KU蛋白在泌尿系腫瘤中的作用研究進(jìn)展

饒曉勝，黃錦坤

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，廣東省泌尿外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510120)

自1981年日本學(xué)者首次在結(jié)締組織病中發(fā)現(xiàn)了KU蛋白后[1]，人們對KU蛋白進(jìn)行了多方面及多領(lǐng)域的研究，發(fā)現(xiàn)KU蛋白可參與多種細(xì)胞功能調(diào)控，如DNA損傷修復(fù)[1]、DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄[2]、端粒維持[3]、細(xì)胞凋亡[4]等。近年來人們對KU蛋白有了更深入、更廣泛的認(rèn)識，已證實(shí)KU蛋白的多種細(xì)胞功能活動與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療、預(yù)后等有著密切的聯(lián)系[5]。其中不乏KU蛋白在泌尿系腫瘤的研究。

1 KU蛋白的表達(dá)與結(jié)構(gòu)

KU蛋白是廣泛存在的蛋白質(zhì)，在人體多個器官的正常組織及腫瘤組織內(nèi)被發(fā)現(xiàn)呈陽性表達(dá)[6],有研究發(fā)現(xiàn)其在非洲瓜蟾的卵巢和睪丸中也表達(dá)[7]。KU蛋白是一種核蛋白，主要存在于核仁[1]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)其存在于細(xì)胞質(zhì)中[8]。研究發(fā)現(xiàn)KU異源二聚體中的KU70是一種膜蛋白[9]，這有待進(jìn)一步研究證實(shí)。在DNA受損時，KU蛋白能夠從核仁轉(zhuǎn)移到核質(zhì)，參與DNA損傷修復(fù)[10]。KU蛋白是由KU70和KU80組成的異源二聚體[11]，是一種自身抗原。

KU70和KU80由N-末端α/β結(jié)構(gòu)域、中央β-Barrel結(jié)構(gòu)域和螺旋狀的羧基C-末端結(jié)構(gòu)域組成[12]，其中每個結(jié)構(gòu)域都發(fā)揮著不同的細(xì)胞功能，N-末端α/β結(jié)構(gòu)域是DNA結(jié)合的核心結(jié)構(gòu)域，破壞酵母此結(jié)構(gòu)域已被發(fā)現(xiàn)會損害DNA修復(fù)[13]，KU80該結(jié)構(gòu)域已被證明與一種非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)DNA修復(fù)酶相互作用蛋白(aprataxin and pnk-like factor，APLF)相互作用，對招募其他修復(fù)因子至關(guān)重要[14]。β-Barrel結(jié)構(gòu)域位于KU蛋白二聚體中間，把DNA雙鏈包裹，以支架的形式與DNA結(jié)合[12]。螺旋狀的羧基C-末端結(jié)構(gòu)域含有SAP結(jié)構(gòu)域[15]，然而SAP結(jié)構(gòu)域可以和其他SAP結(jié)構(gòu)域蛋白的DNA結(jié)合[16]，此外C-末端結(jié)構(gòu)域還可以與DNA依賴性蛋白激酶催化亞單位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)結(jié)合，調(diào)節(jié)DNA-PKcs的功能，當(dāng)DNA損傷時，KU異源二聚體與雙鏈DNA結(jié)合[17]，促進(jìn)DNA-PKcs在DNA斷裂時的自動磷酸化，通過NHEJ修復(fù)途徑促進(jìn)DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break，DSB)的修復(fù)[17]，眾所周知，KU對于在DSB中招募和激活DNA-PKcs很重要。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，斷裂的DNA序列和末端結(jié)構(gòu)也可能在DNA-PKcs組裝中發(fā)揮作用，特別是影響DNA-PKcs與KU80 C-末端之間的相互作用[18]。這是KU蛋白參與DNA損傷修復(fù)的橋梁。國外學(xué)者在熒光顯微鏡下利用KU異源二聚體和DNA末端結(jié)合狀態(tài)下F?rster共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的差異來測量DNA結(jié)合和釋放動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)復(fù)合物比KU70、KU80單獨(dú)使用更穩(wěn)定，其穩(wěn)定性受DNA依賴性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase， DNA-PK)磷酸化狀態(tài)的影響。KU70、KU80的C端SAP結(jié)構(gòu)域是KU70、KU80與DNA末端穩(wěn)定結(jié)合所必需的，但這種作用在DNA-PK全復(fù)合物中被取消[19]，其中的未知機(jī)制有待深入研究。

最近，研究者用低溫電子顯微鏡(CryoEM)研究了DNA-PKcs的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs和KU蛋白分別識別和結(jié)合DNA，共同導(dǎo)致DNA雙鏈30°扭曲的模型[20]。研究者研究出了3.5°分辨率的DNA-PKcs的冷凍EM結(jié)構(gòu)，并揭示了由KU80 C-末端介導(dǎo)的二聚體形成是KU80保守的C-末端螺旋的結(jié)構(gòu)域交換[21]。揭示了DNA-PKcs二聚體將斷裂的DNA末端連接在一起的新機(jī)制，這些模型或許能為基于結(jié)構(gòu)的藥物靶向治療提供新思路。隨著研究的深入，或許能夠更加了解KU蛋白的結(jié)構(gòu)及與DNA-PKcs之間的作用機(jī)制，為相關(guān)的疾病提供新的治療手段。

2 KU蛋白參與的DNA損傷修復(fù)反應(yīng)

細(xì)胞時刻受到內(nèi)外源性的因素影響，當(dāng)DNA 損傷時，依據(jù)損傷程度，可大致分為堿基損傷和單鏈斷裂、雙鏈斷裂等多種形式，以DNA雙鏈斷裂最為嚴(yán)重。目前對KU蛋白的研究多為KU蛋白在DNA發(fā)生DSB時參與DNA損傷修復(fù)機(jī)制中的作用。DNA發(fā)生DSB時，可以通過同源重組(homologous recombination，HR)和NHEJ途徑修復(fù)損傷的DNA雙鏈。

當(dāng)DNA發(fā)生DSB時，細(xì)胞是如何在兩者中抉擇的機(jī)制尚不清楚。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在非洲瓜蟾卵提取液研究RecQ4N端598個氨基酸區(qū)域，可能通過影響KU異源二聚體與DNA末端的結(jié)合來影響DSB修復(fù)途徑的選擇[7]。另一研究證明CDK Pho85磷酸化YKU80來調(diào)節(jié)NHEJ活性，這可能是細(xì)胞通過G1-CDK介導(dǎo)HR和NHEJ修復(fù)途徑之間的選擇[22]。有學(xué)者在小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs T2609磷酸化能夠促進(jìn)NHEJ修復(fù)途徑的選擇[23]。同年，研究發(fā)現(xiàn)KU80泛素化也可以影響損傷細(xì)胞對NHEJ及HR途徑的選擇[24]。細(xì)胞在發(fā)生DSB時，目前不清楚在怎樣的細(xì)胞環(huán)境下做出最合適、最優(yōu)的選擇，有待研究者進(jìn)一步深入地研究。

HR具有較高保真度，其需要多種修復(fù)蛋白的參與，如MRN復(fù)合體、CHK2激酶，PARP基因、Rad50蛋白、ATM等。DNA鏈的斷裂形成以后，CHK2在感知DNA損傷和激活DDR中起關(guān)鍵作用[25]。最近的研究發(fā)現(xiàn)Mre11核酸酶與Rad50和NBS1一起形成一個稱為MRN的復(fù)合體[26]，參與HR途徑的全過程。ATM蛋白可以磷酸化Rad50-Mrell-Xrs2復(fù)合物中Rad50蛋白的酪氨酸殘基，從而促進(jìn)了同源重組修復(fù)復(fù)合物形成[26]，一個研究小組證明了KU是ATM依賴的ATR激活所必需的蛋白[27]。

相比較HR，對KU蛋白在DNA損傷修復(fù)中作用的研究更多在NHEJ。NHEJ 可分為c-NHEJ和a-NHEJ,而c-NHEJ是修復(fù)DSB的主要通路[28]。如同HR修復(fù)，NHEJ也需要眾多修復(fù)蛋白質(zhì)的參與，如KU蛋白、DNA-PKcs、RecQ4、XRCC4、XLF、DNA連接酶Ⅳ(LigⅣ)、CRISPR/Cas13、DNA聚合酶μ等。當(dāng)DNA發(fā)生雙鏈斷裂損傷后，KU異二聚體首先識別并結(jié)合到DNA的斷裂末端，啟動NHEJ[29]，通過KU80的C-末端結(jié)構(gòu)域招募到DNA-PKcs[30]，與之結(jié)合成DNA-PK全酶，研究表明DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)了CTD KU80參與KU70/80-DNA-PKcs相互作用[18, 30]。然后發(fā)出信號進(jìn)一步募集其他修復(fù)蛋白，如 XRCC4 和DNA連接酶Ⅳ、XLF等因子形成修復(fù)復(fù)合物，然后再募集DNA聚合酶μ、DNA聚合酶λ等因子對DNA 末端進(jìn)行修飾，使得修復(fù)復(fù)合物有效連接斷裂的DNA 兩端，再進(jìn)行一系列機(jī)制完成DSB修復(fù)。

研究發(fā)現(xiàn)LigⅣ、XRCC4和XLF形成了一個長距離突觸復(fù)合體，然而KU和DNA-PKcs組成的兩個DNA末端結(jié)合子通過DNA-PKcs亞基與LigⅣ、XRCC4、XLF復(fù)合體支架相互作用而連接。DNA-PKcs分子的相對取向提示了反式作用中的一種自磷酸化機(jī)制，該機(jī)制導(dǎo)致DNA-PKcs的解離和向短程突觸復(fù)合體的過渡。KU結(jié)合的DNA末端被XLF錨定的支架排列起來進(jìn)行加工和連接，LigⅣ的1個催化結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定地與2個KU分子之間的缺口相連，提示DSB的2條鏈的連接涉及2個LigⅣ分子[31]。此外，CRISPR/Cas13系統(tǒng)能有效地下調(diào)HEK293T細(xì)胞中KU70和的LigⅣ的表達(dá)[32]，這也許提示了CRISPR/Cas13系統(tǒng)在各種修復(fù)蛋白質(zhì)作用期間起調(diào)節(jié)平衡作用，其中的機(jī)制及意義有待進(jìn)一步研究。最近研究發(fā)現(xiàn)POLθ的N端具有DNA依賴的ATP酶活性，參與一條新的DSB修復(fù)路線，稱為“替代末端連接”(alternative end joining,ALTEJ)。ALTEJ不依賴于DNA結(jié)合的KU蛋白復(fù)合體[33]。研究發(fā)現(xiàn)泛素連接酶RNF8能夠促進(jìn)ALTEJ，但可能需要有限的末端切除[34]。

目前研究雖然認(rèn)識到了KU蛋白與DNA-PKcs及其他修復(fù)蛋白的作用，但是對其之間相互作用的調(diào)節(jié)機(jī)制了解不多。最近研究發(fā)現(xiàn)，一些RNA參與其中，如LRIK，是一種新的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA)，能夠與KU異源二聚體相互作用，增強(qiáng)了KU異源二聚體檢測DSB存在的可能，促進(jìn)KU異源二聚體在DSB位點(diǎn)的結(jié)合，并促進(jìn)有效感應(yīng)和修復(fù)DSB所需的下游修復(fù)因子的組裝，而且LRIK對于通過非同源末端連接途徑有效修復(fù)DSB是必要的[35]。有研究發(fā)現(xiàn)另一種RNA,稱為LINP1，通過RNA-RNA相互作用自組裝成相分離的凝聚體，以其中的結(jié)構(gòu)基序與KU結(jié)合，促進(jìn)KU的多聚化和NHEJ初始突觸事件的穩(wěn)定[36]。此外，脫泛素酶OTUD5通過增加KU80的穩(wěn)定性而發(fā)揮著NHEJ修復(fù)的重要調(diào)節(jié)作用，OTUD5的缺失損害NHEJ的修復(fù)，從而降低了DSB的整體修復(fù)[24]。

3 KU蛋白與泌尿系腫瘤

泌尿系腫瘤是人類比較常見的腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)KU蛋白所參與的細(xì)胞功能與泌尿系腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診治和預(yù)后均有關(guān)聯(lián)[12]。

3.1 KU蛋白與前列腺癌對于局部轉(zhuǎn)移的前列腺癌，放射治療是目前治療腫瘤的一種重要方法和手段。其主要作用機(jī)制是通過射線放射損傷使前列腺癌細(xì)胞DNA雙鏈斷裂，從而殺滅腫瘤細(xì)胞[37]。而且雄激素能夠直接調(diào)控DNA修復(fù)基因的表達(dá)，能直接與KU70相結(jié)合，刺激KU70的表達(dá)，并保護(hù)前列腺癌細(xì)胞免受DNA損傷[38]，RNA聚合酶2延長因子相關(guān)因子-2(RNA polymerase Ⅱ elongation factor-associated factor-2，EAF2)在雄激素調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞DNA修復(fù)中具有潛在的作用，EAF2和RNA聚合酶1延長因子相關(guān)因子-1(RNA polymerase I elongation factor-associated factor-1，EAF1)對于KU70、KU80在DNA損傷位點(diǎn)的募集和保留是必需的，并發(fā)揮著在非同源末端連接DNA修復(fù)中的功能作用。EAF2不影響KU蛋白的表達(dá)水平，僅使KU蛋白在DNA損傷末端的募集和保留減少[38]。另一研究表明缺氧誘導(dǎo)因子-1a(hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a)能夠通過誘導(dǎo)β-聯(lián)合蛋白核易位促使KU70及KU80表達(dá)增高，從而增加前列腺癌細(xì)胞損傷修復(fù)能力，對放射敏感性下降[39]；RNA聚合酶2延長因子(RNA polymerase Ⅱ elongation factor，ELL2)是前列腺癌的抑癌基因，通過阻止聚合酶轉(zhuǎn)錄時的暫停來增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率，并且可以抑制特定啟動子的轉(zhuǎn)錄過程啟動。ELL2對前列腺癌細(xì)胞損傷具有修復(fù)作用，能與KU70、KU80結(jié)合，但與KU80結(jié)合程度較KU70高，KU蛋白作為NHEJ通路DSB的感應(yīng)器，增強(qiáng)DNA雙鏈斷裂的NHEJ修復(fù)途徑[40]。我國學(xué)者黃錦坤、譚卉妍等[41-42]研究發(fā)現(xiàn)，抑制前列腺癌細(xì)胞中 KU70、KU80蛋白表達(dá)水平，結(jié)合熱休克治療，可明顯提高前列腺癌細(xì)胞對放射治療的敏感性。用免疫組化SP法檢測前列腺癌標(biāo)本KU70均陽性表達(dá),而且表達(dá)強(qiáng)度與Gleason 評分和血清前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA) 相關(guān)，隨著前列腺癌Gleason評分和血清PSA值升高,KU80蛋白表達(dá)水平明顯增高[43-44]。酪氨酸蛋白酶抑制劑協(xié)同AG1024(IGF-1R磷酸化抑制劑)能夠抑制RAD51和KU70水平，從而抑制了HR和NHEJ途徑，使得前列腺癌細(xì)胞對放療敏感性增高[45]。另一研究表明，磷酸二酯酶5(phosphodiesterase 5，PDE5)抑制劑能夠降低RAD51水平及KU80與DNA斷端的結(jié)合，從而抑制前列腺癌細(xì)胞的HR和NHEJ，使得前列腺癌細(xì)胞對放療增敏[46]。這些研究都表明，KU蛋白很可能是治療前列腺癌的一個重要靶點(diǎn)。此外，研究表明，KU70表達(dá)水平是前列腺癌的一個重要的獨(dú)立預(yù)后因素，而且Gleason評分結(jié)合KU70表達(dá)水平能夠指導(dǎo)前列腺癌的放療劑量[47]。綜上所述，KU蛋白與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展、療效、預(yù)后有著緊密關(guān)系，這可能為解決目前前列腺癌放療抵抗性、化療耐藥性及靶向治療等難題提供新的思路，是提升前列腺癌綜合治療及個體化治療的不錯方向。

3.2 KU蛋白與膀胱癌膀胱癌是我國最常見的泌尿系腫瘤，KU蛋白的細(xì)胞功能很可能參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，X射線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白5(X-ray repair cross complementing 5， XRCC5)是參與DSB的基因，在膀胱癌患者中的XRCC5啟動子中較少地串聯(lián)重復(fù)序列，與XRCC5蛋白水平升高相關(guān)，而且沒有攜帶2個串聯(lián)重復(fù)等位基因者患膀胱癌的風(fēng)險更高[48]。這不難推測XRCC5基因直接或間接與KU蛋白相互作用，參與膀胱癌的發(fā)生。另一學(xué)者研究KU異源二聚體在膀胱癌中的表達(dá)及DNA結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中KU活性和表達(dá)均高于正常組織，而且對兩組研究對象分別行1 Gy或2 Gy的X射線照射后，評估KU的DNA結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)X射線照射后，正常細(xì)胞胞漿內(nèi)磷酸化KU減少，細(xì)胞核內(nèi)磷酸化KU增加。表明了KU蛋白可能在調(diào)節(jié)膀胱腫瘤DSB修復(fù)的DNA-PKcs活性中發(fā)揮作用[49]。此外，一項(xiàng)臨床研究表明,KU蛋白在膀胱癌組織及其癌旁組織中均有表達(dá)[50]。KU蛋白無論是在肌層浸潤性膀胱癌還是非浸潤性膀胱癌組織中的表達(dá)量均較癌旁組織明顯增高，同時發(fā)現(xiàn)KU蛋白表達(dá)量在肌層浸潤性膀胱癌比非肌層浸潤性膀胱癌明顯減少，提示KU蛋白對膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展及其侵襲性存在一定的關(guān)系。研究表明，E2F1(細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-1)可直接反式激活KU70、KU80，影響膀胱癌細(xì)胞的侵襲性[51]。在治療方面，最近的研究發(fā)現(xiàn)，伊馬替尼對KU80敲除的膀胱癌細(xì)胞的放射增敏[52]?？偟膩碚f，如今對KU蛋白在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制認(rèn)識不多，需要更多學(xué)者進(jìn)一步研究。

3.3 KU蛋白與腎細(xì)胞癌腎細(xì)胞癌，是泌尿系統(tǒng)三大腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的身體健康。然而研究者對KU蛋白與腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究不及前列腺癌。有臨床研究KU70基因多態(tài)C-1310G和腎細(xì)胞癌預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)KU70基因啟動子區(qū)的C-1310G能夠顯著降低KU70基因的轉(zhuǎn)錄活性[53]，這也許說明KU蛋白參與了腎細(xì)胞癌的發(fā)生過程，其中更深入的機(jī)制有待研究。QI等[54]研究KU70表達(dá)水平對腎癌細(xì)胞放射敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)上調(diào)786-O細(xì)胞的KU70表達(dá)水平，能夠降低腎癌細(xì)胞對輻射的敏感性，下調(diào)則可顯著增強(qiáng)腎癌細(xì)胞對輻射的敏感性，這提示了KU蛋白可能與腎細(xì)胞癌對放療不敏感有著緊密聯(lián)系。除了放療治療，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)熱療也許是一種不錯的抗癌方法。探討熱療對腎癌786-O細(xì)胞的影響及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)高溫可誘導(dǎo)腎癌786-O細(xì)胞凋亡，而且能夠顯著抑制KU80的表達(dá)[55]，高溫是否可抑制KU80 的表達(dá)從而誘導(dǎo)了腎癌細(xì)胞的凋亡，有待研究。在腎癌病因方面，研究表明KU70A-31G多態(tài)性與腎細(xì)胞癌的發(fā)生及遺傳性有關(guān)[56]。

3.4 KU蛋白與睪丸腫瘤及陰莖癌目前國內(nèi)外有待對KU蛋白在睪丸腫瘤及陰莖癌中的更多研究。

4 總結(jié)與展望

KU蛋白自發(fā)現(xiàn)以來，受到學(xué)者廣泛關(guān)注及研究，從而對KU蛋白的認(rèn)識更加深入及廣泛，現(xiàn)已明確其主要與一些免疫性疾病、惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。同時KU蛋白在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展、治療、預(yù)后方面也得到許多研究。相對而言，在腎細(xì)胞癌及膀胱癌的研究稍欠缺。本文對KU蛋白主要參與的DNA損傷修復(fù)功能在泌尿系腫瘤的研究進(jìn)展做了綜述，較全面地總結(jié)了其中的機(jī)制。在未來，隨著對KU蛋白的研究更加深入，也許能夠更好地開發(fā)靶向KU蛋白在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的治療策略。