HLA-G與腎虛血瘀型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)性研究

曲云青，馮曉玲，谷玥儒，韓智宇

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent pregnancy loss，RPL)的再次發(fā)生概率將隨流產(chǎn)次數(shù)的增加而上升，既往RPL是導(dǎo)致女性后續(xù)妊娠丟失的獨(dú)立危險因素，除已明確的遺傳因素、生殖免疫因素、生殖系統(tǒng)機(jī)能及結(jié)構(gòu)紊亂畸形、感染等因素外，尚有部分原因不明?，F(xiàn)代免疫生殖學(xué)認(rèn)為，妊娠這一生理過程屬于半同種異體移植，RPL是母胎之間免疫失去平衡協(xié)調(diào)，而致免疫排斥的反應(yīng)結(jié)果，免疫機(jī)制的調(diào)節(jié)把控，對于胚胎的成功植入到最后的順利分娩是不可或缺的，人體對外來移植物的排斥反應(yīng)主要受組織相容性復(fù)合產(chǎn)物——MHC基因把控，HLA-G是其中之一，在母嬰免疫耐受中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。HLA-G介導(dǎo)母體自身的免疫細(xì)胞和從胎兒中分化出來的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(EVT)間的交互作用，于母嬰界面形成特殊微環(huán)境，保證胚胎著床和正常發(fā)育。HLA-G是非經(jīng)典的MHC-I分子，在生理條件下在EVT上大量且特異地表達(dá)。在孕婦血液、羊水和臍帶血中也發(fā)現(xiàn)有可溶性HLA-G。HLA-G的異常表達(dá)和多態(tài)性與不良妊娠結(jié)局有關(guān)，例如先兆子癇(PE)以及RPL[1]。

1 HLA-G的結(jié)構(gòu)及免疫調(diào)節(jié)作用

HLA-G是人類非經(jīng)典主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)I類基因的一員，HLA-G于1982年首次被找到，1987年由Geraghty等克隆并測序，1990年被命名為HLA-G[2]。HLA-G的作用可促進(jìn)胚胎植入子宮和血管生長發(fā)育，在母體妊娠早期適量表達(dá)，可能與維持母嬰免疫微環(huán)境穩(wěn)定有關(guān)聯(lián)。Ia類中另一類亞型包括HLA-A、B、C三個基因位點，主要激發(fā)異體排斥反應(yīng)，在妊娠初期母體的Ia類HLA沉默是必要的[3]。Morandi等[4]分析表明，與經(jīng)典的I類MHC基因不同，HLA-G顯示出極為有限的多樣性和組織特異性較嚴(yán)格，發(fā)現(xiàn)其主要存在于母胎界面絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞、女性生殖道、卵泡液及體外培養(yǎng)胚胎的培養(yǎng)基中，可能參與胚胎著床的免疫耐受。

HLA-G似乎與懷孕特別相關(guān)。排卵后，子宮內(nèi)膜的子宮基質(zhì)成纖維細(xì)胞分化為蛻膜細(xì)胞，形成子宮螺旋動脈。在妊娠早期，類固醇激素、孕酮和β-雌二醇作用于孕婦的血管內(nèi)皮細(xì)胞并增加血管通透性，促進(jìn)血管生成[5]。免疫細(xì)胞，尤其是NK細(xì)胞通過母體血管募集。EVT侵入蛻膜并取代了內(nèi)皮細(xì)胞。這些過程共同重塑螺旋動脈并形成母體——胎兒界面，以支持為胎兒發(fā)育提供氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)。HLA-G植入前于EVT表面表達(dá)，而sHLA-G在IVF胚胎的培養(yǎng)基、母體血液、羊水和臍帶血中被檢測到[6]。HLA-G基因多態(tài)性和sHLA-G水平降低與胚胎植入失敗、胎盤早剝、RPL及PE有關(guān)[7]。

Tilburgs等[8]研究發(fā)現(xiàn)，HLA-G與蛻膜NK細(xì)胞之間存有微弱的信號通路傳導(dǎo)，參與調(diào)節(jié)母體NK細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，為胚胎植入準(zhǔn)備充分以及良好的內(nèi)膜環(huán)境。母胎界面HLA-G是連接絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞與dNK的關(guān)鍵橋梁分子，絨毛滋養(yǎng)層HLA-G的穩(wěn)定表達(dá)能有效激活母體dNK特異性轉(zhuǎn)錄因子同源框(PBX1)的活化，從而誘導(dǎo)母體表達(dá)多效生長因子(PTN)和骨甘氨酸(OGN),這些促生長因子的持續(xù)作用才能維持孕早期胎兒的穩(wěn)定發(fā)育[9]。孕早期上游母胎界面HLA-G的穩(wěn)定表達(dá)，能有效保證下游生長因子的功能。李婷等[10]用ELISA研究得出，妊娠期在母體血清和/或血漿中可以觀察到sHLA-G水平較高，與妊娠正常組相比較，RPL組早期的sHLA-G水平顯著降低。馮曉琴等[11]用qRT-PCR比較RPL組和正常妊娠終止者外周血中及絨毛中HLA-G mRNA的相對表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RPL組患者的外周血和流產(chǎn)絨毛中的HLA-G mRNA表達(dá)均顯著低于正常妊娠的女性(P<0.01)，表明孕早期，若HLA-G表達(dá)下調(diào)，可能會影響胚胎侵入子宮蛻膜和重鑄螺旋動脈，絨毛著床不充分，嚴(yán)重影響胎盤的形成。不過，Hviid[12]發(fā)現(xiàn)，若妊娠早期HLA-G水平過高，滋養(yǎng)細(xì)胞侵蝕內(nèi)膜力度過強(qiáng)，可能將會導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞腫瘤發(fā)生。因此，HLA-G水平也應(yīng)維持在合適范圍之內(nèi)，過低不利于胚胎的穩(wěn)定植入以及妊娠的維持，過高將逆轉(zhuǎn)它的積極效應(yīng)，同樣對母體產(chǎn)生不利影響。

HLA-G通過幼稚T細(xì)胞的分化或HLA-G從抗原提呈細(xì)胞(APCs)到T細(xì)胞上的快速轉(zhuǎn)移來誘導(dǎo)Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD3+CD4low和CD3+CD8low抑制性T細(xì)胞，轉(zhuǎn)化成為HLA-G呈顯性的抑制細(xì)胞[13]。HLA-G升高了Th2抗炎性細(xì)胞因子，并降低了Th1促炎性細(xì)胞因子，而這些細(xì)胞因子在助滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入及維持局部免疫抑制起著重要作用[14]。

2 HLA-G促進(jìn)螺旋動脈的重塑

子宮中的胎兒發(fā)育需要母體血液提供的營養(yǎng)和氧氣。螺旋動脈重塑對于懷孕期間加速和穩(wěn)定胎盤血流至關(guān)重要。這種重塑始于蛻膜相關(guān)的重塑，并涉及螺旋動脈血管平滑肌的最初腫脹和紊亂，然后血管內(nèi)皮液化并且彈性膜崩解。這些變化主要是由血管生長因子誘導(dǎo)的，其由蛻膜NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生[15]。NK細(xì)胞占人外周血淋巴細(xì)胞的比例不到20%，但在孕早期蛻膜中約占淋巴細(xì)胞的70%[16]。NK細(xì)胞通過表達(dá)諸如殺傷KIR來識別靶細(xì)胞上的MHC-I蛋白。然后，NK細(xì)胞根據(jù)抑制或激活受體的信號決定是否殺死靶細(xì)胞。

KIR2DL4(也稱為CD158d)是KIR家族的成員，其結(jié)構(gòu)、定位和功能與其他KIR有所不同[17]。 KIR2DL4是由NK細(xì)胞表達(dá)并激活I(lǐng)FN-g的產(chǎn)生，但不促進(jìn)靜止的外周NK細(xì)胞的毒性，KIR2DL4主要位于含有Rab5的細(xì)胞內(nèi)體中[18]，這種定位需要KIR2DL4的Ig結(jié)構(gòu)域。

KIR2DL4的配體是HLA-G。Rajagopalan等[19]報道可溶性KIR2DL4是由KIR2DL4的胞外區(qū)和IgG Fc區(qū)組成的融合蛋白，與表達(dá)HLA-G但不表達(dá)HLA-Cw3或HLA-B7的LCL 721.221細(xì)胞結(jié)合。此外，觀察到與KIR2DL4相互作用后，靶細(xì)胞表面上的可溶性HLA-G或HLA-G被內(nèi)吞到NK細(xì)胞的囊泡中。已顯示可溶性HLA-G通過NK細(xì)胞可以激活促血管生成/促炎性細(xì)胞因子和趨化因子(即IL-6、IL-1b、IL-8、MIP-1-a和MIP-3-a)的分泌。 當(dāng)sHLA-G或KIR2DL4激動劑抗體刺激外周血NK細(xì)胞時，DNA-PKcs被激活并誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21的表達(dá)。研究表明sHLA-G可以通過與KIR2DL4結(jié)合而刺激NK細(xì)胞中衰老相關(guān)的分泌表型(SASP)的產(chǎn)生，從而促進(jìn)血管通透性和血管生成[20]。因此，通過這種方式，HLA-G可以促進(jìn)螺旋動脈重構(gòu)。

據(jù)報道在靜止的外周NK細(xì)胞和蛻膜NK細(xì)胞的表面上KIR2DL4的蛋白水平非常低[21]。 在外周NK細(xì)胞中證實了將sHLA-G和KIR2DL4內(nèi)吞入內(nèi)體并誘導(dǎo)促進(jìn)血管滲透性的促血管生成細(xì)胞因子分泌的研究。Fu等[22]觀察到孕早期蛻膜NK細(xì)胞中KIR2DL4的表達(dá)，該觀察結(jié)果與KIR2DL4存在于蛻膜NK細(xì)胞的內(nèi)體中的發(fā)現(xiàn)是一致的。

HLA-G在絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞的表面進(jìn)行的是選擇性表達(dá)。Apps等[23]發(fā)現(xiàn)在早孕胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞表面有相當(dāng)?shù)腍LA-G表達(dá)為同型二聚體，表達(dá)同源二聚體HLA-G的LCL 721.221細(xì)胞可以刺激CD14+蛻膜巨噬細(xì)胞或NK細(xì)胞蛻膜分泌細(xì)胞因子，例如IL-6、IL-8和TNF-α。當(dāng)同型二聚體HLA-G與巨噬細(xì)胞上的免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物2(ILT2，也稱為LILRB1)結(jié)合或與NK細(xì)胞上的KIR2DL4結(jié)合時，就會激活這種刺激。當(dāng)被可溶性HLA-G5刺激時，從外周單核細(xì)胞分化出來的巨噬細(xì)胞可能表現(xiàn)出蛻膜性巨噬細(xì)胞的表型。Hanna等[24]發(fā)現(xiàn)蛻膜NK細(xì)胞高表達(dá)IL-8，IL-8可以結(jié)合CXCR1和CXCR3。 Transwell分析表明IL-8中和抗體可以減少蛻膜NK細(xì)胞誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲性。表達(dá)HLA-G的LCL721.221細(xì)胞可以增強(qiáng)妊娠婦女蛻膜NK細(xì)胞分泌更多的VEGFa，它將促進(jìn)血管形成。

3 HLA-G參與了母體免疫耐受性的形成

在子宮中，胎兒既不排斥也不受到母親免疫系統(tǒng)的攻擊，這與母嬰界面的特定免疫耐受微環(huán)境有關(guān)。在前三個月中，免疫細(xì)胞占蛻膜的40%，NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞分別約占蛻膜細(xì)胞的70%、15%～20%和5%～15%[25]。胎兒來源的EVT侵入蛻膜并與母體細(xì)胞直接接觸。EVT與表達(dá)受體的白細(xì)胞(如KIR)相互作用以提供免疫耐受條件[26]。

HLA-G的表達(dá)被認(rèn)為可以保護(hù)NK細(xì)胞免受NK細(xì)胞系或蛻膜NK細(xì)胞的裂解。母體子宮血中的NK細(xì)胞不會殺死細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，如果同時阻斷HLA-G和HLA-C的抗體添加到共培養(yǎng)基中，則NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性將恢復(fù)。但是抗HLA-C抗體并未逆轉(zhuǎn)針對NK裂解的保護(hù)作用。因此，HLA-G保護(hù)了胚胎來源的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞不被來自孕婦子宮血的NK細(xì)胞溶解[27]。然而，過表達(dá)HLA-G的細(xì)胞會上調(diào)HLA-E的表達(dá)，這是另一個非經(jīng)典的MHC分子[28]，正是HLA-E-NKG2A /CD94相互作用抑制了NK細(xì)胞對表達(dá)HLA-G細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。

NK細(xì)胞表達(dá)兩種HLA-G受體：KIR2DL4和ILT2。NK細(xì)胞系與表達(dá)HLA-G的黑色素瘤M8細(xì)胞共培養(yǎng)可恢復(fù)NK細(xì)胞上KIR2DL4或ILT2的表達(dá)，并且NK細(xì)胞可利用吞噬作用從腫瘤細(xì)胞中獲得HLA-G[29]。雖然未檢測到HLA-G mRNA，但在NK細(xì)胞與EVT共培養(yǎng)后，蛻膜NK細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)HLA-G分子。Transwell分離表明NK細(xì)胞通過直接細(xì)胞接觸獲得HLA-G。因此，顯示蛻膜NK細(xì)胞獲得HLA-G，然后在與EVTs接觸時吞噬HLA-G[8]。如上所述，HLA-G結(jié)合KIR2DL4并被NK細(xì)胞內(nèi)吞。

Apps等[30]發(fā)現(xiàn)當(dāng)與表達(dá)HLA-G的LCL 721.221細(xì)胞共培養(yǎng)時，蛻膜NK細(xì)胞脫粒不受影響。由于刺激表達(dá)HLA-G的LCL 721.221細(xì)胞，蛻膜NK細(xì)胞中的CD107a水平未改變。Du等[31]報道，當(dāng)蛻膜NK細(xì)胞與滋養(yǎng)細(xì)胞預(yù)共培養(yǎng)時，蛻膜NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的溶解活性降低。用Treg細(xì)胞預(yù)孵育的滋養(yǎng)細(xì)胞顯示出更大的下調(diào)作用，這歸因于蛻膜細(xì)胞中的蛻膜CD4+CD25+Treg細(xì)胞上調(diào)了HLA-G的表達(dá)。此外，針對HLA-G的中和抗體可以挽救蛻膜NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。因此，Treg細(xì)胞可以促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞中HLA-G的表達(dá)并抑制蛻膜NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，從而促進(jìn)蛻膜NK細(xì)胞產(chǎn)生IL-4和IL-10。足月胎盤EVT的HLA-G表達(dá)高于孕早期EVT的HLA-G表達(dá)。增加的HLA-G可以通過KIR2DL4和ILT2與足月妊娠dNK細(xì)胞提供增強(qiáng)的相互作用。然而，足月妊娠dNK細(xì)胞對PMA /離子霉素和K562細(xì)胞的脫顆粒能力增強(qiáng)。因此，在懷孕的不同階段，HLA-G對dNK細(xì)胞的作用可能不同。

此外，發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞來源的髓樣抑制細(xì)胞(GR MDSCs)在胎盤中積累[32]。孕婦外周血中的GR MDSCs表達(dá)ILT2和ILT4?？扇苄訦LA-G可以增強(qiáng)胎盤GR-MDSC對T細(xì)胞增殖的抑制活性。因此，GR-MDSCs有助于胎盤免疫耐受的形成。

4 中醫(yī)學(xué)的認(rèn)識

4.1 腎虛血瘀型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因病機(jī)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)在中醫(yī)學(xué)理念中并無確切病名，根據(jù)其癥狀表現(xiàn)及臨床特點可歸屬于妊娠病“滑胎”“數(shù)墮胎”“胎動不安”等范疇?！秼D人規(guī)》云：“凡妊娠后屢有墮胎者，必因血脈氣血虧損所致……況婦人之腎以系子宮胞脈，而腰為腎之外府，故胎孕之婦人最慮腰疼，痛甚則有下墜感，不可不防治之?！庇纱擞^之，腎虛導(dǎo)致的氣血虧虛是屢孕屢墮的根本。腎為先天之本，藏蓄天癸，主導(dǎo)生殖，沖任督帶胞絡(luò)系于腎，五臟之根歸于腎。男女交媾，腎氣充盛則胎孕乃成，腎虛則胞胎無力維系，遂致滑胎；或因先天之精不足，化生氣血乏源，五臟氣血虧虛，無以養(yǎng)胎而墮胎；反復(fù)屢孕屢墮，沖任胞脈受損，腎所藏之陰精不足，命門之火溫煦氣化動力乏源，胞脈感受虛寒，血液運(yùn)行阻滯則瘀血乃成。《讀醫(yī)隨筆》曰：“陽虛，則血必凝，陰虛，故血必滯?！蹦I為元?dú)庵?，腎氣旺則帥血行，元?dú)馊舨蛔銊t推動無力，腎虛日久必致血瘀；血行不暢，胞脈瘀阻，勢必影響腎氣化生和陰陽平衡，血瘀反之又可加重腎虛。馮曉玲教授[33]研究，RPL乃腎虛為根本，血瘀為標(biāo)實，腎虛導(dǎo)致氣血虧虛，故不能濡養(yǎng)胎元。腎虛為根本病機(jī)，血瘀則為病理基礎(chǔ)，病性多虛實夾雜，如此循環(huán)往復(fù)，必然屢孕屢墮。

4.2 腎虛血瘀型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的辨證施治

中醫(yī)強(qiáng)調(diào)辨證論治，臨床見病患少腹、小腹疼痛不適、經(jīng)行腹痛、經(jīng)行不暢、經(jīng)血暗紅、有血塊等表現(xiàn)，則辨為腎虛血瘀型，基于腎虛血瘀之病理基礎(chǔ)，臨證以補(bǔ)腎活血、化瘀通絡(luò)為基本治則，攻補(bǔ)兼施，著重于除瘀血祛邪之時兼顧祛邪不傷正氣，扶正不留邪氣，以提高臨床妊娠成功率?！夺t(yī)學(xué)衷中參西錄·醫(yī)方》云：“壽胎丸,治滑胎……男女生育，皆賴腎臟作強(qiáng)。”因此補(bǔ)腎固本，調(diào)理沖任氣血在腎虛血瘀型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)治療中有著重要意義。方中多用仙靈脾、菟絲子、杜仲等壯補(bǔ)腎陽，用女貞子、墨旱蓮等滋養(yǎng)腎陰，既可陰陽并補(bǔ)也可各有側(cè)重。補(bǔ)腎的基礎(chǔ)上酌加活血行瘀類中藥能激發(fā)人體氣血經(jīng)絡(luò)之功能，氣血和調(diào)，陰平陽秘必然有利于兩精相合。中醫(yī)藥特色診療方法對于治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有著顯著優(yōu)勢，現(xiàn)代眾多婦科醫(yī)家多采用中西醫(yī)結(jié)合療法診治，療效也十分顯著。馮曉玲教授據(jù)多年臨床經(jīng)驗自擬補(bǔ)腎活血方(菟絲子15 g,丹參15 g,黃芪15 g,桑寄生15 g,續(xù)斷15 g,阿膠10 g)，同時加用激素周期療法對于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診治療效頗為顯著。

腎乃先天之本原，元?dú)庵?，腎藏精氣主生殖，若先天稟賦虧虛，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性下降，進(jìn)而腎虛胎元不固有欲墮之趨勢，則發(fā)為胎動不安、胎漏?，F(xiàn)代研究認(rèn)為免疫力不強(qiáng)是許多疾病發(fā)生的因素之一。而免疫力在中醫(yī)學(xué)中則為正氣，正可謂“正氣存內(nèi)，邪不可干”。故腎氣的強(qiáng)盛與衰弱決定了人體中正氣的強(qiáng)弱，決定了是否可以抵抗病邪，即現(xiàn)代研究中的“腎虛與免疫力”的理論基礎(chǔ)[34]。多項研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，中藥通過HLA-G、LIF、VEGF等細(xì)胞因子可干預(yù)母嬰免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，其調(diào)節(jié)路徑是多靶點的[35]。研究發(fā)現(xiàn)，左歸丸與資沖顆粒(菟絲子、枸杞子、山萸肉、山藥、熟地黃、鹿角膠)都可增加滋養(yǎng)細(xì)胞組織HLA-G的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)母嬰免疫微環(huán)境的形成；齊丹等[36]研究表明，補(bǔ)腎安胎方(黃芩10 g，黨參10 g，白芍10 g，白術(shù)10 g，菟絲子12 g，續(xù)斷12 g，槲寄生10 g，山藥10 g)可通過上調(diào)HLA-G的表達(dá)，從而維持母嬰免疫平衡。隨著中醫(yī)學(xué)的大力發(fā)展，中西結(jié)合治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有望成為未來的首選方式。

5 結(jié)語

妊娠類似器官移植，是特殊免疫狀態(tài)，妊娠的維持依賴于母嬰免疫界面耐受平衡，一旦平衡失調(diào)，胎兒將被母體排斥，導(dǎo)致妊娠失敗。HLA-G在維持母胎免疫平衡的過程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用，需維持在一個合適的范圍之內(nèi)，若其表達(dá)失衡則不利于胚胎的種植和妊娠的穩(wěn)定，可能會引起母體免疫系統(tǒng)對胎兒排斥反應(yīng)而導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“若因母病而致胎動，則治其母，若因胎動而母病，但安其胎”(《婦人規(guī)·胎動欲墮》)，腎虛血瘀型是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的常見證型，研究證實補(bǔ)腎活血安胎法干預(yù)HLA-G介導(dǎo)的母胎免疫失衡所致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)具有顯著功效，審證求因治本，辨證論治，從而改善了生殖內(nèi)分泌功能和免疫平衡，并提高了子宮內(nèi)膜的容受性。開展更多的HLA-G基因及免疫調(diào)節(jié)等方面的研究，進(jìn)一步研究HLA-G對RPL的影響，有利于提高妊娠成功率。