甲基化分析在6種中藥多糖結(jié)構(gòu)表征中的研究進(jìn)展

姜浩，高佳寧，李野，梁軍，夏永剛

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

夏永剛(1980-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥多糖化學(xué)與中藥藥性理論創(chuàng)新研究。

中藥多糖是具有多種生物活性和藥理作用的生物大分子，其結(jié)構(gòu)研究一直以來是多糖研究的難點(diǎn)。甲基化分析是研究中藥多糖結(jié)構(gòu)的重要方法，它廣泛用于低聚糖和多糖中單糖苷連接方式的分析。其主要過程是在溫和的堿性條件下進(jìn)行甲基化，然后多糖通過三氟乙酸水解得到單糖，進(jìn)一步還原乙?；苌ㄟ^GC-MS測定部分甲基化阿爾迪醇乙酸酯衍生物的種類和數(shù)量，通過質(zhì)譜碎片裂解就能推測出單糖殘基的連接方式[1]。本文總結(jié)了甲基化分析方法在黃芪多糖、人參多糖、麻黃多糖、五味子多糖、川芎多糖和桔梗多糖結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用，闡明甲基化分析對多糖結(jié)構(gòu)鑒定的重要性，同時(shí)為其他中藥多糖結(jié)構(gòu)分析研究提供參考。

1 甲基化分析常用中藥多糖

1.1 黃芪多糖

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，在我國主要分布在黑龍江、內(nèi)蒙古、江西等地[2]，味甘，性微溫，具有補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表、利尿脫毒、斂瘡生肌等功效。黃芪在我國藥用歷史悠久，目前以黃芪為原料的中成藥達(dá)200多種，是臨床應(yīng)用最為廣泛的補(bǔ)益中藥。

黃芪多糖(Astragalus polysaccharide,APS)是黃芪主要活性成分之一，APS有多種生物學(xué)活性,主要包括免疫調(diào)節(jié)功能、抗炎、抗腫瘤、降血糖等。結(jié)構(gòu)鑒定與生物活性息息相關(guān)，結(jié)構(gòu)分析就顯得尤為重要。黃芪多糖是從中藥黃芪中分離提純的有效成分，主要為葡聚糖和雜多糖。林夢感等[3]微波提取制得黃芪精多糖MAPS,在確定分子量和單糖組成的基礎(chǔ)上，對MAPS進(jìn)行甲基化分析，通過GC-MS檢測并與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對照，確定MAPS的連接方式為α-D-Glc(1→,→4)-α-D-Glc-(1→,→4,6)-D-Glc-(1→,且三者的摩爾比為1.0∶5.6∶1.0。需要指出的是,由于GC-MS并不能分析出酸性糖的苷連接，因此往往需要先對酸性多糖進(jìn)行還原，將其中的酸性糖還原成中性糖，再進(jìn)行甲基化分析和GC-MS檢測。YANG等[4]在黃芪中提取分離純化得到一種低分子量的黃芪多糖LMw-ASP，酸性雜多糖通過先還原再進(jìn)行甲基化的分析方法，確定了LMw-ASP的連接方式為Glc(1→,→2)-Ara-(1→,→2)-Xyl-(1→,→4)-Glc-(1→,→6)-Glc-(1→,→3,4)-Gal-(1→,→2,4)-Glc-(1→,→3,5)-Ara-(1→,→4,6)-Gal-(1→,→3,6)-Gal-(1→,對比還原前后甲基化產(chǎn)物摩爾比的變化可以確定其中GalA的連接方式為→3,6)-GalA-(1→,→4,6)-GalA-(1→。范信暉等[5]通過甲基化分析兩種單體多糖APS-Ⅰ和APS-Ⅱ的GC-MS總離子色譜圖，鑒定苷連接方式,APS-Ⅰ為→4)-L-Ara-(1→,→2)-D-Gal-(1→,→4)-L-Rha-(1→,→6)-D-Glc-(1→,→6)-D-Gal-(1→和→4)-D-Glc-(1→;APS-Ⅱ單糖殘基連接方式為→4)-L-Ara-(1→,→3,4)-D-Gal-(1→,→6)-D-Gal-(1→和→4)-D-Glc-(1→。作為一種有效的分析方法，甲基化的分析結(jié)果同樣與文獻(xiàn)報(bào)道的其他確證結(jié)構(gòu)的分析方法如FT-IR和NMR分析的結(jié)果相互印證[6]。

1.2 人參多糖

人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，在我國主要分布于遼寧東部、吉林東半部和黑龍江東部。人參在我國有悠久的藥用歷史，有“百草之王”的稱號，也是著名的“東北三寶”之一[7]。人參含有多種有效成分，如皂苷、揮發(fā)油、糖類、多肽等[8]。人參總糖含量約占人參成分的4%～6%。人參多糖由于具有多種生物活性而被多糖研究者所研究和報(bào)道，通過甲基化分析對其多糖結(jié)構(gòu)的鑒別和表征也有很多。其甲基化分析得到的連接方式大致分為中性糖和酸性果膠兩大類。

人參多糖的結(jié)構(gòu)研究已有大量的信息。TOMODA等[9]從人參根多糖中分離得到2個(gè)酸性糖Ginsenan PA和Ginsenan PB。先通過羧基還原成相應(yīng)中性糖再進(jìn)行甲基化分析，確定了Ginsenan PA和Ginsenan PB的連接方式，Ginsenan PA為L-Araf-(1→,→5)-L-Araf-(1→,→2)-L-Rhap-(1→,D-Glcp-(1→,D-Galp-(1→,→3)-D-Galp-(1→,→4)-D-Galp-(1→,→6)-D-Galp-(1→,→3,6)-D-Galp-(1→,且還原后的摩爾比為9∶2∶1∶1∶1∶4∶6∶6∶11;Ginsenan PB的連接方式為L-Araf-(1→,→5)-L-Araf-(1→,→2)-L-Rhap-(1→,D-Glcp-(1→,D-Galp-(1→,→4)-D-Galp-(1→,→6)-D-Galp-(1→,→3,6)-D-Galp-(1→,且還原后的摩爾比為4∶8∶8∶4∶1∶32∶18∶9。通過摩爾比的變化可以確定酸性糖連接為→4)-D-GalA-(1→,甲基化的反應(yīng)原理雖然簡單，但是操作過程復(fù)雜且反應(yīng)步驟很多，往往需要反復(fù)甲基化才能實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)的確證。TIAN等[10]從人參中獲得了均一多糖級分SB1-1，通過甲基化分析表明其主要由Gal和GalA組成,是一種富含HG結(jié)構(gòu)的人參果膠多糖，主鏈為→4)-GalA-(1→,側(cè)鏈為→4)-D-Galp-(1→,GalA Gal的O-6位連有→6)-D-Galp-(1→,→3,6)-D-Galp-(1→。ZHANG等[11]從人參多糖中分離得到了一種鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(RG-Ⅰ)果膠WGPA-2-RG，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了甲基化分析。結(jié)果表明WGPA-2-RG連接方式為L-Araf-(1→,→3,5)-L-Araf-(1→,→5)-L-Araf-(1→,Arap-(1→,→3,6)-D-Galp-(1→,→3)-D-Galp-(1→,→6)-D-Galp-(1→,D-Galp-(1→,→2,4)-L-Rhap-(1→,→2)-L-Rhap-(1→,L-Rhap-(1→,且摩爾比為19.7∶18.1∶14.6∶0.5∶20.1∶10.7∶5.9∶5.7∶3.2∶0.7∶0.4。在WGPA-2-RG發(fā)現(xiàn)了大量的阿拉伯糖殘基，與一些Ⅱ型阿拉伯半乳聚糖(AG-Ⅱ)類似。WGPA-2-RG是一種RG-Ⅰ型果膠，以Rha和GalA交替的主鏈和AG-Ⅱ長側(cè)鏈。而AG-Ⅱ長側(cè)鏈由→3)-D-Galp-(1→為骨架結(jié)構(gòu)，和Gal的O-6位上阿拉伯糖和半乳糖取代基組成，通過鼠李糖四位碳連接到主鏈上。WGPA-2-RG的結(jié)構(gòu)鑒定為其免疫活性功能發(fā)揮奠定了基礎(chǔ)。

1.3 麻黃多糖

麻黃是麻黃科麻黃屬植物。麻黃科只有麻黃屬，麻黃屬植物已知近50種，主要分布于北溫帶和南美的部分溫帶地區(qū)[12-15]。2010年版《中國藥典》收載麻黃具有發(fā)汗散寒、宣肺平喘、利水消腫的功效，收載的品種為麻黃科植物草麻黃EphedrasinicaStapf.中麻黃EphedraintermediaSchrenk et C.A.Mey.或木賊麻黃EphedraequisetinaBge.的干燥草質(zhì)莖。

多糖是麻黃中的主要有效成分之一，麻黃多糖具有免疫調(diào)節(jié)、清除自由基、降血糖等多種藥理活性。而對其化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究就更重要?，F(xiàn)階段關(guān)于麻黃多糖研究報(bào)道主要集中于分析多糖含量的測定以及提取工藝的研究，而對麻黃多糖甲基化分析連接方式的文獻(xiàn)報(bào)道并不多。隨著麻黃多糖更多藥理作用的發(fā)現(xiàn)，相信會有更多關(guān)于麻黃多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的報(bào)道。已有文獻(xiàn)關(guān)于麻黃多糖甲基化的報(bào)道，如KUANG等[16]從麻黃根中分離純化得到一種酸性多糖ESP-B4，通過甲基化分析結(jié)合部分酸水解等分析方法，闡明了麻黃多糖ESP-B4的化學(xué)結(jié)構(gòu)，ESP-B4的連接方式為→5)-Araf-(1→,→3,5)-Araf-(1→,α-Xylp-(1→,→3)-Xylp-(1→,→2)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,Glcp-(1→,Manp-(1→,→4)-Manp-(1→,Galp-(1→,→3)-Galp-(1→,→4)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,→4,6)-Galp-(1→,→4)-GalpA-(1→,→3,4)-GalpA-(1→,→4)-GlcpA-(1→,且摩比為3.6∶2.8∶1.0∶0.2∶1.2∶2.8∶1.7∶0.8∶0.8∶2.2∶1.1∶1.5∶2.6∶1.8∶55.2∶18.6∶2.1。酸性糖同樣是先將ESP-B4進(jìn)行羧基還原再甲基化的分析而確定連接和摩爾比。ESP-B4包含→4)-GalpA-(1→,→2)-Rhap-(1→連接，表示其為毛發(fā)區(qū)骨架，以阿拉伯聚糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸為側(cè)鏈。果膠中GlcA并不常見，通過鼠李糖殘基O-4和半乳糖醛酸O-3與主鏈連接。XIA等[17]進(jìn)一步研究麻黃多糖，并從麻黃根中分離純化得到一種阿拉伯聚糖ESP-B1H，甲基化分析明確了ESP-B1H的精細(xì)結(jié)構(gòu)，其重復(fù)結(jié)構(gòu)單元中各種糖殘基的比例為→5)-α-Araf-(1→,→3,5)-α-Araf-(1→,α-Araf-(1→,→3)-α-Araf-(1→,→2,5)-α-Araf(1→,摩爾比為10∶2∶3∶2∶1,以→5)-α-Araf-(1→作為主鏈的骨架結(jié)構(gòu)，在其O-2和O-3位有分支點(diǎn)。關(guān)于麻黃多糖結(jié)構(gòu)方面的文獻(xiàn)欠缺還有待深化。如果能通過甲基化分析鑒定麻黃多糖中更多的連接類型，可能會發(fā)現(xiàn)更多結(jié)構(gòu)與功能的構(gòu)效關(guān)系。值得注意的是，甲基化分析并不是獨(dú)立的分析方法，它往往和其他分析方法如核磁、紅外、部分酸水解等相互佐證、共同確證結(jié)構(gòu)。而在這些分析方法中，甲基化分析是重要的一環(huán)，是不可忽略的。

1.4 五味子多糖

五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實(shí)。五味子的果實(shí)一般為球形，多呈不規(guī)則或扁形，多呈紅色，果實(shí)油潤，果肉柔軟，種子多呈腎形?！短票静荨酚涊d五味子曰：“果實(shí)五味，皮肉甘、酸，核中辛、苦，都有咸味。此則五味俱也?！蔽逦蹲庸麑?shí)味酸，性溫，具有益氣、斂肺、滋腎澀精、生津止渴、止瀉斂汗等功能,用于久虛咳喘、久瀉不止、內(nèi)熱消渴、心悸失眠等[18-19]。五味子的主要活性成分有木脂素、多糖、萜類等，大量研究表明五味子多糖具有保肝、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[20-22]。

目前關(guān)于五味子多糖的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)研究報(bào)道很少，國內(nèi)有關(guān)五味子的結(jié)構(gòu)研究主要集中在測定多糖含量、單糖組成、NMR等[23]。XU等[24]通過水提分離純化得到兩種五味子多糖(SCP),主要組分分別為SCP1和SCP2，并通過Sephades CL-6B進(jìn)一步純化SCP2，通過甲基化分析SCP2得到GC-MS質(zhì)譜圖，從而確定SCP2的連接方式為Galp-(1→,→4)-Galp-(1→,→4)-Glcp-(1→,→4,6)-Galp-(1→,摩爾比為3.25∶10.88∶82.62∶3.25。其中→4)-Galp-(1→,→4)-Glcp-(1→為其主要的連接方式。當(dāng)然需要指出的是對于不同單糖相同苷連接的異構(gòu)體，由于質(zhì)譜圖和特征離子相同，并不能從甲基化分析得到準(zhǔn)確結(jié)果。目前通常是結(jié)合核磁分析等其他分析方法輔助定性。而未來如何通過總結(jié)診斷特征離子或歸納異構(gòu)體的特定參數(shù)進(jìn)行區(qū)分同樣也是甲基化分析所面臨的一個(gè)難點(diǎn)問題。ZHAO等[25]通過DEAE纖維素-52和Sephadex-100分離純化得到一種新的五味子多糖SCP-22，分子量為(143±0.13)KDa。通過甲基化分析的方法結(jié)合保留時(shí)間并與文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)的質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，得出SCP22的葡萄糖和半乳糖的苷連接方式為Galp-(1→,→4)-Glcp-(1→,→4,6)-Glcp-(1→,且摩爾比為1.95∶16.54∶1,其中SCP22的主鏈?zhǔn)瞧咸烟菤埢?。Glc和Gal的比例(8.99∶1.00)與總單糖組成接近(8.85∶1.00),證實(shí)了甲基化分析結(jié)果的可靠性。ZHAO等[26]通過DEAE-52纖維素Sephadex G-100對五味子多糖進(jìn)行提取純化得到了一種低分子量多糖SCPP11，首次系統(tǒng)地闡述了SCPP11，并通過甲基化分析確定了SCP11的結(jié)構(gòu)，連接方式為Glcp-(1→,→4)-Galp-(1→,→4)-Glcp-(1→,→6)-Manp-(1→,→4,6)-Galp-(1→,摩爾比為2.05∶1.27∶10.34∶1.00∶2.00,重復(fù)單元片段主要由62.34%的→4)-D-Glcp-(1→,7.85%的→4)-D-Galp-(1→,5.92%的→6)-D-Manp-(1→,11.95%的→4,6)-D-Galp-(1→組成。根據(jù)甲基化分析確定SCP11的主干→4)-Galp-(1→,→4)-Glcp-(1→,→6)-Manp-(1→,→4,6)-Galp-(1→,Gal的C-4位置有一個(gè)分支，分支由→4)-Glcp-(1→和Glcp-(1→組成。綜上可以看出五味子多糖大多為葡萄糖半乳糖等六碳糖，而關(guān)于五味子多糖結(jié)構(gòu)研究中半乳糖和葡萄糖的比例和連接方式一直是研究的難點(diǎn)，二者的相同苷連接即使通過GC-MS質(zhì)譜圖的比較也難以區(qū)分，大多是根據(jù)多糖研究者的經(jīng)驗(yàn)結(jié)合文獻(xiàn)加以判斷。如何解決異構(gòu)體的鑒別也是甲基化研究者所面臨的問題之一。雖然關(guān)于五味子多糖的結(jié)構(gòu)研究報(bào)道還不是很多，但五味子多糖含量高，制備方法簡單，藥理活性強(qiáng)。相信在未來仍有較好的發(fā)展前景。

1.5 川芎多糖

川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，味辛，性溫，具有活血止痛、行氣開郁等功效。主要產(chǎn)于四川、云南、廣西等地。在東北也有分布，稱之為“東川芎”。川芎化學(xué)成分的研究已經(jīng)成熟并且深入，而關(guān)于川芎多糖的研究相對來說還不夠完善。

HUANG等[27]通過優(yōu)化提取條件，分離純化得到兩個(gè)川芎果膠多糖LCP-Ⅰ和LCP-Ⅱ。通過凝膠過濾進(jìn)一步純化獲得川芎根莖中提取的果膠多糖LCP-Ⅱ-Ⅰ。甲基化分析確定其連接方式Araf-(1→,→5)-Araf-(1→,→3,5)-Araf-(1→,→2,3,5)-Araf-(1→,Rhap-(1→,→2)-Rhap-(1→,→2,3)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,Galp-(1→,→4)-Galp-(1→,→4)-GalAp-(1→,→3,4)-GalAp-(1→,摩爾比為6.4∶5.3∶9.6∶0.9∶0.5∶2.6∶0.6∶4.2∶3.1∶16.3∶45.2∶3.5。果膠由線性高聚半乳糖醛酸(HG)區(qū)域和具有分支的鼠李糖半乳糖醛酸(RG)Ⅰ和Ⅱ區(qū)域組成。LCP-Ⅱ-Ⅰ包含→4)-GalAp-(1→的苷連接，表示其為HG區(qū)骨架?！?)-GalAp-(1→以及在3，4位上存在分支的→2)-Rhap-(1→表明RG-I在LCP-Ⅱ-Ⅰ中的存在。LCP-Ⅱ-Ⅰ中不存在AG-Ⅱ聚合物,由于其不含→3)-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,Arap-(1→的苷連接。LCP-Ⅱ-Ⅰ中1,4-Galp的高百分比表明存在AG-Ⅰ。而ZOU等[28]通過陰離子交換色譜柱分離純化得到川芎多糖的純化組分LCP-I-I，將分離純化后的樣品還原、甲基化、水解、還原、乙?；?，用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)對活性多糖組分LCP-I-I進(jìn)行了系列分析。確定了LCP-I-I的連接方式為Araf-(1→,→5)-Araf-(1→,→3,5)-Araf-(1→,→2,3,5)-Araf-(1→,Rhap-(1→,→2)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,Galp-(1→,→4)-Galp-(1→,→3)-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,4)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,Glcp-(1→,→4)-Glcp-(1→,→4)-GalAp-(1→,摩爾比為9.4∶4.7∶11.1∶3.4∶0.5∶2.6∶2.8∶4.9∶14.1∶2.4∶1.2∶1.2∶2.4∶3.1∶12.3∶22.6。結(jié)果表明，與之前不同的是→3)-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→的存在可知LCP-I-I中還存在AG-Ⅱ側(cè)鏈，LCP-I-I中的Ara有Araf-(1→,→5)-Araf-(1→,→3,5)-Araf-(1→,→2,3,5)-Araf-(1→,表明LCP-I-I中的Ara是高度支化的→5)-Araf-(1→。甲基化過程可能導(dǎo)致甲基化不足，因?yàn)榉种c(diǎn)的程度略高于末端基團(tuán)。這可能是由非常緊密的分子引起的，或者是由于甲基化過程中使用的溶劑溶解度低造成的。木糖是甲醇分解后少量鑒定的單糖之一。LCP-I-I中Glcp-(1→,→4)-Glcp-(1→的存在表明可能存在來源于纖維素碎片的葡聚糖聚合物。ZHANG等[29]進(jìn)一步研究川芎多糖，從川芎中分離純化得到了一種具有免疫作用的阿拉伯聚糖LCP70-2A，通過甲基化分析GC-MS檢測得到LCP70-2A連接方式為L-Araf-(1→,→5)-L-Araf-(1→,→3,5)-L-Araf-(1→,→2,3,5)-L-Araf-(1→,摩爾比為7.8∶5.0∶5.7∶1.0。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明LCP70-2A可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用以增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)因子。甲基化分析結(jié)果表明，LCP70-2A是一種均一的阿拉伯聚糖，→5)-L-Araf-(1→為主鏈，L-Araf-(1→的O-2和O-3處存在分支。川芎多糖的研究國內(nèi)主要集中于提取工藝的研究較多，甲基化結(jié)構(gòu)表征的研究較少，隨著川芎更多的藥理作用被發(fā)現(xiàn)，相信川芎多糖的甲基化分析會有更廣闊的研究價(jià)值。

1.6 桔梗多糖

桔梗為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根[18]。別名鈴鐺花、和尚帽等，是多年生草本植物。桔梗不僅是我國傳統(tǒng)中藥，而且還兼食、觀賞、藥用的珍稀經(jīng)濟(jì)植物。桔梗的干燥根部味苦、辛，性微溫，能祛痰止咳、宣肺、排膿。多糖屬于桔梗的重要活性成分且在桔梗根中的含量高達(dá)61.2%[30-31]。桔梗多糖能夠顯著抑制宮頸癌細(xì)胞株U-14小鼠移植瘤生長[32],在抗疲勞[33]、抑真菌[34]等方面發(fā)揮著一定的作用，有效劑量的桔梗多糖還能夠?qū)2O2致PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷起到保護(hù)作用[35]。

關(guān)于甲基化分析桔梗多糖的連接方式具有重要研究價(jià)值。PANG等[36]采用DEAE陰離子交換層析法從桔梗水提液中分離得到菊粉型果聚糖(PGF)。甲基化分析結(jié)果表明，PGF主要由Fruf-(1→,Glcp-(1→,→2)-Fruf-(1→組成，摩爾比分別為1∶2∶7。ZOU等[37]在確定單糖組成后，通過甲基化分析確定PGP-I-I糖殘基之間的連接方式為L-Araf-(1→,→5)-L-Araf-(1→,→3,5)-L-Araf-(1→,Rhap-(1→,→2)-Rhap-(1→,→3)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,Galp-(1→,→4)-Galp-(1→,→3)-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,GalAp-(1→,→4)-GalAp-(1→,摩爾比為12.9∶5.6∶13.9∶1.3∶4.0∶0.6∶2.4∶2.6∶9.1∶0.9∶0.7∶1.3∶1.1∶42.1。PGP-I-I含有果膠多糖中存在的典型糖苷鍵。首先，由于存在較高含量的→4)-GalAp-(1→,形成了以高聚半乳糖醛酸(HG)為主的主干。從桔梗中分離純化得到一種經(jīng)鑒定僅含有1→4連接的高聚半乳糖醛酸,歸屬于毛發(fā)區(qū)域的典型→2)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,鼠李糖的含量表明主骨架區(qū)域大約有5%的支鏈附著。毛發(fā)區(qū)也被稱為I型鼠李半乳糖醛酸(RG-I)，將會在鼠李糖的4位上連接由不同比例的半乳糖、阿拉伯糖組成的側(cè)連結(jié)構(gòu)。主要由1,4-Gal連接著T-Ara的鏈被叫作I型阿拉伯半乳聚糖(AG-I)，當(dāng)半乳糖苷連接為1,3-,1,6-,1,3,6-時(shí),是典型的Ⅱ型阿拉伯半乳聚糖(AG-Ⅱ)。AG-I約占聚合物摩爾百分含量的9.1%。末端鼠李吡喃糖也可以是該域的一部分。聚合物與Yariv試劑形成紅色沉淀物，這表明PGP-Ⅱ中存在AG-Ⅱ型聚合物，也表明是基于存在的Gal鍵。由AG-Ⅱ組成的一小部分鏈連接在RG-I區(qū)域上，約占總多糖摩爾百分含量的2.9%，淺色沉淀物和低含量的1,3-連接Galp(0.9%)也證實(shí)了這一點(diǎn)，這對結(jié)合Yariv試劑很重要。此外，單糖組成阿拉伯糖摩爾百分含量超過了30%。阿拉伯糖鏈?zhǔn)且愿咧Щ摹?)-L-Araf-(1→為主鏈,在3位(13.9%)上連接著大量的L-Araf-(1→(12.9%)。該阿拉伯聚糖部分可以直接連接到RG-I區(qū)中Rha的4位，或者連接到AG-I和/或AG-Ⅱ鏈的Gal上。在ZOU等[28]的研究中發(fā)現(xiàn)的這些糖苷連接與之前只有一項(xiàng)對桔梗中性多糖的研究相似。發(fā)現(xiàn)主要構(gòu)成為→4)-Galp-(1→和→5)-L-Araf-(1→，其次是少量的末端L-Araf-(1→,→3,5)-L-Araf-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,但沒有GalpA?？赡苁羌兓椒?，尤其是洗脫系統(tǒng)不同,這可能是造成這種差異的主要因素。XU等[38]從桔梗中分離純化得到一種水溶中性阿拉伯半乳聚糖PGAW1,經(jīng)過甲基化分析得到不同的苷連接Araf-(1→,→5)-L-Araf-(1→,→3,5)-L-Araf-(1→,Galp-(1→,→4)-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,摩爾比為17.5∶25.6∶14.6∶5.7∶21.6∶6.9∶8.1。通過甲基化分析確定PGAW1的結(jié)構(gòu)為→4)-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→組成主鏈，在主鏈→6)-Galp-(1→的O-3上存在分支側(cè)鏈，側(cè)鏈有→5)-L-Araf-(1→,→3,5)-L-Araf-(1→。L-Araf-(1→連接在→3,5)-L-Araf-(1→的O-3，而Galp-(1→可能連接在→3,5)-L-Araf-(1→的O-3上，同時(shí)也可能連接在主鏈→6)-Galp-(1→的O-3上。甲基化分析結(jié)果表明PAGW1分支明顯，主要分支點(diǎn)為→3,5)-L-Araf-(1→(14.6%)和→3,6)-Galp-(1→(8.1%)。桔梗多糖結(jié)構(gòu)分析是其生物活性研究的前提，而如何有效通過甲基化分析和發(fā)現(xiàn)更多結(jié)構(gòu)類型的桔梗多糖，從而為闡明桔梗多糖的價(jià)值打下基礎(chǔ)仍是桔梗多糖研究者的主要研究內(nèi)容。

2 小結(jié)與展望

多糖是維持生命正常運(yùn)轉(zhuǎn)的基本物質(zhì)之一，多糖研究一直是熱點(diǎn)領(lǐng)域。雖越來越受到重視，但是關(guān)于多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究與蛋白質(zhì)和核酸相比還存在很大的差距，主要是因?yàn)槎嗵墙Y(jié)構(gòu)和功能的聯(lián)系始終是薄弱的一環(huán)?，F(xiàn)代多糖的提取分離技術(shù)和手段日益成熟，分離純化所得到的多糖結(jié)構(gòu)也就愈加復(fù)雜。經(jīng)過一個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展，甲基化分析方法已由克量級進(jìn)入微克量級，并廣泛用于多種中藥多糖的結(jié)構(gòu)鑒定中。

常用的甲基化分析方法有很多，Haworth、Purdie、Hakomori、Kuhn法等，這些方法雖操作不同，但是反應(yīng)原理都大致相同。甲基化分析是多糖結(jié)構(gòu)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，雖經(jīng)不斷改進(jìn)和完善，但對于酸性多糖而言，仍不能直接準(zhǔn)確鑒定。而未來甲基化分析如何解決現(xiàn)在遇到的瓶頸問題，比如異構(gòu)體的鑒別和如何簡化甲基化分析步驟，提高甲基化應(yīng)用于各種復(fù)雜多糖的結(jié)構(gòu)分析等將是甲基化分析在接下來的研究中所面臨的難點(diǎn)。