循環(huán)腫瘤DNA 在食管癌診治中的應用

郭玉玉，余 宋，翟笑楓

（解放軍海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院中醫(yī)腫瘤科，上海 200083）

食管癌（esophageal cancer）是世界上最常見和致命的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率分別排名第7 位和第6 位。該疾病病理類型主要分為鱗癌和腺癌，不同病理類型的食管癌流行病學分布明顯不同，在歐洲以及北美地區(qū)，食管腺癌發(fā)病率偏高；在東亞、非洲東部以及南歐以食管鱗癌為主。我國食管癌以食管鱗癌為主，發(fā)病率居世界前5 名[1]。目前普遍認為影響食管癌患者預后的因素主要分為腫瘤的分期分級、復發(fā)轉(zhuǎn)移以及對患者治療后的反應。CT 等影像學方法在腫瘤患者管理中具有較多局限性，存在輻射暴露的風險、不能頻繁檢測、假陽性較高等問題，一般治療較長的一段時間后才能進行有效評價，且只能評估可測量的病變等[2]。雖然CEA、CA199、NSE 等腫瘤標志物，能夠無創(chuàng)、安全、頻繁、實時進行檢測，但其特異性和靈敏度欠佳，且其含量的變化無法反饋腫瘤反應或進展[3]。近年臨床提出了液體活檢的概念，最初主要指循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）的分析，現(xiàn)在擴展到分析腫瘤在體液（主要是血液）中釋放的腫瘤成分，包括無細胞循環(huán)核酸（DNA、mRNA、非編碼RNA）等[4，5]，已廣泛應用于多種腫瘤的診斷及預后。本文將從食管癌的早期診斷、臨床分期及預后等方面對循環(huán)腫瘤DNA 的研究進展作簡要概述。

1 ctDNA 概述

游離DNA（cell free DNA，cfDNA）是存在于體液中的細胞外DNA，來源于正常細胞和凋亡、壞死的腫瘤細胞，而循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是其中的一部分，既攜帶腫瘤細胞的基本遺傳信息，又攜帶基因突變后的信息，包含點突變、重排、擴增甚至基因拷貝數(shù)變異[6]，尿液、腦脊液、胸液、腹水和唾液中均可檢測到ctDNA 的存在，其來源于壞死的腫瘤細胞、凋亡的腫瘤細胞、腫瘤細胞分泌的外泌體[7]。在性質(zhì)上，ctDNA 通常長度為160～180 bp，在血液中含量極低，約占所有cfDNA的0.01%～1%，其含量與腫瘤的類型、腫瘤負荷、疾病進展程度有關[8]。由于ctDNA 來源于腫瘤細胞，并且半衰期短，可以實時動態(tài)監(jiān)測腫瘤的演變過程。

1948 年Mandel 和Metais 首次報道了外周血中存在cfDNA，目前cfDNA 已成為許多醫(yī)學學科的熱門研究領域[9]。通過測量ctDNA 等位基因突變片段可以獲得定量信息，用于腫瘤診斷并反映腫瘤負荷情況。李紅[10]研究表明，轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者外周血ctDNA 水平與腫瘤臨床特征、患者疾病健康史無統(tǒng)計學關聯(lián)，首程化療前后血漿中ctDNA 水平對患者短期療效轉(zhuǎn)歸具有良好的預測價值；對轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者ErbB 信號通路乳腺癌相關基因進行定性和定量研究對判斷轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者預后提供重要依據(jù)。Chae YK 等[11]回顧性分析了136 例非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者血液中的ctDNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較高濃度的ctDNA 與較短的PFS 和總生存期（overall survival，OS）有關。

2 ctDNA 在食管癌患者中的應用

2.1 用于食管癌的早期診斷與臨床分期 腫瘤早期發(fā)現(xiàn)是減少腫瘤相關死亡的關鍵環(huán)節(jié)之一。早期食管癌沒有特異性臨床癥狀，確診時多處于中晚期。但ctDNA 的異常在腫瘤發(fā)生的早期則可檢測到?；驕y序研究顯示[12]，食管鱗癌的基因突變已在多個基因中得到驗證，包括TP53、CDKN2A、FAT1、NOTCH1、PIK3CA、KMT2D 和NFE2L2。Talukdar FR等[13]對比分析了227 例食管鱗癌患者的正常組織、單純增生的組織、上皮內(nèi)瘤變，并對組織樣本進行了全基因組、外顯子組或靶向序列分析，結(jié)果得出食管上皮內(nèi)瘤變和ESCC 組織具有相似的突變和拷貝數(shù)變化，頻率相似。啟動子高甲基化是一種腫瘤特異的表觀遺傳異常，發(fā)生速度高于突變，針對DNA 甲基化的ctDNA 檢測技術也適用于早期癌癥檢測和篩查[14]。Li X 等[4]研究提示，腫瘤組織中epb41l3、gpx3 和col14a1 的甲基化頻率高于正常周圍組織，并且epb41l3、gpx3 和col14a1 基因的甲基化僅在食管鱗癌患者的血漿中發(fā)現(xiàn)。5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）是DNA 主動去甲基化的中間產(chǎn)物，是一種新的腫瘤表觀遺傳學標志物。研究表明[15]，5hmC 用于診斷食管癌的敏感度為93.75%，特異度為85.71%，可作為食管癌微創(chuàng)診斷的生物標志物。來自我國的一項研究采集了臺州1156 份健康人群血漿樣本進行癌癥篩查，對樣本血液中ctDNA 甲基化測序，并進行回顧性分析，共有575 名最初健康的研究參與者在4年內(nèi)被診斷出患有結(jié)直腸癌、食道癌、肝癌、肺癌或胃癌，總體敏感性為95%，其中食管癌敏感度為91%，表明ctDNA 檢測比傳統(tǒng)方法可以更早的預測癌癥的發(fā)生[16]。

此外，微衛(wèi)星改變也可以從食管鱗癌患者的血清標本中發(fā)現(xiàn)。Eisenberger CF 等[17]檢測了食管癌患者的腫瘤及血清中微衛(wèi)星情況，并以健康個體作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)92.9%的食管鱗癌患者原發(fā)腫瘤中有1 個或多個微衛(wèi)星DNA 改變，96.4%的患者血清中至少有1 個微衛(wèi)星DNA 變化，而健康人對照者血清DNA 中均未發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星改變，提示血清微衛(wèi)星DNA 分析也是檢測食管鱗癌的一個具有潛在臨床應用價值的指標。有文獻報道[18-20]，根據(jù)檢測到的CTCs 和ctDNA 作為食管癌的臨床分期依據(jù)，與經(jīng)典的腫瘤TNM 分期之間存在著明顯的相關性，因此建議將CTCs 和ctDNA 的檢測作為臨床腫瘤分期的重要組成部分，但是其可行性仍需要進一步評估。

2.2 用于食管癌的早期治療 食管癌僅需接受單純的手術或者放療，而中晚期食管癌的標準治療方案為同步放、化療或者免疫治療。研究表明[21]，食管腺癌患者ctDNA 數(shù)量和突變頻率均隨腫瘤分期增加而增加，并可在臨床或影像學發(fā)現(xiàn)腫瘤進展前檢測到ctDNA 水平變化。因此，對于臨床分期為早期但伴有ctDNA 數(shù)量或頻率增加的患者，給予更積極的治療或可改善這部分患者的預后。晚期轉(zhuǎn)移性食管癌患者通常會接受全身藥物治療。有研究顯示[22]，上消化道腫瘤患者的不同轉(zhuǎn)移病灶和原發(fā)腫瘤間的MET 基因擴增具有顯著的異質(zhì)性。單病灶活檢的分子譜不足以指導靶向治療藥物的選擇。ctDNA 來源于全身腫瘤，能克服腫瘤區(qū)域異質(zhì)性問題，較全面地反映腫瘤基因全貌。Petty RD 等[23]設計了一項多中心前瞻性雙盲實驗，發(fā)現(xiàn)吉非替尼治療的EGFR 擴增食管癌患者與安慰劑組相比，其總體生存率顯著提高，但在EGFR 陰性食管癌患者中，吉非替尼組與安慰劑組相比總體生存率并沒有顯著差異。相關研究證實[24]，血漿ctDNA 中EGFR 的突變狀態(tài)與相應的腫瘤組織相一致，提示可以使用血漿ctDNA 替代組織來評估EGFR 突變狀態(tài)，篩選出適合接受吉非替尼治療的患者。值得注意的是，食管鱗癌和食管腺癌在發(fā)病機制上顯著不同，也具有明顯不一樣的分子特征。食管鱗癌表現(xiàn)出頻繁的CCND1、NOTCH1、SOX2 和/或TP63 的基因組擴增，而ERBB2、VEGF、AKRAS、GATA4 和GATA6 基因改變則在食管腺癌中更為常見[25，26]，因此應慎重對待文獻中關于食管癌藥物治療的相關結(jié)論。

2.3 用于食管癌的預后評估 早期發(fā)現(xiàn)對于復發(fā)后早期干預和延長患者生存至關重要。在進行根治性手術或者放化療后，有相當一部分患者存在隱匿性微轉(zhuǎn)移或微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD），而治療后MRD 持續(xù)存在成為腫瘤遠處轉(zhuǎn)移復發(fā)的潛在來源[27]。ctDNA 具有監(jiān)測隱匿性腫瘤和追蹤腫瘤特異性突變的潛在能力，適合于MRD 的評估。目前，基于ctDNA 檢測的液體活檢技術已經(jīng)廣泛應用于血液系統(tǒng)疾病MRD 的監(jiān)測。在食管癌等實體腫瘤中，ctDNA 濃度低，MRD 監(jiān)測仍然具有挑戰(zhàn)性。Luo H 等[28]通過對ESCC 組織、癌旁組織和正常組織以及手術前和手術后的血漿進行測序，分析了ctDNA 在ESCC 中的特異性和作用，結(jié)果證明利用ctDNA 檢測ESCC 和監(jiān)測治療效果具有可行性。Azad T 等[8]通過對食管癌患者放化療前后及健康對照組血液的DNA 進行腫瘤個性化深度測序（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq），發(fā)現(xiàn)放化療后ctDNA 的檢出率與腫瘤進展、遠處轉(zhuǎn)移和較短的生存期有關，提示ctDNA可反映食管癌相關的基因信息，并與其發(fā)生、發(fā)展密切相關，有望成為反映食管癌治療效果及預后的生物標志物。在過去的幾年里，腫瘤特異性生物標志物的檢測技術取得了很大的進展，DDPCR、下一代測序（NGS）等實時、高度靈敏的液體活檢技術的出現(xiàn)使得識別MRD 以及對罕見基因突變、基因甲基化序列的監(jiān)測成為可能[29]。通過對接受根治性手術以及放化療癌癥患者，對比治療前后ctDNA 水平的含量，能夠有效地判斷體內(nèi)是否還存在著影像學或病理檢查無法確認的微小殘留灶，從而能夠有效地指導后續(xù)抗復發(fā)治療方案。研究顯示[30]，術后ctDNA的濃度與患者生存率呈正相關。通過對腫瘤患者進行連續(xù)ctDNA 檢測可以反映癌癥進展和治療耐藥性的發(fā)生。

3 總結(jié)

液體活檢已成為近年來的研究熱點。ctDNA 是血液中來自腫瘤的游離DNA。由于ctDNA 來源于腫瘤細胞，并且半衰期短，可以實時動態(tài)監(jiān)測腫瘤的演變過程。但ctDNA 在食管癌的臨床應用仍存在諸多挑戰(zhàn)，如ctDNA 檢測的標準化、敏感性仍有欠缺，尤其對ctDNA 水平較低者，同一血液樣本采用不同測序方法的檢測結(jié)果也存在差異?？傊?，液態(tài)活檢技術作為腫瘤診斷的新技術，除了可以獲取腫瘤相關分子信息，還可以低創(chuàng)動態(tài)地對疾病進行早期診斷，幫助臨床醫(yī)師及時調(diào)整治療方案，并進一步研究疾病的發(fā)生發(fā)展機制，且有助于靶向藥物的研發(fā)。