七氟醚后處理對(duì)缺血再灌注大鼠心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的影響及可能機(jī)制

秦佳月 朱志鵬 周紅梅 路 建 吳 城

研究表明，臨床的各種心肌缺血再灌注損傷往往伴隨著心肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡的病理過(guò)程[1-3]。七氟醚適應(yīng)性干預(yù)對(duì)重要的臟器缺血再灌注損傷具有一定保護(hù)作用，但是同時(shí)也帶來(lái)了心臟之外的副作用[4-5]。例如可以誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起幼腦發(fā)育障礙、細(xì)胞凋亡和學(xué)習(xí)記憶功能下降[6-7]。為了明確七氟醚是否是通過(guò)干預(yù)心肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而調(diào)控MIRI，本研究對(duì)缺血再灌注模型大鼠采用七氟醚后處理，研究心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)程度，探索可能的分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 55 只SPF 級(jí)雌性SD 大鼠（10 周齡），體質(zhì)量（250±17）g，購(gòu)買(mǎi)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，自由飲食，常規(guī)飼養(yǎng)于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（浙）2017-0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（浙）2019-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證：20220209Aazz0100018463。

1.2 細(xì)胞 H9C2 大鼠胚胎心肌細(xì)胞株購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司（procell，批號(hào)KG444），傳代小于2 代。

1.3 試劑與儀器 七氟醚購(gòu)于上海恒瑞醫(yī)藥有限公司（批號(hào)16030731）。DMEM 培養(yǎng)基（gibco 公司，批號(hào)C11995500BT），胎牛血清（FBS，四季青公司，批號(hào)11011），青霉素/鏈霉素（P/S，gibco 公司，批號(hào)15140-12），胰蛋白酶（浦泰生物，批號(hào)9002-07-7），二甲基亞砜（DMSO，Gibco 公司，批號(hào)D12345），Trizol（美國(guó)Invitrogen 公司，批號(hào)15596026），乳酸脫氫酶（LDH）（南京建成生物工程研究所，批號(hào)A020-1），anti-GRP78 抗體（Abcam 公司，批號(hào)ab21685）、anti-CHOP 抗體（Abcam 公司,批號(hào)ab11419）；β-actin 單克隆抗體（華安生物，批號(hào)33036M），RNA 引物（擎科生物科技公司），逆轉(zhuǎn)錄和qPCR 試劑盒（南京諾唯贊公司，批號(hào)R223-01，Q311-02）。所用儀器主要有：CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司，HERACELL 240iC02），離心機(jī)（SorvMl STl6），酶標(biāo)儀（Muhiskan GO），倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Carl Zeiss 公司；Axio Vert.A1）；MIC-101 細(xì)胞缺氧裝置（美國(guó)Billups-Rothenberg 公司，MIC-101），核酸蛋白定量檢測(cè)儀（Eppendorf，Gemany），Western 電泳、轉(zhuǎn)膜、發(fā)光和分析系統(tǒng)（北京六一儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案 模型組取大鼠25 只，隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（sham）和2、4、6、8 h 缺血再灌注組（I/R），每組各5 只。麻醉后對(duì)照組大鼠行心臟左冠狀動(dòng)脈前降支放線，但是不結(jié)扎。I/R 組大鼠分別于結(jié)扎血管缺血30 min 之后進(jìn)行再灌注2、4、6 和8 h，制造在體心臟左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎缺血再灌注動(dòng)物模型，獲取心肌損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)最理想模型參數(shù)；實(shí)驗(yàn)組取大鼠30 只，隨機(jī)數(shù)字表法分為sham組、I/R 組、七氟醚后處理組（sevoP，分為2.5%、3.0%亞組）、4-苯基丁酸（4-PBA）復(fù)合七氟醚組（4-PBA+2.5%、3.0% sevoP 組），每組各5 只。sevoP 組大鼠于缺血完成后通過(guò)七氟醚揮發(fā)罐吸入七氟醚和氧氣的混合氣體，通過(guò)特異密封性的口罩置于大鼠口鼻，吸入相應(yīng)濃度和時(shí)間后單純氧氣洗脫七氟醚5 min，松開(kāi)結(jié)扎線至規(guī)定時(shí)間。4-PBA 干預(yù)組的大鼠在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行4-PBA 腹腔注射（300 mg/kg，造模前1 h 給予），后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)程序。再灌注時(shí)間結(jié)束即刻處死大鼠，取頸動(dòng)脈血，取心尖和心臟組織，檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的蛋白、mRNA 表達(dá)（GRP78、CHOP）。

2.2 細(xì)胞模型及實(shí)驗(yàn)方案 H9C2 細(xì)胞放入DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS 和1%P/S）于37 ℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，過(guò)夜，當(dāng)細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿底面積達(dá)到80%以上時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，并按1∶3 進(jìn)行傳代或進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，傳代不高于10 代。采用課題組前期的缺氧/復(fù)氧模型[8]，將H9C2 細(xì)胞培養(yǎng)至密度為70%左右，按細(xì)胞密度為4×105/mL 接種于6 孔板，每組3 個(gè)復(fù)孔，不含血清培養(yǎng)，放入含5%CO2，和95%N2密閉缺氧罐中缺氧3 h；之后由七氟醚揮發(fā)罐導(dǎo)入相應(yīng)濃度的七氟醚30 min，最后換含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，常氧條件下培養(yǎng)3 h，對(duì)照組常氧條件下培養(yǎng)。siSERCA 引物設(shè)計(jì)由擎科生物公司設(shè)計(jì)，合成3 對(duì)引物（預(yù)實(shí)驗(yàn)中最有效的一對(duì)為：F，CCUCCUAGAAGGCCGAUACUU；R，AAGUAUCGGCCUUCUAGGAGG）和1 對(duì)ncSERCA 陰性對(duì)照，心肌細(xì)胞造模前48 h 進(jìn)行siSERCA 基因敲低實(shí)驗(yàn)，敲低效率大于80%以上的細(xì)胞進(jìn)入后續(xù)H/R 實(shí)驗(yàn)。

2.3 組織樣本石蠟切片HE 染色 心臟組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。制作4 μm 厚的HE 石蠟切片，切片用蘇木精和伊紅（HE）染色，并進(jìn)行倒置光學(xué)顯微鏡檢查。另取樣本脫水后用環(huán)氧樹(shù)脂浸泡包埋，制作超薄切片，雙重染色后置于H-600 透射電鏡下觀察。

2.4 LDH 和cTnI 濃度檢測(cè) 每組5 只大鼠于不同再灌注結(jié)束時(shí)間點(diǎn)，CO2氣體處死后取頸動(dòng)脈血2 mL，3000 轉(zhuǎn)離心10 min 后取上層血清。H9C2 細(xì)胞收集上清，12000 轉(zhuǎn)離心5 min 備用。樣本采用大鼠cTnI 和LDH 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（RD 公司，美國(guó)），酶標(biāo)儀上機(jī)測(cè)量450 nm 波長(zhǎng)下的吸光度值進(jìn)行分析。

2.5 RT-PCR 分析檢測(cè)mRNA 表達(dá) 引物由擎科生物公司設(shè)計(jì)并合成，如下：GRP78 引物：正義鏈5'-AACCCAGATGAAACTGTAGCA-3'，反義鏈5'-ACATCAAGCAGAACCAGGTCAC-3'；CHOP 引物：正義鏈5'-AGCTGAGTCTCTGCCTTTCG-3'，反義鏈5'-TGTGGTCTCTACCTCCCTGG-3'；GAPDH 引物：正義鏈5'-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3'，反義鏈5'-CCAATATGATTCCACCCATG-3'。組織和細(xì)胞樣本經(jīng)各種處理后，按照RNA 提取試劑盒的步驟說(shuō)明，以Trizol 法裂解細(xì)胞，之后轉(zhuǎn)移至EP 管中離心，加入氯仿，放置、離心，分層后上層轉(zhuǎn)移至有異丙醇的EP 管中，提取各組細(xì)胞總RNA，取沉淀溶于水中，分光光度計(jì)測(cè)定濃度，測(cè)定各組OD260/280,測(cè)定純度，-80℃超低溫冰箱儲(chǔ)存。符合純度的用反轉(zhuǎn)錄劑盒將1 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA 各組分別取1 μL 在PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增,設(shè)置一定的PCR反應(yīng)條件變性、退火、延伸，觀察溶解曲線。通過(guò)目的基因CT 值/內(nèi)參GAPDH，計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)。每組3 復(fù)孔，重復(fù)3 次。

2.6 Western blot 蛋白檢測(cè) 組織和細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，加入適量體積的蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解15 min，離心后取上清，直接用于SDS buffer 蛋白電泳上樣或凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。利用BCA試劑盒檢測(cè)各組蛋白濃度，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。根據(jù)分離膠的不同濃度參考目的蛋白分子量的大小，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。封膠、蛋白上樣、調(diào)節(jié)電壓開(kāi)始電泳。接著備膜、切膠、裝膜、轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉液中封閉，結(jié)合特異性一抗過(guò)夜、二抗孵育后，搖床上洗滌，進(jìn)行ECL 化學(xué)發(fā)光曝光，拍照。以β-actin 為內(nèi)參，各蛋白產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)量=蛋白產(chǎn)物電泳條帶光密度值/βactin 產(chǎn)物電泳條帶凈光密度值。通過(guò)ImageProPlus軟件對(duì)發(fā)光條帶進(jìn)行定量分析，記錄各組數(shù)據(jù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，計(jì)量資料以D'Agostino and Pearson omnibus 法作變量正態(tài)性分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey 法；非正態(tài)分布變量采用K-W 非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型建立 sham 組大鼠缺血0.5 h后，外周血平均cTnI 濃度為（2.72±0.61）ng/mL，LDH濃度為（3.44±0.54）U/L，GRP78 相對(duì)表達(dá)量為（0.38±0.18），所有大鼠均存活。與sham 手術(shù)組比較，I/R 組的大鼠心肌損傷程度于缺血0.5 h 再灌注2 h 后明顯增加，表現(xiàn)為血清LDH、cTnI 濃度的急劇升高（P＜0.05）；而不同模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78 的表達(dá)顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)直到缺血0.5 h 再灌注6 h后才表現(xiàn)明顯，與sham 組比較，0.5/6 h 組和0.5/8 h模型組心肌組織GRP78 表達(dá)的顯著增高（P＜0.05）。其中，0.5/6 h 模型組和0.5/8 h 模型組分別死亡大鼠1 只和2 只，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），后續(xù)將以0.5/6 h 為實(shí)驗(yàn)條件，見(jiàn)表1。

表1 不同條件下大鼠心肌缺血再灌注損傷程度和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激變化

3.2 各組大鼠心肌病理形態(tài)改變 0.5/6 h 實(shí)驗(yàn)條件下大鼠心肌及心尖組織的HE 染色和電鏡下形態(tài)改變顯示（見(jiàn)圖1）：與sham 組（圖1a）相比，I/R 組（圖1b）大鼠的心肌組織規(guī)則紊亂，斷裂，水腫，心肌細(xì)胞壞死增多；電鏡下sham 組（圖1c）心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)大致正常，I/R 組電鏡下（圖1d）的心肌纖維排列紊亂,細(xì)胞腫脹,細(xì)胞間邊界模糊，心肌細(xì)胞呈現(xiàn)狀壞死改變。

圖1 sham 組和I/R 組大鼠心肌組織HE 染色情況和電鏡下形態(tài)學(xué)改變

3.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)各組大鼠心肌組織GRP78、CHOP 基因和蛋白表達(dá)水平 與sham 組比較，I/R 組大鼠經(jīng)歷0.5/6 h I/R 后心肌組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78、CHOP 的基因和蛋白顯著高表達(dá)（P＜0.05）；與I/R 組比較，sevoP2.5、sevoP3.0 七氟醚后處理干預(yù)組大鼠心肌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被有效抑制，表現(xiàn)在明顯降低0.5/6 h 實(shí)驗(yàn)條件下產(chǎn)生的GRP78、CHOP 的mRNA 和蛋白高表達(dá)，其中2.5%與3.0%組間差異不明顯（P＞0.05）；與sevoP2.5、sevoP3.0 比較，通過(guò)4-PBA 對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的抑制，4-PBA+sevoP2.5、4-PBA+sevoP3.0 組的GRP78、CHOP 表達(dá)被逆轉(zhuǎn)，七氟醚的保護(hù)作用被削弱，表現(xiàn)為與sevoP2.5 或sevoP3.0組比較，4-PBA 干預(yù)組mRNA 表達(dá)顯著增高，見(jiàn)表2、圖2。

圖2 七氟醚后處理對(duì)缺血再灌注大鼠心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

表2 七氟醚后處理對(duì)大鼠心肌GRP78 和CHOP mRNA表達(dá)的影響（）

表2 七氟醚后處理對(duì)大鼠心肌GRP78 和CHOP mRNA表達(dá)的影響（）

注：sham 組大鼠麻醉后行心臟左冠狀動(dòng)脈前降支放線，但是不結(jié)扎；I/R 組大鼠于結(jié)扎血管缺血30 min 之后進(jìn)行再灌注6 h，2.5%、3%sevoP 組動(dòng)物在行微創(chuàng)左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎后即刻，吸入相應(yīng)濃度的七氟醚15 min 后洗脫，4-PBA 干預(yù)組的大鼠在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行4-PBA腹腔注射（300 mg/kg，造模前1 h 給予）；GRP78 為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；CHOP 為C/EBP 同源蛋白；與sham 比較，aP＜0.05；與H/R 組比較，bP＜0.05；與sevoP2.5 組比較，cP＜0.05；與sevoP3.0 組比較，dP＜0.05

3.4 體外實(shí)驗(yàn)各組大鼠心肌細(xì)胞GRP78、CHOP 基因和蛋白表達(dá)水平 與Control 組比較，3/3 h 的H/R損傷可能引起顯著的細(xì)胞上清中LDH 濃度上升，以及細(xì)胞裂解成分的GRP78 和CHOP 蛋白表達(dá)顯著升高（分別升高4.1 和4 倍），以2.5%七氟醚飽和后處理措施能夠抑制過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[（GRP78：（2.46±0.50）比（1.52±0.38）；CHOP：（2.1±0.43）比（1.32±0.23），P＜0.05]，而給予心肌細(xì)胞SERCA 基因干擾后，能夠體現(xiàn)出對(duì)H/R 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的應(yīng)激逆轉(zhuǎn)，與sevoP+H/R 組和siSERCA 陰性對(duì)照組相比，siSERCA+sevoP+H/R 組的GRP78 和CHOP 表達(dá)再度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 七氟醚后處理對(duì)細(xì)胞GRP78 和CHOP 表達(dá)的影響（）

表3 七氟醚后處理對(duì)細(xì)胞GRP78 和CHOP 表達(dá)的影響（）

注：control 組的細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，H/R 組細(xì)胞缺氧/復(fù)氧均3 h，sevoP 組復(fù)氧前以2.5%七氟醚處理缺氧箱內(nèi)H9C2 細(xì)胞30 min，另兩組H9C2細(xì)胞分別以小干擾肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP 酶（siSERCA）和陰性對(duì)照（ncSERCA）處理48 h 后進(jìn)行sevoP 同樣的操作；LDH 為乳酸脫氫酶；GRP78 為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；CHOP 為C/EBP 同源蛋白；sevoP 為七氟醚后處理；H/R 為缺氧/復(fù)氧；ncSERCA 為陰性對(duì)照；siSERCA 為小干擾敲低SERCA；與control 組比較，aP＜0.05；與H/R 比較，bP＜0.05；與sevoP+H/R 組比較，cP＜0.05

4 討論

缺血再灌注損傷是圍手術(shù)期缺血性心臟病患者高死亡率、致病率的主要原因，雖然目前關(guān)于缺血再灌注損傷的機(jī)制已基本了解，但是仍然缺乏有效的干預(yù)手段。七氟醚是臨床廣泛使用的麻醉氣體，其不同的適應(yīng)性調(diào)控技術(shù)在心臟缺血再灌注損傷防控領(lǐng)域顯示出一定的保護(hù)作用，但是也有一定的爭(zhēng)議，具體機(jī)制未明。針對(duì)目前已有的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激充分參與了心肌缺血再灌注損傷的生理病理進(jìn)程這一共識(shí)[1，5，9]，本研究利用大鼠在體缺血再灌注損傷所致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，闡明七氟醚對(duì)I/R-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，再利用前期實(shí)驗(yàn)的H9C2 細(xì)胞缺氧3h/復(fù)氧3 h 模型，初步驗(yàn)證了七氟醚后處理通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而保護(hù)缺血再灌注損傷的靶點(diǎn)。

心肌I/R 損傷可導(dǎo)致多種嚴(yán)重后果，其中最主要的是心肌梗死，因此本實(shí)驗(yàn)將檢測(cè)LDH、cTnI 作為評(píng)價(jià)心肌I/R 損傷程度的金標(biāo)準(zhǔn)。而GRP78 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性的標(biāo)志分子，CHOP 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路的關(guān)鍵分子，組織和細(xì)胞在缺血缺氧后，引起ERS導(dǎo)致GRP78 的高表達(dá)，同時(shí)啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)穩(wěn)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)失控以后，心肌細(xì)胞通過(guò)CHOP 信號(hào)通路的激活，而產(chǎn)生細(xì)胞凋亡[10]。本研究選擇這些指標(biāo)能夠反映心肌缺血再灌注損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的變化情況，結(jié)果顯示，H9C2 在3H/3R 條件下就會(huì)造成細(xì)胞損傷，心肌組織于缺血30 min 再灌注2 h 時(shí)刻即造成自心臟損傷，但是要產(chǎn)生顯著的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激變化，則需要在再灌注6 h 才有明顯變化，猜想再灌注的損傷時(shí)間依賴性，這也間接印證了臨床急性心梗解除的黃金6 h 原則，因?yàn)樵俟嘧r(shí)間如超過(guò)6 h，由于自由基大量形成、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸的釋放等因素綜合一起，組織和細(xì)胞的壞死在所難免。本研究沒(méi)有采用大鼠langendroff 離體心臟灌注模型，旨在力求真實(shí)還原病理事件，模型結(jié)果同Huang 等[11]與Ding 等[12]的小鼠心肌缺血30min 再灌注6 h 的研究一致，此模型能夠明顯產(chǎn)生心肌的CK-MB、cTnI 高表達(dá)和細(xì)胞凋亡。

七氟醚適應(yīng)性調(diào)控心臟缺血再灌注損傷已經(jīng)被廣泛研究，涉及到預(yù)處理、后處理、聯(lián)合處理等方式。其中，后處理主要調(diào)控的通路包括線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔功能失調(diào)、心肌細(xì)胞凋亡等方面。除了七氟醚后處理抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在腦保護(hù)領(lǐng)域的貢獻(xiàn)[13-14]，七氟醚后處理對(duì)心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控機(jī)制方面鮮有報(bào)道。Liu 等[5]報(bào)道指出七氟醚后處理對(duì)缺血再灌注損傷心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控是通過(guò)PERK/eIF2a/ATF4/CHOP 信號(hào)通路達(dá)到，靶點(diǎn)分子為Akt，不同于本研究中的靶點(diǎn)分子Ca2+-ATP 酶，但是結(jié)局指標(biāo)均是相同的GRP78、CHOP 分子伴侶表達(dá)。

Ca2+-ATP 酶是細(xì)胞肌漿網(wǎng)中維持細(xì)胞內(nèi)外Ca2+平衡的蛋白質(zhì)，它能夠分解ATP，維持細(xì)胞發(fā)揮正常功能時(shí)所需的鈣濃度，尤其在能量供應(yīng)缺乏情況下,鈣泵失活致細(xì)胞內(nèi)外濃度差紊亂，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，最終引起鈣超載，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在心肌細(xì)胞H/R 模型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下Ca2+-ATP 酶的敲低顯著影響七氟醚的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控作用，初步說(shuō)明了七氟醚內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控的機(jī)制和靶標(biāo)，研究結(jié)果與劉紅超等[16]的七氟醚對(duì)糖尿病大鼠海馬中Ca2+-ATP 酶活性的影響一致。至于七氟醚調(diào)控Ca2+-ATP 酶具體的信號(hào)通路和相互作用，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了七氟醚后處理可通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而減輕缺血再灌注心臟的損傷，其機(jī)制與心肌細(xì)胞Ca2+-ATP 酶的活性有關(guān)。