高遷移率族蛋白B1在結(jié)直腸癌中的機(jī)制研究

趙威威，原娜，陳安祺，張賢雨，盧秀榮，張志林

(1.河北北方學(xué)院研究生學(xué)院，河北 張家口 075000； 2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院放射治療科，河北 張家口 075000)

隨著人們生活水平及生活質(zhì)量的提高，結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)已成為危害我國人民生命健康的主要惡性腫瘤之一，由于CRC患者早期癥狀不明顯,就診時有一半以上的患者已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。近年對CRC發(fā)病機(jī)制的深入研究證實，高遷移率族蛋白(high mobility group，HMG)B1與CRC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。CRC組織中HMGB1的表達(dá)明顯升高，而HMGB1表達(dá)直接參與CRC的浸潤和遷移過程，且HMGB1表達(dá)水平越高，CRC分期越晚。HMGB1是HMG家族的最重要成員，在細(xì)胞核內(nèi)具有高度保守性，主要參與DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和基因組穩(wěn)定，在細(xì)胞核外表觀遺傳后具有促進(jìn)炎癥、免疫、細(xì)胞增殖、自噬、凋亡和轉(zhuǎn)移的作用[2]。體外研究表明，結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中受翻譯調(diào)節(jié)的腫瘤蛋白過表達(dá)可導(dǎo)致HMGB1從細(xì)胞核釋放到細(xì)胞質(zhì)并進(jìn)入細(xì)胞外空間，通過結(jié)合Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)/晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end product，RAGE)而激活核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)通路，進(jìn)而促進(jìn)LoVo細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；同時體內(nèi)實驗證實，受翻譯調(diào)節(jié)的腫瘤蛋白在裸鼠內(nèi)過表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤組織中HMGB1的表達(dá)，并激活NF-κB信號通路中的關(guān)鍵蛋白[3]。另外，腫瘤細(xì)胞釋放的HMGB1也可通過結(jié)合TLR4激活NF-κB信號通路促使白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6和腫瘤壞死因子-α分泌，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[4]。早期研究發(fā)現(xiàn)，CRC分泌的HMGB1可誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞凋亡，從而抑制宿主的抗癌免疫系統(tǒng)，且臨床研究證實，HMGB1水平與巨噬細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)[5]。另有文獻(xiàn)報道，HMGB1向胞外釋放增加可抑制放療的抗腫瘤作用[6]。現(xiàn)就HMGB1在CRC發(fā)生發(fā)展中的研究進(jìn)展予以綜述，以期為CRC的臨床診療提供理論依據(jù)。

1 HMGB1概述

HMGB1是一種位于細(xì)胞核內(nèi)的多功能非組蛋白，包含兩個結(jié)合位點(N端A和中央B)以及一個酸性C端尾巴，這種結(jié)構(gòu)對穩(wěn)定染色體、維持端粒酶和修復(fù)DNA功能起關(guān)鍵作用[1]。HMGB1是一種損傷相關(guān)分子模式分子，在細(xì)胞損傷、感染和炎癥過程中，其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)，最終分泌到細(xì)胞外[7]。在細(xì)胞外，HMGB1以3種互斥的氧化還原狀態(tài)存在，分別為全硫醇HMGB1(完全還原)、二硫鍵HMGB1(半氧化)、末端氧化的HMBG1。全硫醇HMGB1具有促使免疫細(xì)胞向炎癥部位浸潤的作用；二硫鍵HMGB1具有誘導(dǎo)細(xì)胞因子活化的作用，觸發(fā)各種細(xì)胞因子從鄰近細(xì)胞釋放，參與炎癥反應(yīng)的全過程；而末端氧化的HMGB1可抑制炎癥反應(yīng)[8]。因此，HMGB1可能因其不同氧化還原狀態(tài)在不同疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮不同的作用。HMGB1的主要受體是TLR和RAGE，兩種受體的信號通路不同，但發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時，兩者最終均可促使NF-κB磷酸化，并可被蛋白酶降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖、炎癥，甚至誘發(fā)腫瘤和促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因的激活[2]。

2 HMGB1促進(jìn)CRC發(fā)生、發(fā)展

2.1HMGB1促進(jìn)CRC的基因改變 CRC的發(fā)生發(fā)展是多步驟的涉及多基因改變的復(fù)雜過程。腫瘤抑制基因腺瘤性結(jié)腸息肉病(adenomatous polyposiscoli，APC)基因突變被認(rèn)為是CRC中常見的早期突變[9]。APC基因是Wnt信號的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，在調(diào)節(jié)腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在APC基因功能喪失后，一方面，腸上皮細(xì)胞內(nèi)Wnt信號激活，導(dǎo)致HMGB1的主動分泌，且血清HMGB1水平顯著提高，誘導(dǎo)CRC細(xì)胞增殖、遷移；另一方面，HMGB1信號可能通過RAGE釋放并促進(jìn)炎癥激活，進(jìn)而對正常腸道穩(wěn)態(tài)和干細(xì)胞進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，導(dǎo)致CRC的發(fā)生發(fā)展。在中和抗HMGB1抗體后，APC基因喪失相關(guān)“缺氧”區(qū)域的程度明顯降低，隨之CRC的療效有所提高。

Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因是一種原癌基因，在CRC的發(fā)展和治療中起重要作用，其中30%～45%的Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因的12或13位密碼子表達(dá)發(fā)生突變；Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因主要激活Raf-促分裂原活化的蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致促分裂原活化的蛋白激酶底物磷酸化和致癌轉(zhuǎn)錄因子激活，從而驅(qū)動癌細(xì)胞的增殖、侵襲和化學(xué)耐藥性[10]。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1-RAGE可能以Yes相關(guān)蛋白依賴的方式觸發(fā)Wnt/β聯(lián)蛋白信號，通過上調(diào)結(jié)腸癌HCT-116和SW480細(xì)胞中CD44和Sox2的表達(dá)促進(jìn)CRC進(jìn)展，而應(yīng)用HMGB1抗體后，結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖明顯受到抑制[11]，故可通過HMGB1探索CRC基因改變的機(jī)制。

2.2HMGB1促進(jìn)CRC的增殖和轉(zhuǎn)移 CRC浸潤和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡的主要原因。HMGB1在促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移中起重要作用。有研究表明，沉默HMGB1表達(dá)可顯著抑制CRC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[12]。一方面，可能與JAK/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3通路的激活有關(guān)；另一方面，可能與RAGE信號通路相關(guān)的蛋白質(zhì)產(chǎn)生及其磷酸化有關(guān)。當(dāng)裂解的胱天蛋白酶3和增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)增加時，HMGB1的表達(dá)也相應(yīng)增加[13]。另外，HMGB1合成的反義寡脫氧核苷酸也減少了胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2、Rac1和蛋白激酶B的磷酸化以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、NF-κB p65和基質(zhì)金屬蛋白酶9的產(chǎn)生。因此，HMGB1-RAGE軸可作為抗CRC治療的靶標(biāo)[14]。綜上，HMGB1可能通過多種途徑促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖和遷移，同時上述途徑也可增強(qiáng)HMGB1的作用，可能是抑制CRC轉(zhuǎn)移的一種方法。

2.3HMGB1誘導(dǎo)CRC的自噬 自噬是一種自我消化機(jī)制，可通過消除溶酶體降解受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚集體來促進(jìn)細(xì)胞存活。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)自噬，且自噬也可能誘導(dǎo)HMGB1的分泌[15]。HMGB1通過誘導(dǎo)CRC自噬并促進(jìn)其細(xì)胞存活，即微管相關(guān)蛋白1輕鏈3和Beclin1，促進(jìn)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2的磷酸化，進(jìn)而抑制CRC細(xì)胞的凋亡。一方面，可能與促分裂原活化的蛋白激酶激酶/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活導(dǎo)致的化學(xué)性耐藥有關(guān)；另一方面，可能與c-Jun氨基端激酶通路的激活，從而促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬，抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)[16]。此外，氧化氫和超氧化物歧化酶1介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中HMGB1的表達(dá)，并促進(jìn)其在細(xì)胞外釋放。在氧化應(yīng)激條件下，HMGB1是存在氧化應(yīng)激的自噬傳感器，可反饋地抑制HMGB1釋放，進(jìn)而減少人和小鼠細(xì)胞系中自溶酶體和自噬通量的數(shù)量[17]。腸上皮 HMGB1可直接參與抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3的活化、保護(hù)腸道免受細(xì)菌感染和其他物質(zhì)的損傷。當(dāng)沙門菌感染腸上皮細(xì)胞缺乏HMGB1時，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3重新分布，自噬減少[18]。有證據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境中CRC自噬的增加可加速腫瘤的侵襲，且結(jié)腸癌Lewis細(xì)胞自分泌的HMGB1與RAGE結(jié)合可激活ERK1/2信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬，并抑制其發(fā)生細(xì)胞凋亡[15]。由此可見，HMGB1導(dǎo)致的自噬可通過限制腫瘤細(xì)胞的壞死和炎癥反應(yīng)增加CRC細(xì)胞的損傷，進(jìn)而發(fā)揮促瘤作用[16]。自噬是導(dǎo)致實體瘤轉(zhuǎn)移和生長的潛在危險因素，故調(diào)控自噬中HMGB1的作用可能成為治療CRC的新方法。

2.4HMGB1促進(jìn)CRC的能量代謝 正常細(xì)胞主要以糖酵解和氧化代謝方式供應(yīng)能量，而癌細(xì)胞主要以無氧糖酵解方式滿足能量需求，這可能通過微管相關(guān)蛋白1輕鏈3、Beclin1的激活以及其他細(xì)胞的自噬實現(xiàn)[17]。在無氧糖酵解過程中，腫瘤細(xì)胞可促進(jìn)肌肉細(xì)胞中 HMGB1的表達(dá)，其通過識別肌肉細(xì)胞RAGE介導(dǎo)丙酮酸激酶的失活，不利于肌肉細(xì)胞的能量代謝。另外，由于缺乏糖酵解產(chǎn)生的乙酰輔酶A，HMGB1增加了肌肉細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺的攝取，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞分泌的HMGB1可將谷氨酰胺整合到乙酰輔酶A中，并誘導(dǎo)肌肉細(xì)胞將谷氨酰胺轉(zhuǎn)移至癌細(xì)胞[19]，表明HMGB1可通過谷氨酰胺途徑為腫瘤細(xì)胞提供能量，這可能是抑制腫瘤細(xì)胞進(jìn)展的策略之一。

3 HMGB1參與CRC的侵襲和轉(zhuǎn)移

3.1HMGB1誘導(dǎo)CRC的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT) EMT在腫瘤進(jìn)展早期階段的腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中起著不可或缺的作用[20]。一方面，HMGB1可能通過RAGE依賴性激活來誘導(dǎo)EMT，參與CRC細(xì)胞的遷移。HMGB1與RAGE的相互作用可導(dǎo)致各種蛋白質(zhì)(Snail蛋白、NF-κB和基質(zhì)金屬蛋白酶7)上調(diào)，而這些蛋白質(zhì)是EMT啟動的開關(guān)[21]。在腫瘤微環(huán)境中，癌細(xì)胞能夠誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)的活化，活化的成纖維細(xì)胞可分泌生長因子和各種基質(zhì)金屬蛋白酶[22]，進(jìn)而影響細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的“交流”，最終促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移[23]。另一方面，CRC細(xì)胞釋放的HMGB1可通過激活TLR4誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化，與HMGB1觸發(fā)磷脂酰肌醇-3-激酶和促分裂原活化的蛋白激酶通路的激活有關(guān)[24]。因此，進(jìn)一步評估HMGB1結(jié)合RAGE和TLR4的方式及其影響因素有助于更好地認(rèn)識HMGB1在CRC侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。

3.2HMGB1促進(jìn)CRC的血管生成 HMGB1的高表達(dá)參與腫瘤的血管生成，而血管形成可為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)支持[25]。HMGB1可以激活促血管生成信號，促進(jìn)CRC的血管形成，也可通過自分泌和旁分泌的反饋機(jī)制上調(diào)其受體RAGE和TLR4的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移[26]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，與正常結(jié)腸內(nèi)皮細(xì)胞相比，CRC患者結(jié)腸內(nèi)皮細(xì)胞HMGB1水平明顯升高，其原因可能為：①HMGB1通過激活NF-κB誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中各種促血管生成基因的表達(dá)，包括整合素、基質(zhì)金屬蛋白酶、E選擇素和促炎性白細(xì)胞黏附分子(如血管細(xì)胞黏附分子1和細(xì)胞間黏附分子1)，其中E選擇素可促進(jìn)ERK1/2和p38的磷酸化，進(jìn)而介導(dǎo)CRC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，同時磷酸化的ERK1/2和p38可進(jìn)一步增強(qiáng)HMGB1的分泌[27]。②HMGB1可釋放血管內(nèi)皮生長因子A，并上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子受體1和2、神經(jīng)纖毛蛋白1的表達(dá)，誘導(dǎo)CRC的血管生成[26]。③HMGB1也可刺激血小板衍生生長因子的表達(dá)，后者參與新生血管的生長和發(fā)育[28]。此外，HMGB1還可促進(jìn)CRC淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的形成。CRC患者HMGB1的高表達(dá)不僅與血管內(nèi)皮生長因子C有關(guān)，還與淋巴微血管密度顯著相關(guān)，其機(jī)制可能是HMGB1通過激活NF-κB上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子C，從而影響淋巴管的浸潤[29]。體內(nèi)外實驗證實，HMGB1中和抗體可顯著抑制CRC新生血管的形成，RAGE抑制劑也可抑制HMGB1誘導(dǎo)的促血管生成[26]。因此，可通過靶向HMGB1抑制腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的血管生成，進(jìn)而抑制CRC血管生成。

4 HMGB1與CRC的免疫反應(yīng)

HMGB1具有抑制宿主免疫系統(tǒng)的作用，在協(xié)調(diào)免疫和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1參與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞的形成[6]，并通過與RAGE和TLR4相互作用激活多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致各種促炎介質(zhì)的產(chǎn)生以及固有免疫反應(yīng)的激活。HMGB1通過激活RAGE/TLR4增強(qiáng)磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路的傳導(dǎo)，從而破壞調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的穩(wěn)定性[30]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞作為防止免疫系統(tǒng)攻擊自體器官的免疫耐受細(xì)胞，可抑制CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的活化及增殖，并釋放IL-10抑制性細(xì)胞因子，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長[31]。此外，HMGB1通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生IL-10來抑制CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤作用，導(dǎo)致CRC的局部浸潤和擴(kuò)展[32]。另外，CRC細(xì)胞中的HMGB1具有通過結(jié)合TLR4誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α的能力。HMGB1可通過激活RAGE誘導(dǎo) NF-κB活化，從而提高癌細(xì)胞的存活率[33]。免疫系統(tǒng)可感知腫瘤并募集和激活腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞，從而抑制腫瘤生長，CD8+T細(xì)胞作為腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答，是抗腫瘤免疫的主要作用因子[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1通過抑制樹突狀細(xì)胞將腫瘤抗原呈遞給T細(xì)胞，從而導(dǎo)致腫瘤逃逸，這不僅與樹突狀細(xì)胞的c-Jun氨基端激酶磷酸化顯著減少有關(guān)，還與胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9 的增多有關(guān)[34]。另外，HMGB1可通過調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的活化和自噬促進(jìn)多形核髓系抑制細(xì)胞產(chǎn)生，髓源性抑制細(xì)胞不僅可誘導(dǎo)腫瘤血管生成，還可重塑腫瘤微環(huán)境[35]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤分泌的HMGB1以劑量依賴的方式誘導(dǎo)庫普弗細(xì)胞凋亡[36]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，CRC中浸潤的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞高表達(dá)與腫瘤低復(fù)發(fā)率和良好預(yù)后有關(guān)[37]。故認(rèn)為，HMGB1可通過抑制或減弱先天性和適應(yīng)性宿主免疫抑制癌細(xì)胞進(jìn)展。

然而，HMGB1也具有增強(qiáng)免疫反應(yīng)的作用，其可能與免疫球蛋白的增強(qiáng)有關(guān)。實驗研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1具有誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞激活和成熟的能力，通過識別樹突狀細(xì)胞實現(xiàn)抗原呈遞，進(jìn)而促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞的分化和增殖，增強(qiáng)抗瘤作用[38]。HMGB1通過誘導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞脫顆粒增強(qiáng)免疫反應(yīng)[39]。自然殺傷細(xì)胞分泌的HMGB1通過引發(fā)代謝性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)CRC細(xì)胞死亡，這與其抑制焦磷酸丙酮酸激酶作用有關(guān)[40]，不利于腫瘤細(xì)胞的能量代謝。

CRC細(xì)胞表達(dá)的HMGB1具有趨化白細(xì)胞的作用。經(jīng)HMGB1處理的小鼠巨噬細(xì)胞可激活B細(xì)胞的NF-κB，進(jìn)而誘導(dǎo)IL-6、IL-12、CC趨化因子配體5、CC趨化因子配體19、CC趨化因子配體20、粒細(xì)胞集落刺激因子和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的聚集，參與腫瘤的進(jìn)展[41]。HMGB1在調(diào)控腫瘤的免疫反應(yīng)中具有雙重作用，對其進(jìn)行深入研究有助于抑制其促癌特性，并保持其抗癌特性。

5 小 結(jié)

HMGB1主要通過RAGE/TLR直接作用于腫瘤細(xì)胞，加速基因突變，影響代謝及自噬，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤、遷移；或通過間接促進(jìn)腫瘤的EMT、血管形成及腫瘤免疫微環(huán)境影響CRC的發(fā)生發(fā)展，上述機(jī)制涉及多種信號通路的激活或失活以及促炎因子的釋放和固有免疫細(xì)胞的抑制，甚至誘發(fā)抑制性免疫細(xì)胞并導(dǎo)致腫瘤逃逸。將基于HMGB1中和抗體的實驗研究以及人源化抗HMGB1單克隆抗體用于CRC發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究和實踐，可能是治療CRC的一種可行方法。