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    赤芍酒制前后化學(xué)成分差異及鎮(zhèn)痛作用研究Δ

    2022-11-28 08:46:16胡錦華翁麗麗武艷雪陳天麗長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院長春130117
    中國藥房 2022年22期
    關(guān)鍵詞:赤芍勻漿炮制

    胡錦華,翁麗麗,武艷雪,陳天麗(長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,長春 130117)

    赤芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.或川赤芍P.veitchiiLynch的干燥根,具有清熱涼血、散瘀鎮(zhèn)痛的功效,是臨床治療婦女痛經(jīng)的常用藥[1]。赤芍苦辛,性微寒,入肝經(jīng),善于涼血活血。清朝汪昂的《本草備要》曰:“酒炒用(制其寒)。婦人血分醋炒,下痢后重不炒”。從炮制作用來看,酒赤芍可以緩和藥性,令寒轉(zhuǎn)溫,也可活血化瘀,引藥上行[2]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,赤芍含有單萜及其糖苷類、三萜類、黃酮類、鞣質(zhì)類、酚酸類等化學(xué)成分,對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠有較好的鎮(zhèn)痛作用[3]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為痛經(jīng)的發(fā)病機(jī)制與雌激素及機(jī)體內(nèi)炎癥因子等的水平有關(guān),西醫(yī)臨床藥物通常通過抑制前列腺素來緩解痛經(jīng)癥狀,但都有不同程度的不良反應(yīng)和臨床應(yīng)用的局限性[4]。因此臨床上常采用中西醫(yī)結(jié)合的方法或聯(lián)合療法治療痛經(jīng),赤芍作為痛經(jīng)要藥具有重要的研究意義。

    目前,有關(guān)赤芍酒制后活性成分及藥理作用的變化缺乏系統(tǒng)研究,本試驗(yàn)采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)的定性定量分析,對(duì)比赤芍酒制前后化學(xué)成分及含量差異;同時(shí)以痛經(jīng)模型大鼠為研究對(duì)象,采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測(cè)其子宮組織勻漿中前列腺素F2α(prostaglandin F2α,PGF2α)、孕酮、一氧化氮(nitric oxide,NO)、β-內(nèi)啡肽的含量,旨在探討赤芍生品和酒制品鎮(zhèn)痛作用的差異,為酒赤芍的臨床應(yīng)用提供參考。

    1 材料

    1.1 主要儀器

    本研究所用主要儀器包括Q-TOF SYNAPT G2 HDMS型Waters Acquity UPLC儀(美國Waters公司)、JA2603B型千分之一電子天平(上海天美天平儀器有限公司)、FA1004B型萬分之一電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)、Multiskan Sky型全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)、Legend Micro型離心機(jī)(德國Eppendorf公司)等。

    1.2 主要藥品與試劑

    赤芍飲片(批號(hào)HML20190722-03)購自吉林國安藥業(yè)有限公司,經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室翁麗麗教授鑒定為毛茛科植物芍藥P.lactifloraPall.的干燥根。大鼠PGF2α、孕酮、β-內(nèi)啡肽ELISA試劑盒(批號(hào)均為202106)均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司;NO測(cè)定試劑盒(批號(hào)A013-2-1)購自南京建成生物工程研究所;苯甲酸雌二醇注射液(批號(hào)20210201,規(guī)格2 mL∶4 mg)購自寧波第二激素廠;縮宮素(批號(hào)20210407,規(guī)格2 mL∶10單位)購自吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司;布洛芬緩釋膠囊(陽性對(duì)照藥物,批號(hào)2003241,規(guī)格0.3 g)購自中美天津史克制藥有限公司;烏來糖(批號(hào)BSF210509)購自合肥巴斯夫生物科技有限公司;黃酒購自吉林省大洋酒業(yè)有限公司;水為蒸餾水。

    1.3 動(dòng)物

    SPF級(jí)Wistar雌性大鼠42只,8周齡,體質(zhì)量230~250 g,購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(遼)2020-0001。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)編號(hào)為2021218。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 酒赤芍的制備

    參照課題組前期研究工藝[5],取赤芍飲片,加黃酒拌勻(每100 g赤芍用黃酒14 g),悶潤35 min,再于120 ℃下炒制20 min,即得酒赤芍。

    2.2 赤芍酒制前后化學(xué)成分的分析

    2.2.1 供試品溶液的制備 將赤芍飲片和酒赤芍飲片粉碎成粗粉,各取約0.5 g,精密稱定,分別置于具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,稱質(zhì)量后浸泡4 h,超聲(功率250 W,頻率40 kHz)處理20 min,放冷,再稱質(zhì)量后用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,即得赤芍供試品溶液和酒赤芍供試品溶液,置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2.2 UPLC-Q-TOF-MS分析條件 色譜條件如下:以Nano ChromCore 120 C18(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)為色譜柱,以乙腈為流動(dòng)相A、0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫(0~5 min,8%A;5~10 min,8%A→15%A;10~15 min,15%A→22%A;15~20 min,22%A→30%A;20~25 min,30%A→60%A;25~30 min,60%A→80%A;30~35 min,80%A→100%A;35~40 min,100%A;40~41 min,100%A→8%A;41~50 min,8%A);流速為0.3 mL/min;柱溫為25 ℃;進(jìn)樣量為5 μL。質(zhì)譜條件如下:采用正、負(fù)離子檢測(cè)模式,電離源溫度為80 ℃,去溶劑氣溫度為150 ℃;錐孔氣和去溶劑氣均為氮?dú)猓魉俜謩e為40、500 L/h;毛細(xì)管電壓為3.0 kV,錐孔電壓為40 V,提取錐孔電壓為5.0 V;掃描范圍為100~1 000 amu,掃描時(shí)間為0.2 s。利用甲酸鈉建立質(zhì)量軸標(biāo)準(zhǔn)曲線,以亮氨酸腦啡肽進(jìn)行質(zhì)量校正以確保質(zhì)量精度和重現(xiàn)性。使用串聯(lián)方法進(jìn)行分析時(shí),使用氬氣作碰撞氣,低碰撞能為10 eV,高碰撞能為30 eV。

    2.2.3 赤芍酒制前后化學(xué)成分的分離鑒定 應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù),按“2.2.2”項(xiàng)下條件對(duì)赤芍與酒赤芍進(jìn)行檢測(cè),總離子流圖(圖1)顯示,在正、負(fù)離子模式下,赤芍和酒赤芍中各化學(xué)成分的分離度均較好、響應(yīng)均較高?;赨NIFI科學(xué)信息系統(tǒng),結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和在線數(shù)據(jù)庫對(duì)比,赤芍與酒赤芍在正、負(fù)離子模式下均鑒定出60個(gè)化學(xué)成分(表1),其中,在正離子模式下均分離鑒定出6個(gè)化學(xué)成分,包括2個(gè)鞣質(zhì)類成分,1個(gè)三萜類成分,3個(gè)揮發(fā)性成分;在負(fù)離子模式下均分離鑒定出54個(gè)化學(xué)成分,包括24個(gè)單萜及其糖苷類成分,3個(gè)三萜類成分,3個(gè)黃酮類成分,1個(gè)鞣質(zhì)類成分,8個(gè)酚酸類成分,3個(gè)糖類成分,4個(gè)揮發(fā)性成分,8個(gè)其他類成分。

    表1 赤芍酒制前后化學(xué)成分含量差異分析結(jié)果

    續(xù)表1

    2.2.4 赤芍酒制前后化學(xué)成分含量差異的分析 按以下公式計(jì)算“2.2.3”項(xiàng)下鑒定出的60個(gè)化學(xué)成分的炮制前后變化指數(shù)(表1),炮制前后的變化指數(shù)=酒赤芍離子峰面積/對(duì)應(yīng)保留時(shí)間的赤芍離子峰面積。該值接近1表示此離子峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分炮制前后含量相近,該值大于1表示此離子峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分炮制后含量增加,該值小于1表示此離子峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分炮制后含量減少[6]。結(jié)果顯示,赤芍酒制后,除芳樟醇、peduncula‐gin、丁香酸、sucrose、核糖、1′-O-benzoylsucrose、異水楊苷7個(gè)成分含量增加以外,其他成分含量均有所降低。炮制后總相對(duì)含量[(酒赤芍峰面積-赤芍峰面積)/赤芍峰面積×100%]增加最多的為糖類成分,增加了10.08%;總相對(duì)含量降低最多的為三萜類成分,降低了33.02%,降低最少的為單萜及其糖苷類成分,降低了11.44%。

    2.3 赤芍酒制前后對(duì)痛經(jīng)模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用考察

    2.3.1 赤芍和酒赤芍藥液的制備 取赤芍飲片或酒赤芍飲片適量,分別加6或8倍(mL/g)水煮2次,每次1 h,過濾,合并濾液,制成質(zhì)量濃度為1、0.25 g/mL(以生藥量計(jì))的藥液,置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.3.2 陽性對(duì)照藥液的制備 取布洛芬緩釋膠囊內(nèi)容物適量,加水充分混勻,配制成質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL的混懸液,即得。

    2.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)用±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

    2.3.4 動(dòng)物分組、造模與給藥 將42只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性對(duì)照組(布洛芬0.072 mg/g[7])和赤芍低、高劑量組(0.005、0.01 mg/g,以生藥量計(jì)[8])以及酒赤芍低、高劑量組(0.005、0.01 mg/g,以生藥量計(jì)[8]),每組6只。實(shí)驗(yàn)開始前所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。本實(shí)驗(yàn)通過苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素復(fù)制大鼠痛經(jīng)模型[9]。模型組和給藥組大鼠連續(xù)皮下注射苯甲酸雌二醇14 d,第1天和第14天注射劑量為1 mL/100 g,其余12 d注射劑量為0.5 mL/100 g,每日1次;空白組大鼠同法皮下注射等體積生理鹽水。從注射苯甲酸雌二醇第5天開始,空白組和模型組大鼠灌胃蒸餾水,給藥組大鼠分別灌胃相應(yīng)藥液,每日1次,連續(xù)11 d。各組大鼠于末次注射苯甲酸雌二醇24 h后干預(yù)給藥,再過30 min后,每只大鼠腹腔注射縮宮素2 μg,完成痛經(jīng)模型的復(fù)制。

    2.3.5 大鼠體質(zhì)量的變化 記錄各組大鼠實(shí)驗(yàn)期間的體質(zhì)量。結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組大鼠體質(zhì)量呈逐漸下降的趨勢(shì),至第15天體質(zhì)量下降22%;各給藥組大鼠體質(zhì)量呈先下降后升高的趨勢(shì),從第5天開始體質(zhì)量下降趨勢(shì)變小,且均高于模型組。

    2.3.6 大鼠扭體潛伏期的變化 記錄各組大鼠注射縮宮素后的扭體潛伏期(腹部收縮內(nèi)凹,伸展后肢)。結(jié)果(圖2)顯示,與空白組比較,模型組大鼠的扭體潛伏期顯著縮短(P<0.05)。與模型組比較,各給藥組大鼠的扭體潛伏期(除赤芍低劑量組外)均顯著延長(P<0.05),其中赤芍高劑量組和酒赤芍低劑量組大鼠的扭體潛伏期與陽性對(duì)照組接近。2.3.7 大鼠子宮組織勻漿中鎮(zhèn)痛相關(guān)指標(biāo)的變化 扭體潛伏期記錄后,各組大鼠腹腔注射20%烏來糖(0.6 mL/100 g),待麻醉后剝離出子宮,洗去血漬,用濾紙吸干。取子宮組織0.3 g,加3 mL冰冷生理鹽水,制備成10%子宮組織勻漿,置于-80 ℃冷藏保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明書測(cè)定各組大鼠子宮組織勻漿中PGF2α、孕酮、NO、β-內(nèi)啡肽的含量。結(jié)果(圖3)顯示,與空白組比較,模型組大鼠子宮組織勻漿中PGF2α含量顯著升高(P<0.05),孕酮、NO、β-內(nèi)啡肽含量均顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,各給藥組大鼠子宮組織勻漿中PGF2α(除赤芍低劑量組外)均顯著降低,孕酮(除赤芍低、高劑量組外)、NO(除赤芍低、高劑量組外)、β-內(nèi)啡肽含量均顯著升高(P<0.05)。

    3 討論

    本研究運(yùn)用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)采集質(zhì)譜數(shù)據(jù),分析化學(xué)成分信息得出,赤芍與酒赤芍中化學(xué)成分種類相同(均為60個(gè)),但是含量有差異。赤芍酒制后,萜類、黃酮類成分均有所減少,其中指標(biāo)性成分芍藥苷含量降低4.93%。赤芍味苦微寒,根據(jù)中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論,赤芍具有的清熱涼血作用與苦味中藥“能泄、能燥、能堅(jiān)”作用相符,而中藥的苦味與其所含的生物堿類、萜類、黃酮類等成分有關(guān)[10]。兒茶素是赤芍苦澀味的來源之一,酒制后兒茶素含量減少13.29%,這與炮制理論中酒赤芍清熱涼血力稍緩、炮制改變藥性相一致[11]。酒制后糖類成分有所增加,其中sucrose增加最多。其他類成分中的芳樟醇、pedunculagin、丁香酸、異水楊苷含量均有所升高。

    痛經(jīng)本質(zhì)在于氣血變化,而病機(jī)的關(guān)鍵在瘀,祛瘀則病癥消[12]。痛經(jīng)的發(fā)病機(jī)制與前列腺素、NO等變化有關(guān)。NO對(duì)痛經(jīng)具有雙向調(diào)節(jié)作用,含量升高可抑制子宮收縮,含量降低則可加重子宮收縮[13]。本研究通過考察赤芍酒制前后對(duì)痛經(jīng)模型大鼠鎮(zhèn)痛作用的影響,發(fā)現(xiàn)與模型組比較,赤芍高劑量組和酒赤芍低、高劑量組大鼠的扭體潛伏期均顯著延長,子宮組織勻漿中PGF2α均顯著降低,β-內(nèi)啡肽含量均顯著升高;酒赤芍低、高劑量組大鼠子宮組織勻漿中孕酮、NO含量均顯著升高。由此可見,酒赤芍的鎮(zhèn)痛作用較赤芍效果好。結(jié)合赤芍酒制前后化學(xué)成分變化推測(cè),酒赤芍鎮(zhèn)痛作用較赤芍效果更好,這可能與芳樟醇、pedunculagin、丁香酸、su‐crose、核糖、1′-O-benzoylsucrose、異水楊苷含量變化有關(guān)。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)酒赤芍對(duì)痛經(jīng)模型大鼠的鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于赤芍生品,這可能與赤芍酒制后芳樟醇、pe‐dunculagin、丁香酸等7個(gè)成分的含量升高有關(guān)。

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