西南地區(qū)蓮藕腐敗病防治的報(bào)道還較少.據(jù)本研究區(qū)域調(diào)查反映,塘泥翻曬、噴灑硫酸銅、換種等方法均不能有效防治該地區(qū)蓮藕腐敗.本研究結(jié)果表明,6 種農(nóng)藥中百菌清的抑制效果最好(圖5),且百菌清600倍稀釋液可完全抑制禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢(圖6).百菌清的主要成分四氯間苯二甲腈,它可與3-磷酸甘油醛脫氫酶中的半胱氨酸蛋白質(zhì)相結(jié)合,從而破壞磷酸甘油醛脫氫酶活性[25],限制真菌細(xì)胞新陳代謝[18,26].研究表明百菌清對(duì)引發(fā)非洲菊枯萎病的尖孢鐮刀菌[27]具有良好抑菌效果,同時(shí)還能抑制楊樹潰瘍病菌絲生長及生物量[28],對(duì)禾谷鐮刀菌具有較好抑制效果[29-30],這些研究結(jié)果與我們研究結(jié)果相似.因此,百菌清相比于其他藥劑能更好地抑制禾谷鐮刀菌的生長和產(chǎn)孢,可用于安寧市蓮藕腐敗病的防控.

    圖5 6 種農(nóng)藥對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制效果Fig.5 Inhibitory effect of six pesticides on Fusarium graminearum

    圖6 不同濃度百菌清對(duì)禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢的抑制效果Fig.6 Inhibitory effect of different concentrations of chlorothalonil on sporulation of Fusarium graminearum

    近年來,隨著蓮藕種植面積的逐漸增加,蓮藕腐敗病的發(fā)生日趨嚴(yán)重.蓮藕腐敗影響蓮藕的品質(zhì)和產(chǎn)量,甚至影響蓮藕的觀賞價(jià)值,對(duì)蓮藕種植業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[4].本研究結(jié)果表明,安寧市蓮藕腐敗病主要是由禾谷鐮刀菌引起,且百菌清600倍稀釋液可有效控制禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢,但該結(jié)果推廣應(yīng)用于蓮藕大田種植仍需進(jìn)一步驗(yàn)證.本研究結(jié)果可為云南省蓮藕地下莖腐敗病的防治提供科學(xué)指導(dǎo),為后續(xù)科學(xué)研究提供指引.

    4 結(jié)論

    (1)從安寧市腐敗蓮藕中分離得到6 種真菌,其中禾谷鐮刀菌為引發(fā)蓮藕腐敗病的致病菌.

    (2)在化學(xué)防治藥劑篩選中,百菌清對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制效果最好,且稀釋600 倍的百菌清可完全抑制禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢.

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