赤芍酒制前后化學(xué)成分差異及鎮(zhèn)痛作用研究Δ

胡錦華，翁麗麗，武艷雪，陳天麗（長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117）

赤芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.或川赤芍P.veitchiiLynch的干燥根，具有清熱涼血、散瘀鎮(zhèn)痛的功效，是臨床治療婦女痛經(jīng)的常用藥[1]。赤芍苦辛，性微寒，入肝經(jīng)，善于涼血活血。清朝汪昂的《本草備要》曰：“酒炒用（制其寒）。婦人血分醋炒，下痢后重不炒”。從炮制作用來看，酒赤芍可以緩和藥性，令寒轉(zhuǎn)溫，也可活血化瘀，引藥上行[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，赤芍含有單萜及其糖苷類、三萜類、黃酮類、鞣質(zhì)類、酚酸類等化學(xué)成分，對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠有較好的鎮(zhèn)痛作用[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為痛經(jīng)的發(fā)病機(jī)制與雌激素及機(jī)體內(nèi)炎癥因子等的水平有關(guān)，西醫(yī)臨床藥物通常通過抑制前列腺素來緩解痛經(jīng)癥狀，但都有不同程度的不良反應(yīng)和臨床應(yīng)用的局限性[4]。因此臨床上常采用中西醫(yī)結(jié)合的方法或聯(lián)合療法治療痛經(jīng)，赤芍作為痛經(jīng)要藥具有重要的研究意義。

目前，有關(guān)赤芍酒制后活性成分及藥理作用的變化缺乏系統(tǒng)研究，本試驗(yàn)采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)的定性定量分析，對(duì)比赤芍酒制前后化學(xué)成分及含量差異；同時(shí)以痛經(jīng)模型大鼠為研究對(duì)象，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測(cè)其子宮組織勻漿中前列腺素F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）、孕酮、一氧化氮（nitric oxide，NO）、β-內(nèi)啡肽的含量，旨在探討赤芍生品和酒制品鎮(zhèn)痛作用的差異，為酒赤芍的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Q-TOF SYNAPT G2 HDMS型Waters Acquity UPLC儀（美國Waters公司）、JA2603B型千分之一電子天平（上海天美天平儀器有限公司）、FA1004B型萬分之一電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）、Multiskan Sky型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Legend Micro型離心機(jī)（德國Eppendorf公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

赤芍飲片（批號(hào)HML20190722-03）購自吉林國安藥業(yè)有限公司，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室翁麗麗教授鑒定為毛茛科植物芍藥P.lactifloraPall.的干燥根。大鼠PGF2α、孕酮、β-內(nèi)啡肽ELISA試劑盒（批號(hào)均為202106）均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；NO測(cè)定試劑盒（批號(hào)A013-2-1）購自南京建成生物工程研究所；苯甲酸雌二醇注射液（批號(hào)20210201，規(guī)格2 mL∶4 mg）購自寧波第二激素廠；縮宮素（批號(hào)20210407，規(guī)格2 mL∶10單位）購自吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司；布洛芬緩釋膠囊（陽性對(duì)照藥物，批號(hào)2003241，規(guī)格0.3 g）購自中美天津史克制藥有限公司；烏來糖（批號(hào)BSF210509）購自合肥巴斯夫生物科技有限公司；黃酒購自吉林省大洋酒業(yè)有限公司；水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar雌性大鼠42只，8周齡，體質(zhì)量230～250 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（遼）2020-0001。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號(hào)為2021218。

2 方法與結(jié)果

2.1 酒赤芍的制備

參照課題組前期研究工藝[5]，取赤芍飲片，加黃酒拌勻（每100 g赤芍用黃酒14 g），悶潤35 min，再于120 ℃下炒制20 min，即得酒赤芍。

2.2 赤芍酒制前后化學(xué)成分的分析

2.2.1 供試品溶液的制備 將赤芍飲片和酒赤芍飲片粉碎成粗粉，各取約0.5 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱質(zhì)量后浸泡4 h，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理20 min，放冷，再稱質(zhì)量后用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得赤芍供試品溶液和酒赤芍供試品溶液，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 UPLC-Q-TOF-MS分析條件 色譜條件如下：以Nano ChromCore 120 C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）為色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A、0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，8%A；5～10 min，8%A→15%A；10～15 min，15%A→22%A；15～20 min，22%A→30%A；20～25 min，30%A→60%A；25～30 min，60%A→80%A；30～35 min，80%A→100%A；35～40 min，100%A；40～41 min，100%A→8%A；41～50 min，8%A）；流速為0.3 mL/min；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。質(zhì)譜條件如下：采用正、負(fù)離子檢測(cè)模式，電離源溫度為80 ℃，去溶劑氣溫度為150 ℃；錐孔氣和去溶劑氣均為氮?dú)猓魉俜謩e為40、500 L/h；毛細(xì)管電壓為3.0 kV，錐孔電壓為40 V，提取錐孔電壓為5.0 V；掃描范圍為100～1 000 amu，掃描時(shí)間為0.2 s。利用甲酸鈉建立質(zhì)量軸標(biāo)準(zhǔn)曲線，以亮氨酸腦啡肽進(jìn)行質(zhì)量校正以確保質(zhì)量精度和重現(xiàn)性。使用串聯(lián)方法進(jìn)行分析時(shí)，使用氬氣作碰撞氣，低碰撞能為10 eV，高碰撞能為30 eV。

2.2.3 赤芍酒制前后化學(xué)成分的分離鑒定 應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，按“2.2.2”項(xiàng)下條件對(duì)赤芍與酒赤芍進(jìn)行檢測(cè)，總離子流圖（圖1）顯示，在正、負(fù)離子模式下，赤芍和酒赤芍中各化學(xué)成分的分離度均較好、響應(yīng)均較高?；赨NIFI科學(xué)信息系統(tǒng)，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和在線數(shù)據(jù)庫對(duì)比，赤芍與酒赤芍在正、負(fù)離子模式下均鑒定出60個(gè)化學(xué)成分（表1），其中，在正離子模式下均分離鑒定出6個(gè)化學(xué)成分，包括2個(gè)鞣質(zhì)類成分，1個(gè)三萜類成分，3個(gè)揮發(fā)性成分；在負(fù)離子模式下均分離鑒定出54個(gè)化學(xué)成分，包括24個(gè)單萜及其糖苷類成分，3個(gè)三萜類成分，3個(gè)黃酮類成分，1個(gè)鞣質(zhì)類成分，8個(gè)酚酸類成分，3個(gè)糖類成分，4個(gè)揮發(fā)性成分，8個(gè)其他類成分。

表1 赤芍酒制前后化學(xué)成分含量差異分析結(jié)果

續(xù)表1

2.2.4 赤芍酒制前后化學(xué)成分含量差異的分析 按以下公式計(jì)算“2.2.3”項(xiàng)下鑒定出的60個(gè)化學(xué)成分的炮制前后變化指數(shù)（表1），炮制前后的變化指數(shù)＝酒赤芍離子峰面積/對(duì)應(yīng)保留時(shí)間的赤芍離子峰面積。該值接近1表示此離子峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分炮制前后含量相近，該值大于1表示此離子峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分炮制后含量增加，該值小于1表示此離子峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分炮制后含量減少[6]。結(jié)果顯示，赤芍酒制后，除芳樟醇、peduncula‐gin、丁香酸、sucrose、核糖、1′-O-benzoylsucrose、異水楊苷7個(gè)成分含量增加以外，其他成分含量均有所降低。炮制后總相對(duì)含量[（酒赤芍峰面積－赤芍峰面積）/赤芍峰面積×100%]增加最多的為糖類成分，增加了10.08%；總相對(duì)含量降低最多的為三萜類成分，降低了33.02%，降低最少的為單萜及其糖苷類成分，降低了11.44%。

2.3 赤芍酒制前后對(duì)痛經(jīng)模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用考察

2.3.1 赤芍和酒赤芍藥液的制備 取赤芍飲片或酒赤芍飲片適量，分別加6或8倍（mL/g）水煮2次，每次1 h，過濾，合并濾液，制成質(zhì)量濃度為1、0.25 g/mL（以生藥量計(jì)）的藥液，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 陽性對(duì)照藥液的制備 取布洛芬緩釋膠囊內(nèi)容物適量，加水充分混勻，配制成質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL的混懸液，即得。

2.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2.3.4 動(dòng)物分組、造模與給藥 將42只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性對(duì)照組（布洛芬0.072 mg/g[7]）和赤芍低、高劑量組（0.005、0.01 mg/g，以生藥量計(jì)[8]）以及酒赤芍低、高劑量組（0.005、0.01 mg/g，以生藥量計(jì)[8]），每組6只。實(shí)驗(yàn)開始前所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。本實(shí)驗(yàn)通過苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素復(fù)制大鼠痛經(jīng)模型[9]。模型組和給藥組大鼠連續(xù)皮下注射苯甲酸雌二醇14 d，第1天和第14天注射劑量為1 mL/100 g，其余12 d注射劑量為0.5 mL/100 g，每日1次；空白組大鼠同法皮下注射等體積生理鹽水。從注射苯甲酸雌二醇第5天開始，空白組和模型組大鼠灌胃蒸餾水，給藥組大鼠分別灌胃相應(yīng)藥液，每日1次，連續(xù)11 d。各組大鼠于末次注射苯甲酸雌二醇24 h后干預(yù)給藥，再過30 min后，每只大鼠腹腔注射縮宮素2 μg，完成痛經(jīng)模型的復(fù)制。

2.3.5 大鼠體質(zhì)量的變化 記錄各組大鼠實(shí)驗(yàn)期間的體質(zhì)量。結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量呈逐漸下降的趨勢(shì)，至第15天體質(zhì)量下降22%；各給藥組大鼠體質(zhì)量呈先下降后升高的趨勢(shì)，從第5天開始體質(zhì)量下降趨勢(shì)變小，且均高于模型組。

2.3.6 大鼠扭體潛伏期的變化 記錄各組大鼠注射縮宮素后的扭體潛伏期（腹部收縮內(nèi)凹，伸展后肢）。結(jié)果（圖2）顯示，與空白組比較，模型組大鼠的扭體潛伏期顯著縮短（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠的扭體潛伏期（除赤芍低劑量組外）均顯著延長（P＜0.05），其中赤芍高劑量組和酒赤芍低劑量組大鼠的扭體潛伏期與陽性對(duì)照組接近。2.3.7 大鼠子宮組織勻漿中鎮(zhèn)痛相關(guān)指標(biāo)的變化 扭體潛伏期記錄后，各組大鼠腹腔注射20%烏來糖（0.6 mL/100 g），待麻醉后剝離出子宮，洗去血漬，用濾紙吸干。取子宮組織0.3 g，加3 mL冰冷生理鹽水，制備成10%子宮組織勻漿，置于－80 ℃冷藏保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明書測(cè)定各組大鼠子宮組織勻漿中PGF2α、孕酮、NO、β-內(nèi)啡肽的含量。結(jié)果（圖3）顯示，與空白組比較，模型組大鼠子宮組織勻漿中PGF2α含量顯著升高（P＜0.05），孕酮、NO、β-內(nèi)啡肽含量均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠子宮組織勻漿中PGF2α（除赤芍低劑量組外）均顯著降低，孕酮（除赤芍低、高劑量組外）、NO（除赤芍低、高劑量組外）、β-內(nèi)啡肽含量均顯著升高（P＜0.05）。

3 討論

本研究運(yùn)用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，分析化學(xué)成分信息得出，赤芍與酒赤芍中化學(xué)成分種類相同（均為60個(gè)），但是含量有差異。赤芍酒制后，萜類、黃酮類成分均有所減少，其中指標(biāo)性成分芍藥苷含量降低4.93%。赤芍味苦微寒，根據(jù)中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論，赤芍具有的清熱涼血作用與苦味中藥“能泄、能燥、能堅(jiān)”作用相符，而中藥的苦味與其所含的生物堿類、萜類、黃酮類等成分有關(guān)[10]。兒茶素是赤芍苦澀味的來源之一，酒制后兒茶素含量減少13.29%，這與炮制理論中酒赤芍清熱涼血力稍緩、炮制改變藥性相一致[11]。酒制后糖類成分有所增加，其中sucrose增加最多。其他類成分中的芳樟醇、pedunculagin、丁香酸、異水楊苷含量均有所升高。

痛經(jīng)本質(zhì)在于氣血變化，而病機(jī)的關(guān)鍵在瘀，祛瘀則病癥消[12]。痛經(jīng)的發(fā)病機(jī)制與前列腺素、NO等變化有關(guān)。NO對(duì)痛經(jīng)具有雙向調(diào)節(jié)作用，含量升高可抑制子宮收縮，含量降低則可加重子宮收縮[13]。本研究通過考察赤芍酒制前后對(duì)痛經(jīng)模型大鼠鎮(zhèn)痛作用的影響，發(fā)現(xiàn)與模型組比較，赤芍高劑量組和酒赤芍低、高劑量組大鼠的扭體潛伏期均顯著延長，子宮組織勻漿中PGF2α均顯著降低，β-內(nèi)啡肽含量均顯著升高；酒赤芍低、高劑量組大鼠子宮組織勻漿中孕酮、NO含量均顯著升高。由此可見，酒赤芍的鎮(zhèn)痛作用較赤芍效果好。結(jié)合赤芍酒制前后化學(xué)成分變化推測(cè)，酒赤芍鎮(zhèn)痛作用較赤芍效果更好，這可能與芳樟醇、pedunculagin、丁香酸、su‐crose、核糖、1′-O-benzoylsucrose、異水楊苷含量變化有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)酒赤芍對(duì)痛經(jīng)模型大鼠的鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于赤芍生品，這可能與赤芍酒制后芳樟醇、pe‐dunculagin、丁香酸等7個(gè)成分的含量升高有關(guān)。