宏基因組學(xué)第二代測序技術(shù)對比傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)在慢性子宮內(nèi)膜炎病原學(xué)診斷中的優(yōu)勢

劉海瑛 譚國英 李愛平

（青島市婦女兒童醫(yī)院生殖中心，青島市黃島區(qū)中醫(yī)院，山東 青島 266000）

慢性子宮內(nèi)膜炎一般無經(jīng)典的臨床癥狀，多是 由急性炎癥轉(zhuǎn)變而來，是由于各種原因引起的子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生炎癥性的改變，細(xì)菌可通過陰道上行至宮頸，造成子宮內(nèi)膜、輸卵管的感染[1]。有文獻(xiàn)顯示，慢性子宮內(nèi)膜炎是造成女性不孕不育的主要原因之一[2-3]。在輔助生殖技術(shù)的研究中，發(fā)現(xiàn)慢性子宮內(nèi)膜炎會影響患者的胚胎著床率、胚胎發(fā)育率，且易造成復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、著床反復(fù)失敗。Puente等[4]研究顯示，與健康人群相比，罹患子宮內(nèi)膜炎的患者流產(chǎn)率、胚胎著床率都較高。慢性子宮內(nèi)膜炎的主要病理特征是：子宮內(nèi)膜間質(zhì)的漿細(xì)胞浸潤，因此，子宮內(nèi)膜微生物檢測能為慢性子宮內(nèi)膜炎患者的診斷、治療提供可靠的臨床信息。目前，子宮內(nèi)膜微生物檢測方法仍以傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法為主，但該方法對技術(shù)要求高、耗時長，且多數(shù)微生物無法通過培養(yǎng)法來鑒定，因此，在臨床的應(yīng)用中受限。而非培養(yǎng)的新型診斷技術(shù)——宏基因組學(xué)第二代測序技術(shù)（metagenomic next generation sequencing，mNGS）迅速發(fā)展起來，在病原學(xué)診斷方面具有獨特的優(yōu)勢，具有檢測時間短、操作簡便、檢測準(zhǔn)確率高等優(yōu)點[5-6]。本研究采用mNGS法來檢測慢性子宮內(nèi)膜炎患者的病原體，并與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法相比較，評價mNGS法在慢性子宮內(nèi)膜炎病原學(xué)診斷中的優(yōu)勢。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2021年12月我院生殖中心病理及宮腔鏡檢查初步診斷為CE的不孕不育患者500例，患者年齡23～40歲，平均（31.38±4.79）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者年齡大于18歲，臨床病理證實為慢性子宮內(nèi)膜炎。②對同一位置的標(biāo)本同時進(jìn)行微生物培養(yǎng)法與mNGS的檢測。③子宮內(nèi)膜標(biāo)本采集前1個月內(nèi)均不曾使用任何抗生素。排除標(biāo)本在取樣、轉(zhuǎn)運、處理過程中受到污染者。同時取子宮內(nèi)膜標(biāo)本送檢，每份標(biāo)本均分為2份，1份行傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法檢測病原體，另1份行mNGS法檢測病原體。所有患者知情、同意并簽署相關(guān)文件，本研究已獲得我院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集

1.2.1 宮腔鏡檢查時子宮內(nèi)膜活組織取樣 女性在月經(jīng)期干凈后，完善檢查無陰道炎、無手術(shù)禁忌證，術(shù)前清洗外陰，消毒陰道、宮頸，放置內(nèi)窺器，再次碘伏消毒宮頸口、陰道側(cè)壁，生理鹽水擦洗宮頸口，進(jìn)鏡鏡下對子宮內(nèi)膜充血、微小息肉等可疑感染組織活檢鉗取樣，一份密封送病原體培養(yǎng)，一份基因測序標(biāo)本置細(xì)胞保存液，2～8 ℃保存送至實驗室。

1.2.2 小刮匙取宮腔內(nèi)膜標(biāo)本 術(shù)前清洗外陰，消毒陰道宮頸，放置內(nèi)窺器，再次碘伏消毒宮頸口、陰道側(cè)壁，生理鹽水擦洗宮頸口，小刮匙進(jìn)行內(nèi)膜取樣，所獲標(biāo)本密封保存2份備檢。1份密封送病原體培養(yǎng)，1份基因測序標(biāo)本置細(xì)胞保存液，2～8 ℃保存送至實驗室。

1.3 微生物培養(yǎng) 標(biāo)本分別接種在巧克力瓊脂平板、麥康凱平板和哥倫比亞血瓊脂平板、沙保羅平板，并分區(qū)劃線接種，部分于35 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行需氧培養(yǎng)，部分置厭氧箱無氧培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為72 h。

1.4 宏基因組學(xué)第二代測序

1.4.1 DNA提?。簶?biāo)本超聲破碎后，按照試劑盒步驟提取DNA。

1.4.2 文庫構(gòu)建和測序 采用 Agilent2100Bioana-Lyzer質(zhì)控文庫插入DNA片段，按操作說明調(diào)整DNA文庫濃度，然后經(jīng)環(huán)化形成單鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)。環(huán)化文庫經(jīng)滾環(huán)復(fù)制生成的DNA納米球，加載到測序芯片，使用 Bio-electronseq4000測序。測序數(shù)據(jù)去除低質(zhì)量、長度小于35bp、人參考基因組序列。行微生物大數(shù)據(jù)庫比對，并將比對后的數(shù)據(jù)按病毒、細(xì)菌（需氧菌、厭氧菌分類）、真菌、支原體、衣原體等分類排列。

1.5 慢性子宮內(nèi)膜炎的治療 應(yīng)根據(jù)慢性子宮內(nèi)膜炎病原體微生物的檢測結(jié)果進(jìn)行治療。如革蘭陽性球菌應(yīng)用阿莫西林克拉維酸鉀治療，革蘭陰性桿菌應(yīng)用左氧氟沙星治療，支原體、衣原體感染應(yīng)用阿奇霉素治療，厭氧菌應(yīng)用替硝唑治療，多種致病菌復(fù)合存在時聯(lián)合用藥或用多西環(huán)素治療；針對宮腔鏡檢查及內(nèi)膜病理提示內(nèi)膜炎征象者，要按相應(yīng)菌群抗感染的同時進(jìn)行中醫(yī)辨證論治2周，次月陰道放置陰道用乳桿菌活菌膠囊（商品名：定君生）治療2周。

1.6 復(fù)查 療程結(jié)束后于下月月經(jīng)干凈后3～7 d，取標(biāo)本再次細(xì)菌培養(yǎng)及mNGS，提取原檢測微生物DNA，檢測治療后微生物變化情況。

1.7 觀察指標(biāo) 首先，分析治療前子宮內(nèi)膜標(biāo)本微生物培養(yǎng)法與mNGS法檢測出的病原體的數(shù)量及種類、微生物檢出陽性率；其次，對兩組檢測結(jié)果的一致性進(jìn)行分析；第三，經(jīng)過后續(xù)治療后，對兩種方法檢測出的病原體復(fù)檢陽性率進(jìn)行比較；第四，評價mNGS對慢性子宮內(nèi)膜炎的診斷價值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計軟件使用SPSS21.0，計數(shù)數(shù)據(jù)對比采用χ2檢驗，用（n，%）表示，當(dāng)P＜0.05提示數(shù)據(jù)差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 治療前兩種方法檢測出的病原體數(shù)量及種類、微生物檢出陽性率比較 傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法的檢出陽性率為20.80%（104/500）；mNGS法的檢出陽性率為79.40%（397/500），有顯著性差異（P＜0.05）。通過傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法共檢出104例，致病菌包括：肺炎克雷伯桿菌、大腸埃希菌、鏈球菌、糞腸球菌等。通過mGNS法共檢出397例，除上述致病菌外，還檢測出了細(xì)菌[陰道加德納菌1例、金黃色葡萄球菌1例（圖1）]、病毒（巨細(xì)胞病毒1例、乳頭狀瘤病毒1例）、支原體[解脲脲原體2例（圖2）。

圖1 mNGS檢測出子宮內(nèi)膜金黃色葡萄球菌感染結(jié)果

圖2 mNGS檢測出子宮內(nèi)膜解脲脲原體感染結(jié)果

2.2 兩種方法檢測結(jié)果的一致性 在500例子宮內(nèi)膜標(biāo)本中，兩組檢測結(jié)果完全不一致的有105例（21.00%），檢測結(jié)果不完全一致的有241例（48.20%），檢測結(jié)果完全一致的有154例（3.00%）。

2.3 治療后兩種方法的復(fù)檢陽性率比較 傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法復(fù)檢陽性率為13.46%（14/104），mNGS法復(fù)檢陽性率為15.87%（63/397），可見，經(jīng)治療后mNGS法的轉(zhuǎn)陰率顯著高于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法，有顯著性差異（P＜0.05）。

2.4 mNGS的診斷價值 以培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，mNGS的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為85.39%、58.92%、68.47%、61.09%。

3 討論

微生物感染是誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜的炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要介質(zhì)[7]。既往有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，慢性子宮內(nèi)膜炎患者中有多種類型的病原體，細(xì)胞、病毒、支原體、衣原體等，共同參與了子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生發(fā)展過程[8]。因此，微生物侵襲是誘發(fā)子宮內(nèi)膜炎癥的常見病因[9-10]。由于微生物的特性，再加上藥物的耐藥性，子宮內(nèi)膜炎患者的治療應(yīng)該依據(jù)不同的病原體進(jìn)行個體化的治療?？咕幬锏拿つ看罅渴褂脮又鼐旱氖д{(diào)、微生物的耐藥性，不利于患者胚胎的著床、發(fā)育。因此，快速、有效、可靠的檢測出患者宮腔內(nèi)的致病微生物，對后續(xù)的治療以及預(yù)后都有著重大意義。mNGS法的檢測覆蓋范圍很廣，細(xì)菌、病毒、支原體等都能被檢測出來，且敏感度很高。目前mNGS法主要是針對呼吸道、腦脊液、血液等部位檢測，目前在病原體中檢測的相關(guān)研究還比較少見。因此，本研究旨在通過對比宏基因組學(xué)第二代測序技術(shù)（mNGS）與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)在慢性子宮內(nèi)膜炎病原學(xué)檢測結(jié)果的差異，評價mNGS在慢性子宮內(nèi)膜炎病原學(xué)診斷中的優(yōu)勢。

mNGS法在慢性子宮內(nèi)膜炎病原體檢測中具有很高的敏感度，覆蓋率很廣。因此，我們對mNGS法的優(yōu)勢進(jìn)行了總結(jié)，包括以下幾點：①mNGS法具有更高的敏感度[11-14]。本研究中兩種檢測方法一致性的結(jié)果顯示，傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法有105例為陰性，而mNGS法檢測出為陽性。既往認(rèn)為，傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法是血液感染金標(biāo)準(zhǔn)，但對微生物陽性率的檢出率則受采血時間、采血量、培養(yǎng)次數(shù)等諸多因素的影響，即使有感染也未必會分離出細(xì)菌，因此傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法檢測為陰性也并不能排除感染的可能性。有文獻(xiàn)顯示，血傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法的敏感度僅有40.00%[15]。因此，有必要對有懷疑的子宮內(nèi)膜炎患者進(jìn)行mNGS法檢測[16-17]。本研究結(jié)果顯示，在500例子宮內(nèi)膜標(biāo)本中，兩組檢測結(jié)果完全不一致的有105例（21.00%），檢測結(jié)果不完全一致的有241例（48.20%），檢測結(jié)果完全一致的有154例（3.00%）。經(jīng)治療后mNGS法的轉(zhuǎn)陰率顯著高于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法（P＜0.05）。以培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，mNGS法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為85.39%、58.92%、68.47%、61.09%。②mNGS法對少見菌的檢測具有優(yōu)勢。厭氧菌對取樣、標(biāo)本培養(yǎng)的條件要求很高，且病毒只能在活細(xì)胞中才可以生長繁殖。在理論上講，mNGS法并不依賴于培養(yǎng)，因此可以檢測出并未檢測出來的病原體。本研究結(jié)果顯示，mNGS法的檢出陽性率明顯高于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法，有顯著性差異。對兩種方法檢出的微生物類型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)通過傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法僅發(fā)現(xiàn)了一些致病菌，如肺炎克雷伯桿菌、大腸埃希菌、鏈球菌、糞腸球菌等。而mGNS法除了上述致病菌外，還檢測出了細(xì)菌（陰道加德納菌1例、金黃色葡萄球菌1例）、病毒（巨細(xì)胞病毒1例、乳頭狀瘤病毒1例）、支原體（解脲脲原體2例）。充分體現(xiàn)了mGNS法能夠發(fā)現(xiàn)一些少見的、平時難以發(fā)現(xiàn)的病原體[18-20]。

綜上所述，與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法相比，mNGS法具有更高的敏感度，能檢測出更多的病原體。在慢性子宮內(nèi)膜炎患者的治療中能精準(zhǔn)的指導(dǎo)抗生素的應(yīng)用。