臨床胰島制備研究進(jìn)展

劉堯娟，鄒家琦

（1.天津市第一中心醫(yī)院移植中心，天津 300192；2.國家衛(wèi)建委危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300100）

胰島移植（islet transplant）是一種β 細(xì)胞替代療法，主要用于治療反復(fù)發(fā)作低血糖的1 型糖尿病，可以安全、有效的維持患者血糖平衡，防治糖尿病相關(guān)的嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，是一種能夠恢復(fù)生理血糖控制且微創(chuàng)的治療方法。血糖控制是糖尿病相關(guān)慢性并發(fā)癥的關(guān)鍵因素。成功的胰島移植是使受者實(shí)現(xiàn)糖代謝正常，脫離外源性胰島素，使糖化血紅蛋白水平（haemoglobin A1c，HbA1c）恢復(fù)正常，減輕糖尿病誘導(dǎo)的器官衰竭以及降低因使用外源性胰島素導(dǎo)致嚴(yán)重低血糖事件危及生命的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而改善受者生活質(zhì)量。近年來，國內(nèi)外胰島移植治療糖尿病取得長足進(jìn)步[1，2]，其中埃德蒙頓方案將來自多個(gè)捐獻(xiàn)者的高質(zhì)量胰島與無糖皮質(zhì)激素的免疫抑制劑治療相結(jié)合，取得了較好的臨床療效，成為臨床胰島移植里程碑[3]。據(jù)報(bào)道[4]，40%～50%的患者在胰島移植后5 年仍然無需注射胰島素。人類胰腺中胰島數(shù)目在30 萬～150 萬。在目前的臨床制備技術(shù)下，一個(gè)胰腺內(nèi)只有30%～50%的胰島被分離出來，因此提高胰腺分離是非常有必要的。盡管胰島移植在臨床結(jié)果方面取得了進(jìn)展，但獲得足夠量移植胰島、提高移植療效仍然是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的過程。其中，胰島制備是提高臨床胰島移植長期療效的關(guān)鍵。本文從供體篩選、胰島分離過程、移植前培養(yǎng)等方面闡述影響胰島制備的因素，以期為臨床提高胰島分離產(chǎn)量提供參考。

1 供體體征對(duì)胰島產(chǎn)量的影響

在胰島移植過程中，大約30%的治療費(fèi)用與胰島制備有關(guān)[5]，表明有效利用胰島資源至關(guān)重要。胰島移植發(fā)展的20 多年來，優(yōu)化供體選擇以增加胰島的產(chǎn)量和質(zhì)量，以更少的供體胰腺獲得更多的胰島一直是臨床的難點(diǎn)及重點(diǎn)。國內(nèi)外許多研究均探討過供體因素與胰島產(chǎn)量之間的相關(guān)性[6，7]，其中體重、身高和身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）是與胰島產(chǎn)量和質(zhì)量相關(guān)性較高的供體特征[8-11]。Pilla SJ等[10]對(duì)芝加哥伊利諾伊大學(xué)芝加哥分校單中心的276 例胰島分離研究中發(fā)現(xiàn)，供體BMI 與胰腺大小、實(shí)際胰島數(shù)（actual islet count，AIC）、胰島當(dāng)量（islet equivalent，IEQ）呈正相關(guān)，而冷缺血時(shí)間（cold ischemia time，CIT）與AIC、IEq/g 呈負(fù)相關(guān)，但BMI和CIT 與胰島大小分布沒有相關(guān)性。另有研究發(fā)現(xiàn)[6]，供體年齡并不影響胰島產(chǎn)量，但＜45 歲或更年輕供體患者的胰島移植功能參數(shù)均顯著升高。Briones RM等[12]研究報(bào)道，男性供者分離獲得足夠胰島供移植的概率明顯更高。此外，Denise E 等[13]研究報(bào)道，腦死亡供者與心臟死亡供者相比，腦死亡供者的胰島產(chǎn)量較低，提示供者死亡原因?qū)σ葝u制備的結(jié)果同樣具有一定的影響。

基于不同因素對(duì)獲取胰島的影響，2005 年Gorman等首次提出了胰島供體評(píng)分（Islet Donor Score，IDS）系統(tǒng)，并成功地將其用于胰島制備的最佳胰島/供體選擇中[8，14]。該評(píng)分系統(tǒng)涉及詳細(xì)的捐獻(xiàn)者資料，包括年齡、體重、身高、BMI、體表面積、胰腺重量、死亡原因（大腦或心臟)、住院時(shí)間、是否使用升壓藥、血糖控制和冷缺血時(shí)間等[15]。基于多變量分析，該方法確定了最重要的供體因子，并進(jìn)行了相應(yīng)的加權(quán)。IDS 系統(tǒng)的使用有助于以更客觀的方式評(píng)估復(fù)雜的供體信息，是標(biāo)準(zhǔn)化胰島供體分離的第一個(gè)重要部分。IDS 作為評(píng)分系統(tǒng)在埃德蒙頓開發(fā)，并在其他中心進(jìn)行驗(yàn)證[8]，目前已成為許多中心選擇供體和預(yù)測胰島分離結(jié)果的重要工具。2016 年，北美11 家研究中心通過分析1056 例胰島制備的供體特征，進(jìn)行胰島供體評(píng)分，獲得了成功胰島分離的預(yù)測變量，并建立了北美胰島評(píng)分系統(tǒng)（North American Islet Donor Score，NAIDS）[15，16]。NAIDS 評(píng)分系統(tǒng)提示通過預(yù)估供體評(píng)分，可以提高胰島制備成功率，該評(píng)分系統(tǒng)作為一種有用的供體胰腺評(píng)估工具，可以優(yōu)化供體選擇。因此，在移植術(shù)前對(duì)供體進(jìn)行詳細(xì)評(píng)估，并制定相應(yīng)的方案，可以提高獲取胰島的質(zhì)量和數(shù)量。

2 胰島分離過程對(duì)胰島產(chǎn)量的影響

優(yōu)化胰島分離過程是提高胰島產(chǎn)量和質(zhì)量的有效方法。成功的人胰島分離對(duì)臨床及基礎(chǔ)研究應(yīng)用至關(guān)重要，其在很大程度上受胰腺消化酶選擇的影響，因此不斷開發(fā)和使用高質(zhì)量的酶是胰島分離的關(guān)鍵因素。由于每個(gè)供體胰島的細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分存在個(gè)體差異性，以致于胰島分離的組織解離酶（即膠原酶和蛋白酶）的功效受影響，這也是胰島分離難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的原因之一。近年來膠原酶的改進(jìn)經(jīng)過了精煉和純化的過程，內(nèi)毒素污染的減少和批次間差異的縮小是膠原酶改進(jìn)的重要進(jìn)步之一[17]。然而，單獨(dú)使用純化的膠原酶而不補(bǔ)充酶混合物，會(huì)導(dǎo)致胰腺消化不足。這些額外加入的蛋白酶對(duì)胰島從胰腺實(shí)質(zhì)中適當(dāng)釋放尤為重要，其可與膠原酶協(xié)同產(chǎn)生有效的胰腺消化，顯著提高胰島產(chǎn)量和質(zhì)量。中性蛋白酶（neutral protease，NP）可進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)中所有主要成分的降解，在酶降解中起著重要的作用，且其與熱溶菌素（heat resistant lysol，TL）已廣泛應(yīng)用于臨床胰島分離。此外，來自多黏菌Paneibacillus polymyxa 的BP 蛋白酶（BPP）及來自C.histolyticum 的梭狀芽孢桿菌的clostripain也已成功用于人類胰島的分離。另有研究表明[18]，溶解液中鈣離子的加入可促進(jìn)胰腺消化，使胰島從胰腺腺泡組織中分離和釋放出來。但需要注意的是，消化過程中需要避免過度接觸蛋白酶，防止胰島分解破碎，降低胰島產(chǎn)量[19，20]。將胰島從胰腺腺泡組織釋放出來取決于對(duì)膠原酶和NP 的最佳濃度的利用，然而批次間的差異、制造方法的差異以及缺乏共同的酶活性分析方法導(dǎo)致無法準(zhǔn)確評(píng)估不同種類酶的療效。

盡管許多改進(jìn)胰島細(xì)胞分離消化階段的方法可以提高胰島回收率，但它仍然很難預(yù)測胰島純化后的結(jié)果。在大多數(shù)情況下，胰島在純化過程中丟失，導(dǎo)致獲得純化胰島量下降，因此優(yōu)化胰島純化過程同樣至關(guān)重要。胰島純化最常用的方法是使用COBE 2991 細(xì)胞處理器的密度梯度離心法，該方法可以從胰腺外分泌組織中分離出不同純度的胰島[21]。聚蔗糖（Ficoll）溶液是胰島純化最常用的溶液，約1.077 g/ml Ficoll 通常用于低密度溶液，約1.100 g/ml Ficoll 用于高密度溶液。密度梯度離心在胰島純化回收方面的各種改進(jìn)源于梯度介質(zhì)、純化過程中的冷卻系統(tǒng)、純化前胰腺消化液的保存的發(fā)展。Noguchi H 等[22]通過改變碘二醇與純化液的體積比，控制密度梯度純化后胰島產(chǎn)量和純化后回收率均顯著高于標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)梯度法。Robertson GS 等[23]研究表明，UW 溶液可以有效降低外分泌組織水腫，提高胰島純化率。與此同時(shí)，Masayuki S 等[24]設(shè)計(jì)的大瓶離心法，其在不使用COBE 2991 細(xì)胞處理器的情況下，用2 個(gè)500 ml 塑料容器制造密度梯度離心體系，純化所得高純度胰島較傳統(tǒng)COBE 組產(chǎn)量高。另外，由于供體胰腺個(gè)體差異，并非所有胰島均能被純化獲取，當(dāng)純化袋中仍能發(fā)現(xiàn)大量未純化的胰島時(shí)，Zorzi D 等[25]通過重新收集、離心、洗滌、Ficoll 重懸等再次純化的方法對(duì)低純度胰島進(jìn)行“補(bǔ)救”，可提高總胰島產(chǎn)量和胰腺利用率，且胰島功能評(píng)估結(jié)果與COBE 法純化所得胰島無明顯差異。此外，密度梯度離心法在胰島純化回收方面的各種改進(jìn)還包括純化過程中的冷卻系統(tǒng)、純化前胰腺消化液的保存等，然而這些改進(jìn)還沒有實(shí)現(xiàn)普遍一致性，因而尚未推廣應(yīng)用。Mettler E 等[26]使用磁性分離胰島，該方法雖然可以分離豬胰島，且具有臨床應(yīng)用潛力，但該項(xiàng)技術(shù)如何轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用至今尚未明確。

3 胰島培養(yǎng)對(duì)胰島移植結(jié)果的影響

對(duì)于新鮮分離胰島和培養(yǎng)后胰島的效果尚存在爭論。有研究表明[27]，新鮮分離的胰島比培養(yǎng)至少24 h 的胰島更好，其較培養(yǎng)第1、2、3 天的胰島數(shù)分別下降13%、24%、35%。Noguchi H 等[28]研究表明，在移植到糖尿病裸鼠中，與培養(yǎng)胰島相比，新鮮胰島的降糖能力明顯提高。由于培養(yǎng)過程或培養(yǎng)中的外分泌組織污染，使培養(yǎng)胰島可引起炎癥介質(zhì)的過度表達(dá)[29]。此外，在培養(yǎng)過程中，胰島只能通過擴(kuò)散獲得氧氣，大胰島核心更容易缺氧，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激和凋亡誘導(dǎo)的基因上調(diào)[30]。研究表明[31，32]，培養(yǎng)后胰島直徑比新鮮胰島直徑要小，這表明培養(yǎng)過程中胰島產(chǎn)量降低的主要原因是胰島直徑的減小。因此，在培養(yǎng)過程中，瀕死的腺泡細(xì)胞釋放的有害酶可能對(duì)胰島細(xì)胞的生存有害。也有研究認(rèn)為[33]，延長培養(yǎng)時(shí)間可以讓胰島從分離過程的壓力中恢復(fù)過來，但仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。同時(shí)，胰島培養(yǎng)可以為臨床胰島移植提供諸多好處，包括胰島進(jìn)行后續(xù)質(zhì)量控制檢測、等待距離較遠(yuǎn)患者到移植中心接受治療、確定患者并進(jìn)行免疫誘導(dǎo)等。目前，國際胰島移植聯(lián)盟（CIT）仍將移植前培養(yǎng)作為臨床移植的標(biāo)準(zhǔn)程序。

研究表明[34]，在培養(yǎng)的24 h 內(nèi)15%～20%的胰島消失。較長的冷缺血時(shí)間、較低的胰島純度、大胰島比例高均增加了胰島丟失的風(fēng)險(xiǎn)。既往有研究[35，36]比較了22 ℃～26 ℃和37 ℃環(huán)境培養(yǎng)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與37 ℃培養(yǎng)相比，22 ℃～26 ℃培養(yǎng)可以增加豬的胰島存活和DNA 復(fù)蘇，且在22 ℃～26 ℃的培養(yǎng)環(huán)境中可以預(yù)防胰島中央壞死。以上研究表明，22 ℃～26 ℃培養(yǎng)的胰島可能優(yōu)于37 ℃培養(yǎng)。

培養(yǎng)過程中胰島質(zhì)量和數(shù)量減少的機(jī)制之一是細(xì)胞凋亡[37]。研究表明[38]，經(jīng)過消化和純化后的胰島缺乏周圍基底膜，這種缺失導(dǎo)致固縮核和凋亡小體的增加，并伴隨著促凋亡的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）亞型p38和c-Jun 氨基端激酶（c-jin N-terminal kinase，JNK）活性升高。此外，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等細(xì)胞因子的刺激也可導(dǎo)致胰島分離后的JNK 和p38 活性升高[39]。有報(bào)道稱[40]，抑制p38 的激活可以降低這些促凋亡活性。以上研究提示，在胰島培養(yǎng)的過程中，應(yīng)用抑制JNK 和p38激活的抗凋亡藥物可有效防止胰島質(zhì)量和數(shù)量的下降。

4 總結(jié)

胰島移植具有移植手術(shù)簡單、創(chuàng)傷小、治療效果好等優(yōu)勢，已成為一種治療1 型糖尿病的有效方法。胰島移植成功與否取決于輸注胰島的質(zhì)量和數(shù)量。盡管到目前為止人類胰島分離和純化方法已經(jīng)較之前有重大進(jìn)展，但由于供體胰腺本身存在個(gè)體差異，從單個(gè)胰腺中獲取足夠移植數(shù)量的胰島仍然困難。目前的研究仍需致力于通過細(xì)化供體篩選、優(yōu)化胰島制備過程及移植前培養(yǎng)方面的提高獲取更高質(zhì)量和數(shù)量的胰島，使其在受體內(nèi)長期維持調(diào)控血糖的功能，從而保證胰島移植長期療效，為廣大糖尿病患者帶來福音，對(duì)推動(dòng)糖尿病研究進(jìn)展具有十分重要的意義。