卵巢癌液體活檢技術(shù)研究進(jìn)展

王璐，韓世愈

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，哈爾濱150001)

卵巢癌是癌癥死亡的第五大常見原因，也是婦科癌癥死亡的最主要原因[1]。通常當(dāng)腫瘤局限于卵巢時，卵巢癌治愈率達(dá)90%，而事實上約75%的卵巢癌[2]在晚期才確診，此時腫瘤早已發(fā)生轉(zhuǎn)移，因而治愈率大大降低[2]。臨床上常見的檢測卵巢癌的方法有腫瘤標(biāo)志物[如血清癌抗原125(cancer antigen 125，CA125)、人附睪蛋白4]聯(lián)合超聲、CT、磁共振成像等影像學(xué)檢查，以及近年來應(yīng)用較多的乳腺癌易感基因1/2(breast cancer susceptibility gene 1/2,BRCA1/2)基因檢測[3]，其中最常用的檢測手段是血清CA125聯(lián)合經(jīng)陰道超聲檢查，但有研究認(rèn)為兩者聯(lián)合對卵巢癌進(jìn)行早期篩查并不能降低死亡率[4]。截至目前，組織活檢仍是診斷卵巢癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但其具有侵襲性，且成本高、耗時長，并有造成腫瘤播散的風(fēng)險，因此尋找新的、非侵入性的檢查方法以期早期診斷卵巢癌、識別卵巢癌高風(fēng)險患者、實時監(jiān)測治療反應(yīng)以及評估預(yù)后是臨床亟待解決的問題。液體活檢是一種非侵入性診斷方法，是檢測血液、尿液等體液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、外泌體及腫瘤相關(guān)血小板等循環(huán)生物標(biāo)志物，液體活檢較傳統(tǒng)活檢更加安全、方便。以往認(rèn)為，卵巢癌的主要轉(zhuǎn)移途徑是直接蔓延、腹腔種植和淋巴轉(zhuǎn)移，但現(xiàn)有研究表明血源性轉(zhuǎn)移是卵巢癌轉(zhuǎn)移的另一種重要方式[5]。現(xiàn)就卵巢癌液體活檢常用的標(biāo)志物進(jìn)行綜述，以期為卵巢癌臨床診療工作提供幫助。

1 液體活檢概述

液體活檢是以血液、唾液、尿液、腦脊液、胸腔積液及腹水等體液為檢測樣本獲取腫瘤相關(guān)信息的技術(shù)，主要檢測內(nèi)容包括CTC、ctDNA、腫瘤細(xì)胞來源外泌體和腫瘤相關(guān)血小板等。液體活檢被定義為一種早期癌癥檢測方法，其中CTC和ctDNA已被美國食品藥品管理局批準(zhǔn)用于臨床[6]。組織活檢是臨床診斷癌癥應(yīng)用最多的檢查方法，盡管其能提供有關(guān)腫瘤性質(zhì)的信息，但單次活檢并不足以描述腫瘤的遺傳異質(zhì)性，也無法提供腫瘤基因組的全面信息，除對患者有侵入性外，還存在固有風(fēng)險和潛在并發(fā)癥，甚至可能造成腫瘤擴(kuò)散，因此組織活檢并不適用于腫瘤的早期篩查，而液體活檢不僅能在癥狀出現(xiàn)之前發(fā)現(xiàn)癌癥，還能用于制訂癌癥晚期治療決策[7]。液體活檢具有非侵入性、準(zhǔn)確性高、取樣風(fēng)險低、取樣限制少、樣品制備簡便等優(yōu)勢，并可反映出腫瘤基因組的全部信息[8]，其在卵巢癌的篩查和診斷中有重要作用。

1.1CTC CTC是指因自發(fā)或診療操作而從實體腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落至外周循環(huán)中，少數(shù)仍具有高活性、能逃離機(jī)體免疫損傷而存活，并通過血液運(yùn)行轉(zhuǎn)移到其他組織器官并形成轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞。1998 年，CTC首次從血液中分離并被證實與腫瘤病理分期相關(guān)[9]。此后，CTC被越來越多地應(yīng)用于臨床，并在更多實體上皮癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶中發(fā)現(xiàn)[10]。CTC的逃逸機(jī)制目前尚不明確，但可以肯定的是同一類型癌癥的不同患者，甚至同一患者的癌細(xì)胞之間也存在較大的分子和細(xì)胞異質(zhì)性[11]。血液中CTC數(shù)量極少，在晚期癌癥患者的血液循環(huán)中，每10億個血細(xì)胞中才有1個CTC，而液體活檢中CTC檢測除了計數(shù)單個CTC評估癌癥外，還能提示CTC的分子表征，包括治療靶點[12]和耐藥機(jī)制[13]。CTC的半衰期很短，大約4 h，這一特性決定CTC的檢測結(jié)果具有較強(qiáng)的實時反應(yīng)性，可作為動態(tài)監(jiān)控的一種靶標(biāo)物，同時這一特性也說明，除了活性CTC，外周血中還能檢測到破碎或凋亡的CTC，這使得CTC的檢測結(jié)果存在一定誤差，但只有活性CTC對評價腫瘤轉(zhuǎn)移有意義[14]。

1.2ctDNA ctDNA是指腫瘤細(xì)胞釋放到血液系統(tǒng)中的循環(huán)游離DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)。1948年Mandel和Metais[15]首先報道了血液中的cfDNA，1966年在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中發(fā)現(xiàn)了cfDNA的存在[16]，但直到1977年在胰腺癌患者中發(fā)現(xiàn)cfDNA水平的升高，cfDNA才進(jìn)入腫瘤學(xué)領(lǐng)域[17]，而從胰腺癌患者血漿樣本中檢測到ctDNA中的KARS基因突變才使人們真正意識到ctDNA作為腫瘤生物標(biāo)志物的適用性[18]。目前ctDNA是液體活檢中最常用的血源性標(biāo)志物之一，但由于ctDNA高度碎片化、半衰期短且含量極低等，其檢測技術(shù)需要極高的特異性和敏感性[19]。近年來，隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步和優(yōu)化，最終形成了目前最常用的3種ctDNA檢測技術(shù):富集聚合酶鏈反應(yīng)、數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)和下一代測序技術(shù)[20]。

1.3外泌體 外泌體是生理或病理狀態(tài)下包括正常細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞等幾乎所有類型細(xì)胞經(jīng)胞吐作用釋放到細(xì)胞外的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的納米級小囊泡，直徑為40～100 nm[21]。外泌體是各種從正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞脫落下來的膜囊泡，幾乎存在于所有體液(血液、尿液、腹水、母乳等)中，尤其是血液，外泌體不僅是細(xì)胞間通訊的基本介質(zhì)，還調(diào)節(jié)并參與包括癌癥在內(nèi)的眾多生理和病理過程[22]，且越來越多的研究提示外泌體可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移以及血管生成，介導(dǎo)腫瘤免疫應(yīng)答[23]，激發(fā)化療抗性[24]。外泌體內(nèi)含有大量細(xì)胞來源的分子，包括蛋白質(zhì)、鞘磷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂和其他脂類以及大量核酸物質(zhì)[如微RNA(microRNA,miRNA/miR)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、信使RNA等]，這些分子在細(xì)胞遷移、入侵及蛋白質(zhì)復(fù)合物定位中發(fā)揮作用[25]。與CTC相似，外泌體由于攜帶了特異性核酸和蛋白質(zhì)，在研究中應(yīng)用多種標(biāo)志物結(jié)合[26]以及反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增技術(shù)檢測RNA[27]作為主要檢測手段。miRNA是一類內(nèi)源性表達(dá)的非編碼單鏈小RNA，長度為19～25個核苷酸，主要通過抑制翻譯或降解靶標(biāo)信使RNA進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，可作為腫瘤抑制因子或致癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在卵巢癌的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[28]。外泌體可將miRNA包裹其中，對抗富含RNA酶的血液環(huán)境，保護(hù)miRNA運(yùn)輸。lncRNA由200多個核苷酸組成，參與多種關(guān)鍵的生物學(xué)行為，包括印跡基因組位點、塑造染色體構(gòu)型、調(diào)節(jié)酶活性等[29]。有研究表明，lncRNA通過與其他細(xì)胞大分子(包括DNA、RNA、蛋白質(zhì))相互作用驅(qū)動多種重要的癌癥表型[30]。在卵巢癌患者中，miRNA和lncRNA是研究和分析的主要外泌體成分，而磷脂酰絲氨酸、聚糖和糖蛋白等其他生物活性分子也可作為外泌體部分進(jìn)行評估[31]。由于外泌體具有分離試劑盒可廣泛獲得、存在特異性標(biāo)志物、循環(huán)穩(wěn)定性以及外泌體核酸與腫瘤核酸的精確表達(dá)等優(yōu)勢，與其他生物標(biāo)志物相比，外泌體在液體活檢技術(shù)中應(yīng)用前景更廣闊[32]。

2 常用液體活檢技術(shù)在卵巢癌中的應(yīng)用

2.1CTC在卵巢癌中的應(yīng)用 目前已有多種方法利用CTC與健康循環(huán)細(xì)胞在物理、生物及功能特征等方面的差異對CTC進(jìn)行富集、分離和鑒定[33]，其中CellSearch?平臺[34]是美國食品藥品管理局唯一批準(zhǔn)的臨床應(yīng)用的CTC。此外，其他方法雖未獲得臨床批準(zhǔn)但也用于包括上皮性卵巢癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤實驗室CTC的檢測[35-37]。Suh等[35]收集87例術(shù)前未明確附件包塊性質(zhì)患者的血液標(biāo)本行CTC檢測，與其他術(shù)前診斷方法(如血清CA125、卵巢癌惡性腫瘤風(fēng)險算法、惡性腫瘤風(fēng)險指數(shù)、CT或磁共振成像)相比，CTC檢測在發(fā)現(xiàn)早期癌癥(Ⅰ期和Ⅱ期)方面更敏感，提示術(shù)前CTC檢測不僅在區(qū)分附件腫塊良惡性方面具有重要作用，還有助于提高癌癥的早期篩查率。Zhang等[36]收集109例上皮性卵巢癌患者的211份血液樣本，采用免疫磁珠篩選法檢測CTC，并對其中51例患者的153份血液樣本同時行CTC和CA125檢測發(fā)現(xiàn)，在90%的初診患者中檢測出CTC，且CTC的數(shù)量與分期有關(guān)，ⅠA期和ⅠB期患者CTC陽性率遠(yuǎn)高于CA125陽性率，提示CTC檢測在診斷早期上皮性卵巢癌方面優(yōu)于CA125檢測，同時也提示CTC檢測可用于早期上皮性卵巢癌的篩查。Lou等[37]收集49例新診斷為盆腔腫塊女性的全血，比較術(shù)后經(jīng)組織病理學(xué)診斷為卵巢癌的患者中CTC的存在情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，良性盆腔腫塊患者血液中不存在CTC；診斷為卵巢癌的患者中有17%存在CTC，且存在CTC的卵巢癌患者均處于Ⅲ期或Ⅳ期；其他腫瘤卵巢轉(zhuǎn)移者中有80%存在CTC，說明與原發(fā)卵巢癌相比，CTC在其他癌癥卵巢轉(zhuǎn)移者中更為普遍，提示可根據(jù)CTC的數(shù)量和存在與否區(qū)分良性疾病、卵巢癌和其他癌癥卵巢轉(zhuǎn)移。Banys-Paluchowski等[38]選取43例癌癥患者(其中34例卵巢癌、5例輸卵管癌和4例原發(fā)性腹膜癌)分別給予標(biāo)準(zhǔn)化療方案治療，并于化療前、化療3個周期及化療6個周期后使用CellSearch?系統(tǒng)行CTC檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化療后CTC計數(shù)迅速下降，提示CTC檢測可用來監(jiān)測化療前后病情變化以及評估化療療效。但鑒于全身治療期間CTC計數(shù)下降迅速，提示CTC可能不能識別出具有特定復(fù)發(fā)風(fēng)險的患者，因此CTC檢測鑒別實體腫瘤的潛力還需要進(jìn)一步研究。

2.2ctDNA在卵巢癌中的應(yīng)用 ctDNA特異性突變檢測是卵巢癌非常重要的液體活檢方法。體細(xì)胞TP53基因突變是高級別漿液性卵巢癌的定義特征，Parkinson等[39]對318例高級別漿液性卵巢癌患者治療前的ctDNA進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ctDNA與腫瘤體積呈正相關(guān)；對于腹水患者，引流出癌性腹水后，ctDNA與腫瘤體積的相關(guān)性增強(qiáng)，化療1個周期后TP53最小等位基因頻率≤60%與較快的腫瘤進(jìn)展時間相關(guān)。以上結(jié)果為ctDNA成為高級別漿液性卵巢癌高度特異的早期分子標(biāo)志物提供了依據(jù)，但未來還需要進(jìn)行更深入研究。Balaji等[40]對包括卵巢癌在內(nèi)的180例癌癥患者的血漿樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，手術(shù)或組織活檢前患者血漿中ctDNA的水平與總體生存相關(guān)，高水平ctDNA與不良生存結(jié)局相關(guān)。以上研究提示，ctDNA有可能成為癌癥各階段制訂治療決策和管理患者的強(qiáng)大工具。此外，來自約翰霍普金斯大學(xué)的研究人員在2018年提出了一種名為CancerSEEK的ctDNA檢測方法，他們利用該方法對1 005例非轉(zhuǎn)移、特定器官腫瘤患者以及812例無癌癥史的健康者進(jìn)行單一的血液檢測(16個基因和8個蛋白)，同時評估了8種早期癌癥(卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌、肺癌和乳腺癌)患者中ctDNA的情況，結(jié)果顯示在8種癌癥中，CancerSEEK檢測的陽性中位數(shù)為70%，ctDNA檢測卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌以及食管癌5種癌癥的靈敏度為69%～98%，其中卵巢癌為98%，CancerSEEK檢測的特異度大于99%，812例健康者中有7例檢測為假陽性。由此推測，ctDNA檢測可用于卵巢癌的早期篩查[41]。但該項研究也存在局限性，如僅使用健康者作為對照樣本，在真正的癌癥篩查環(huán)境中，一些患者由于患有炎癥或其他疾病，可能會導(dǎo)致假陽性率高于此研究結(jié)果，因此該方法距投入臨床應(yīng)用還有一定距離。ctDNA除應(yīng)用于卵巢癌的早期篩查外，還能為卵巢癌靶向治療藥物選擇提供依據(jù)，推動靶向治療發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，在鉑耐藥或難治性高級別漿液性卵巢癌中檢測到BRCA回復(fù)突變，而BRCA回復(fù)突變與多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶抑制劑治療效果降低有關(guān)[42]。ctDNA作為一種非侵入性檢測方法可以及時有效地檢測到BRCA回復(fù)突變，從而預(yù)測多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶抑制劑耐藥，并有可能提供有關(guān)腫瘤異質(zhì)性的信息。

2.3外泌體在卵巢癌中的應(yīng)用 Sherman-Samis等[43]在卵巢癌患者的滲出液中成功檢測到含有Nanog蛋白的外泌體，含有Nanog蛋白的外泌體可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的侵襲、遷移，并提高基質(zhì)金屬蛋白酶9的活性。Wang等[44]發(fā)現(xiàn)，卵巢癌來源的外泌體miR-205能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，抑制凋亡，并加速癌細(xì)胞的遷移和侵襲。腫瘤血管生成是腫瘤侵襲性的重要特征，其能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移。有研究表明，外泌體miR-205可通過誘導(dǎo)腫瘤血管生成促進(jìn)卵巢癌轉(zhuǎn)移[45]。近年來，有研究報道了卵巢癌患者血液樣本中的lncRNA(如貓白血病病毒C亞類受體1反義RNA1[46]、用于激酶活化的長基因間非編碼RNA[47]、反義缺氧誘導(dǎo)因子[48])參與了卵巢癌的發(fā)生和進(jìn)展，通過檢測癌癥相關(guān)基因可調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲，其中一些有可能成為卵巢癌診斷和預(yù)測預(yù)后的生物標(biāo)志物或治療靶標(biāo)。Qiu等[49]發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢癌循環(huán)外泌體中屬于lncRNA的人類肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1可促進(jìn)血管生成，其水平也與患者預(yù)后相關(guān)。另一項研究證明，卵巢癌細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡中的miR-141-3p可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成[50]。Cao等[51]研究表明，外泌體中的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1可使宿主卵巢癌細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性。Kanlikilicer等[52]發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌來源的外泌體中表達(dá)的miR-1246通過影響M2型巨噬細(xì)胞，介導(dǎo)卵巢癌中紫杉醇耐藥。但并非所有外泌體均能起到促進(jìn)作用，有研究表明，外泌體miR-6126是一種腫瘤抑制因子，可降低體外卵巢癌細(xì)胞的侵襲性[53]。此外，外泌體中屬于跨膜糖蛋白的去整合素金屬蛋白酶15也起著腫瘤抑制劑的作用[54]。

以上來源于卵巢癌的外泌體對于卵巢癌的早期診斷具有較高的參考價值，但這些生物標(biāo)志物進(jìn)入臨床前還需進(jìn)一步驗證。

2.4腫瘤相關(guān)血小板在卵巢癌中的應(yīng)用 血小板是起源于骨髓的循環(huán)無核細(xì)胞碎片，在止血和傷口愈合中起著至關(guān)重要的作用。近年來發(fā)現(xiàn)血小板在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，在腫瘤生長過程中，血小板與腫瘤細(xì)胞相互作用后，導(dǎo)致的與腫瘤相關(guān)的生物分子轉(zhuǎn)移和血小板激活可誘導(dǎo)前信使RNA的特異性拼接，該剪接事件還依賴于腫瘤、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的刺激[55]。因此，腫瘤特異性剪接的前信使RNA和攝取的生物分子(包括血小板中的信使RNA)具有診斷癌癥的潛在價值[55]。Cho等[56]發(fā)現(xiàn)，將血小板輸注到患有卵巢原位癌的小鼠體內(nèi)可增加腫瘤細(xì)胞的增殖指數(shù)，表明血小板對腫瘤細(xì)胞有促增殖作用。研究發(fā)現(xiàn)，與血小板計數(shù)正常的卵巢癌患者相比，伴有血小板增多癥的卵巢癌患者的腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)更高，表明血小板在體內(nèi)外均可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，這拓展了對血小板促進(jìn)腫瘤進(jìn)展機(jī)制的理解。Best等[57]從健康個體中檢測出腫瘤相關(guān)血小板，其區(qū)分惡性、轉(zhuǎn)移性腫瘤患者的準(zhǔn)確度為96%，分析其RNA圖譜變化，成功定位原發(fā)腫瘤，準(zhǔn)確度為71%，提示腫瘤相關(guān)血小板中存在顯著的腫瘤類型特異性剪接。以上研究表明，血小板增多、腫瘤相關(guān)血小板及RNA譜都可能成為癌癥篩查、診斷、預(yù)后以及治療監(jiān)測的有效生物標(biāo)志物。目前關(guān)于腫瘤相關(guān)血小板在卵巢癌中適用性的評估尚處于起步階段，需要進(jìn)一步的臨床試驗來驗證卵巢癌與這些特征之間的相關(guān)性。

3 小 結(jié)

盡管對卵巢癌進(jìn)行了廣泛的研究，但缺乏特異的診斷和預(yù)后評估方面的生物標(biāo)志物是導(dǎo)致卵巢癌患者生存率低下的原因之一。液體活檢是臨床腫瘤學(xué)的一項突破性技術(shù)，在篩查和診斷卵巢癌方面有巨大潛力，但將其應(yīng)用于臨床前還存在以下問題:①技術(shù)限制，如分離和定量過程的標(biāo)準(zhǔn)化、分析前后的質(zhì)量控制以及基礎(chǔ)分析的驗證；②確定生物標(biāo)志物和潛在的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后，其臨床意義(對早期發(fā)現(xiàn)、治療效果和生存率的影響)必須在更大樣本量中驗證。通過不斷克服應(yīng)用限制，液體活檢技術(shù)在卵巢癌的篩查、診斷及預(yù)后評估等方面的應(yīng)用前景將更加廣闊。