外泌體在炎性腸病診斷及治療中的作用

范春嬌，黃貴華，高松林，林星陽，黃木圣，邱華

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧 530001; 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃肝病科，南寧 530023)

炎性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種以直腸出血、腹部不適、體重減輕為主要癥狀的慢性自身免疫性疾病，以間歇性復(fù)發(fā)和靜止性炎癥緩解為特征，其中最常見的是潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。目前IBD的發(fā)病機制尚不清楚，較為公認的是遺傳因素、環(huán)境因素、腸道微生物、免疫因素相互作用導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能障礙和腸道黏膜損傷，損傷腸黏膜處的微環(huán)境發(fā)生變化，包括營養(yǎng)物質(zhì)吸收障礙、局部組織氧供需失衡以及大量活性氮和氧中間體產(chǎn)生，由此產(chǎn)生氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和缺氧應(yīng)激反應(yīng)信號等，從而影響腸黏膜屏障的完整性、腸道細胞存活及免疫調(diào)節(jié)[1]。在IBD的腸道微環(huán)境中，免疫細胞和非免疫細胞之間通過分泌的細胞因子進行動態(tài)復(fù)雜的相互作用，這些細胞因子參與IBD相關(guān)炎癥級聯(lián)反應(yīng)的持續(xù)和放大[2]。炎癥細胞(如中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞)和適應(yīng)性免疫細胞(T細胞和B細胞)被招募以響應(yīng)活躍炎癥部位產(chǎn)生的趨化因子信號,如白細胞介素(interleukin,IL)8、白三烯B4、血小板激活因子、補體因子C5a等[3]。目前，IBD的治療側(cè)重于抗炎及腸道黏膜修復(fù)，藥物主要有5-氨基水楊酸、類固醇、抗菌藥物、免疫調(diào)節(jié)劑和單克隆抗體，但這些藥物也存在局限性，隨著治療時間的延長，部分患者無反應(yīng)。因此，迫切需要尋找新的、有效的、安全的IBD治療方案。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體通過免疫調(diào)節(jié)作用在IBD的發(fā)生發(fā)展及治療中扮演重要角色[4]?，F(xiàn)就近年來外泌體蛋白、RNA和脂質(zhì)對IBD免疫細胞和腸黏膜屏障等的調(diào)節(jié)作用和外泌體在IBD中作為診斷標志物的潛在價值及不同來源外泌體在IBD發(fā)病機制及免疫調(diào)節(jié)中的作用進行綜述，以為探尋IBD新的診療方案提供依據(jù)。

1 外泌體的來源及功能

外泌體是由不同類型的細胞以胞吐形式釋放的大小為30～150 nm的雙層脂質(zhì)膜囊泡，最初人們認為外泌體是人體內(nèi)的一種“垃圾”，但近年的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體通過細胞間傳送的方式清除體內(nèi)垃圾以及維持細胞間內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[5]。外泌體內(nèi)包含多種生物學(xué)分子(脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸、信號轉(zhuǎn)錄因子、炎癥因子、熱激蛋白等)，且表面攜帶有特殊功能的蛋白(黏附分子、共刺激分子、配體、受體等)，外泌體通過內(nèi)吞、吞噬、膜融合等機制將以上多種生物學(xué)分子從親本細胞傳遞到受體細胞，以促進或抑制細胞基因表達，調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響細胞功能，發(fā)揮免疫抑制或免疫激活的作用[6]。外泌體存在于多種活細胞中，尤其是樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)、淋巴細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞，另外在血液、尿液、唾液、羊水以及母乳等體液中也可檢測和獲得外泌體[7]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體參與內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病[8]、心血管系統(tǒng)疾病[9]、生殖系統(tǒng)疾病[10]以及腫瘤[11]等的發(fā)病，并在疾病診斷以及作為藥物載體方面發(fā)揮重要作用[12]。

2 外泌體在IBD發(fā)病機制中的作用

免疫失衡及過度的炎癥反應(yīng)是IBD重要的病理變化，目前研究表明，外泌體能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致免疫失衡，進而破壞腸黏膜上皮；同時外泌體還能啟動炎癥反應(yīng)，致使腸道中炎癥因子水平發(fā)生變化，進而加重腸黏膜炎性損傷[13-17]。

2.1參與炎癥反應(yīng) 外泌體中的炎癥介質(zhì)通過觸發(fā)免疫細胞間的免疫反應(yīng)加重腸道炎癥反應(yīng)。外泌體可啟動炎癥反應(yīng)和細胞間通訊。腸黏膜促炎和抗炎作用失衡是IBD發(fā)生的主要原因，外泌體作為炎癥介質(zhì)參與腸黏膜炎癥反應(yīng)。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)，肥大細胞來源的外泌體微RNA(microRNA，miRNA/miR)-223通過介導(dǎo)封閉蛋白8的表達，減少miR-223相關(guān)蛋白的表達，破壞腸黏膜屏障，導(dǎo)致腸上皮通透性增加，從而參與IBD的發(fā)生發(fā)展。也有研究發(fā)現(xiàn)，肥大細胞分泌的外泌體能夠誘導(dǎo)DCs成熟，促進腸道炎癥反應(yīng)[14]。在動物實驗中，從葡聚糖硫酸鈉鹽(dextran sulfate sodium salt，DSS)誘導(dǎo)的IBD大鼠相關(guān)的黏附侵襲性大腸埃希菌感染的腸上皮細胞和巨噬細胞中分離出的外泌體，可通過激活核因子κB、胞外信號調(diào)節(jié)激酶、p38和c-Jun氨基端激酶激活幼稚巨噬細胞，并導(dǎo)致促炎細胞因子腫瘤壞死因子-α和IL-6分泌增加[15]。

2.2誘導(dǎo)免疫反應(yīng) 外泌體具有強大的免疫激活和免疫抑制作用，它們通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。巨噬細胞和2型先天性淋巴細胞作為自然免疫的重要組成部分，在IBD的發(fā)病中起重要作用。Lu等[17]嘗試從巨噬細胞及2型先天性淋巴細胞的角度闡述IBD的發(fā)病機制，在DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠中發(fā)現(xiàn)，來源于巨噬細胞的外泌體miR-21a-5p的表達增加，且miR-21a-5p的表達與腸細胞中上皮鈣黏素的表達呈負相關(guān)，同時也證實了2型先天性淋巴細胞的表面抑制受體殺傷細胞凝集素樣受體亞家族G成員1通過促進GATA結(jié)合蛋白3分泌參與IBD中2型先天性淋巴細胞的過度激活，提示miR-21a-5p可能以上皮鈣黏素為靶點破壞腸黏膜上皮，即異常極化的巨噬細胞通過上皮鈣黏素導(dǎo)致腸黏膜屏障破壞。外泌體為闡明IBD的發(fā)病機制和改善治療效果提供了新的理論依據(jù)。

3 外泌體對IBD的診斷作用

目前尚無診斷IBD的金標準，診斷主要依據(jù)臨床癥狀和胃鏡檢查，同時排除器質(zhì)性病變。外泌體存在于大部分的體液中，且具有高度穩(wěn)定性，在病理條件下外泌體含量和外泌體蛋白的表達發(fā)生變化，使其可能成為疾病診斷的標志物。Wong等[18]對IBD小鼠的血清外泌體進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果共分析出56種蛋白質(zhì)，其中大部分為急性期蛋白質(zhì)和免疫球蛋白。血清外泌體對巨噬細胞具有明顯的激活作用，其對于IBD的診斷具有一定價值[19]。Zheng等[19]在17例IBD患者的唾液外泌體中檢測出2 000多種蛋白質(zhì)，其蛋白含量已遠超過健康人水平，其中8個蛋白質(zhì)與炎癥、蛋白酶體活性和免疫反應(yīng)有關(guān)?；虮倔w論分析顯示，蛋白酶體α7型亞單位在IBD患者中的表達明顯高于健康對照組，提示蛋白酶體α7型亞單位有可能成為IBD的生物標志物，為IBD的診斷提供依據(jù)[19]。Sch?nauen等[20]研究發(fā)現(xiàn)，IBD患者血清中miR-155和miR-223高表達，而miRNA的表達水平與疾病活動性及糞便鈣蛋白、C反應(yīng)蛋白水平等有關(guān)。由此推測，血清和糞便外泌體中miRNA有可能成為IBD診斷的潛在生物標志物。

4 不同來源外泌體對IBD的免疫調(diào)節(jié)作用

細胞來源的外泌體主要通過抑制腸道炎癥反應(yīng)以及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，改善IBD的上皮屏障功能，緩解結(jié)腸炎腸道損傷。

4.1炎癥細胞來源外泌體 巨噬細胞是抵御疾病的第一道防線，其分泌的外泌體具有抗炎作用。巨噬細胞可分為M1型和M2型，其中M1型巨噬細胞分泌較高水平的促炎細胞因子(腫瘤壞死因子-α、IL-1α、IL-1β、IL-6等)，M2型巨噬細胞具有抗炎作用，并被輔助性T細胞(T helper cell，Th細胞)分泌的細胞因子(IL-4、IL-13和IL-33)所極化[21]。Yang等[22]從巨噬細胞的培養(yǎng)上清液中分離出M2型巨噬細胞(M2a、M2b和M2c型)外泌體，觀察其在IBD中的作用發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細胞外泌體可以減輕DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的嚴重程度，且M2b型巨噬細胞來源的外泌體較M2a和M2c型巨噬細胞來源的外泌體更有效，經(jīng)M2b型巨噬細胞外泌體治療后，結(jié)腸炎小鼠脾臟中調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)的數(shù)量和IL-4水平均增加。此外，經(jīng)M2b型巨噬細胞外泌體治療后，與結(jié)腸炎相關(guān)的細胞因子(IL-1β、IL-6、IL-17A)的表達受到顯著抑制[22]。M2b型巨噬細胞外泌體對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎有保護作用，其保護作用主要與CC趨化因子受體1/CC趨化因子受體8有關(guān)[22]。Cao等[23]通過使用雙靶向納米顆粒將miR-146b運送到腸巨噬細胞中，通過誘導(dǎo)M2型巨噬細胞極化，激活依賴IL-10的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3通路，從而促進腸道黏膜修復(fù)。以上發(fā)現(xiàn)為IBD的治療提供了新的途徑。

4.2免疫細胞來源外泌體 T細胞是免疫反應(yīng)的重要組成部分，DCs則是啟動初級免疫反應(yīng)的抗原呈遞細胞中最有效、最專業(yè)的細胞，具有捕獲和呈遞抗原的功能[24]。DCs來源的外泌體(DCs exosomes,DCs-Exo)具有免疫刺激或抑制作用。經(jīng)IL-10處理或轉(zhuǎn)染IL-10基因的DCs-Exo可通過刺激CD4+CD25+Treg細胞抑制三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎[25]。外泌體可以用作自身免疫性疾病干預(yù)治療的載體。髓源性抑制細胞是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的未成熟髓系細胞的異質(zhì)性群體，其釋放的外泌體通過抑制Th1細胞增殖和促進Treg細胞增殖，降低DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的嚴重程度[26]。胱天蛋白酶(caspase)-12是一種促凋亡蛋白，在先天免疫應(yīng)答過程中被激活，并參與IBD的發(fā)病[27]。Liao等[28]研究表明，Treg來源的外泌體(Treg exosomes,Treg-Exo)減輕了DSS誘導(dǎo)的IBD的嚴重程度，其可能是通過促進腸上皮屏障損傷的修復(fù)實現(xiàn)，具體是由miR-195a-3p直接靶向caspase-12，負調(diào)控caspase-12的表達；進一步研究發(fā)現(xiàn)，Treg-Exo miR-195a-3p通過靶向caspase-12促進體外培養(yǎng)的YAMC細胞增殖，抑制細胞凋亡。該研究結(jié)果提示，Treg-Exo將miR-195a-3p轉(zhuǎn)移到腸上皮細胞中，miR-195a-3p通過靶向caspase-12促進腸上皮屏障損傷的修復(fù)過程，減輕IBD的嚴重程度[28]。Treg-Exo的使用可能為IBD的治療提供新的途徑。

4.3干細胞來源外泌體 間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有誘導(dǎo)再生、維持一般組織動態(tài)平衡和定位于靶部位的能力，其分泌的外泌體具有實現(xiàn)自我更新和修復(fù)受損組織的作用[29]。MSCs通過分泌免疫調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)，控制IBD的炎癥反應(yīng)[30]。研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶MSCs釋放的外泌體(human umbilical cord MSCs exosomes,HucMSC-Exo)通過抑制巨噬細胞中IL-7的高表達減輕DSS誘導(dǎo)的IBD[31]。粒細胞髓系來源的抑制性細胞的功能性外泌體被稱為CD11b+Ly6G+Ly6Clow細胞，其具有粒細胞樣形態(tài)，是髓系來源的抑制細胞的主要群體[32]。CD11b+Ly6G+Ly6Clow細胞可通過抑制Th1細胞增殖和促進Treg細胞擴張減輕DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[33]。在Wang等[34]的研究中，HucMSC-Exo處理可恢復(fù)IBD結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)的完整性，降低促炎細胞因子(IL-1β、IL-6)的水平，而增加抗炎細胞因子(IL-10)的表達。HucMSC-Exo通過修復(fù)受損的大腸組織減輕IBD。HucMSC-Exo富含miR-326，在抗炎過程中，miR-326抑制神經(jīng)前體細胞表達發(fā)育下調(diào)基因-8與底物蛋白cullin1結(jié)合，抑制炎癥反應(yīng)過程中E1、E2、E3酶的表達，進而抑制核因子κB信號通路激活，達到緩解IBD的目的[34]。嗅外-MSCs(olfactory mucosa MSCs，OM-MSCs)可用于自體移植。OE-MSCs較骨髓MSCs具有更高的增殖能力和更強的抑制能力。Rui等[35]研究發(fā)現(xiàn)，嗅外-MSCs來源外泌體(OE-MSCs exosomes,OE-MSCs-Exo)通過調(diào)節(jié)T細胞反應(yīng)，改善小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的嚴重程度，具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，OE-MSCs-Exo通過抑制CD4+T細胞增殖，降低γ干擾素、IL-17的表達，增加轉(zhuǎn)化生長因子-β、IL-10的表達，發(fā)揮免疫抑制作用[35]。在實驗性結(jié)腸炎小鼠中，OE-MSCs-Exos治療明顯減輕了疾病的嚴重程度，治療后Th1/Th17亞群顯著減少，Treg細胞明顯增加[36]。

4.4腸上皮來源的外泌體 維持腸黏膜完整性和促進損傷腸上皮修復(fù)是預(yù)防腸道炎癥進展的重要方式。有研究表明，來自DCs的外泌體miR-146b通過激活核因子κB改善上皮屏障功能，緩解結(jié)腸炎腸道損傷[37]。研究顯示，在P物質(zhì)刺激下結(jié)腸上皮細胞中miR-21的表達上調(diào)，然后被選擇性地分選到外泌體中，進而促進人結(jié)腸細胞和小鼠結(jié)腸隱窩細胞的增殖和遷移，從而促進結(jié)腸上皮細胞增殖[38]。

4.5寄生蟲來源外泌體 胃腸道寄生蟲通過免疫調(diào)節(jié)減輕IBD的炎癥，從而起到保護腸黏膜的作用[39]。用鉤蟲來源的外泌體處理潰瘍性結(jié)腸炎小鼠發(fā)現(xiàn)，參與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的炎癥因子(IL-6、IL-1β、γ干擾素和IL-17A)的表達受到顯著抑制，而抗炎細胞因子(如IL-10)的表達明顯升高，從而對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠起到保護作用[39]。Eichenberger等[40]發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲和曼氏血吸蟲卵來源的外泌體對結(jié)腸炎小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用，此研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原處理的DCs-Exo治療后，結(jié)腸炎小鼠體重增加，疾病活動指數(shù)明顯降低，且小鼠結(jié)腸長度增加。由此可知，寄生蟲對IBD具有一定免疫調(diào)節(jié)作用。

5 小 結(jié)

隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，外泌體與疾病的發(fā)病、診斷及治療等聯(lián)系緊密：在發(fā)病機制方面，外泌體通過炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫反應(yīng)參與IBD的發(fā)生發(fā)展；在診斷方面，外泌體作為一種潛在的生物標志物，能夠在某種程度上反映病情；在免疫調(diào)節(jié)方面，外泌體以感染的方式成為免疫反應(yīng)中強大的促炎和抗炎介質(zhì)。不同來源的外泌體參與維持腸道的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，包括改善上皮屏障功能、發(fā)揮Treg細胞抑制作用等。因此，外泌體途徑為IBD的治療提供了另一種選擇。但目前關(guān)于外泌體的知識主要來自體外實驗?zāi)Ｐ停饷隗w通路在特定類型免疫細胞中的功能尚未被研究。此外，未來還需要探索外泌體在給藥后的藥動學(xué)或生物分布情況。相信隨著科技的不斷發(fā)展，在納米技術(shù)、基因組學(xué)等技術(shù)的輔助下，外泌體將被更好地應(yīng)用于IBD的診斷和治療。